מימון: עבודה זו נתמכה על ידי מפקדת סטיוארט &amp; ויקטוריה אחוות קוואן Predoctoral (RMW), פרס NIH פיוניר (RAS)

כללי הבחינה הבריאות טיפול מקיף יותר של בדיקות בריאות כללית ניתן למצוא משאב phenotyping התנהגות מעולה ז&#39;קלין של קרולי, מה לא בסדר עם העכבר שלי? 1. אנחנו הראשונים להשתמש בסוללה שונה במבחן תצפיתי להעריך את הבריאות הכללית של הנושא. הסוללה כוללת פריטים מתוך פרוטוקול הערכה מקיפה של סמואל ארווין 2 כדי לזהות במהירות בנושאים אלה יהיה מתאים בדיקות נוספות. בקיצור, מזהה את הסוללה שונה חיות כי הם חריגים מבחינה פיזית (למשל קשות מתחת או מעל משקל, המוזנח, כבד נשימה) או תנוחה חריגה התערוכה, תנועה או התנהגויות. כל אלה יכולים להיות ביטויים של מחלה. כל הערכה הראשונית דומה מזהה נושאים בריא מתאים. חשוב גם לציין כי בעלי החיים משמשים אנושי הן במהלך הבחינה בריאות כללית, כמו גם במהלך בדיקות עוקבות. ללא הרדמה או שיכוך כאבים משמש בדיקות אלה אינם כוללים הליכים כואבים בפוטנציה. בדיקת רגישות חוש הריח בדיקה זו נועדה לזהות הבדל ברגישות חוש הריח בין שתי קבוצות של עכברים (סוג למשל פראי קבוצת מוטנטים בעלי חיים). בבדיקה זו, דילולים מרובים של ריח נעשים. בעלי חיים תמימים אז חוקר דילול אחת של ריח זה הזמן גישוש הכולל (תוך 3 דקות) נרשם. דילולים מרובים הריח נוסו על, בנושאים שונים נאיבי והזמן גישוש בסך הכל משמש להפקת בתגובה מנה עקומות עבור כל קבוצה של עכברים. שני חוקרים צריכים להיות מעורבים בדיקות, עם עיוור אחד גנוטיפים נושא ו / או תנאי. חוקר ראשי <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> השג ארבעה כלובים נקיים (8 גובה X 10 W x 18 L, באינצ&#39;ים), ללא כל מצע. הקו עד ארבעה כלובים בממשלה biosafety. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הגדרת מחיצות בין הזירה כל שימוש בנייר מסנן אטום. מניחים הבריסטול השחור על פני החלוקה הסופית כך את הקווים השחורים בצד את הצד התחתון של הכלוב. מכסים את החלק העליון של הזירה עם חתיכת ברורה של פרספקס כדי לאפשר האור כדי להאיר את הזירה. (א) <img src="/files/ftp_upload/old/949_2009_1_14_8/figure1new.png" alt="איור 1" /> (ב) <img src="/files/ftp_upload/old/949_2009_1_14_9/image15.png" alt="איור 1.5" /> באיור 1. ארנה Set-up. (א) עטוף כהלכה, בזירה ריקה (ב) ארנה בנייר מסנן הנושא ריחניים. </li> <li style=";text-align:right;direction:rtl"> בגין הרגלה הנושאים. הנח את הנושא הראשון בכלוב הראשון הרגלה. לאחר 15 דקות, להעביר את הנושא הראשון לכלוב השני. לנקות את הכלוב הראשון עם שחפת Quatricide. בשלב הבא, המקום הנושא השני בכלוב, תחילה לנקות. המשך בתהליך זה בנושאים הבאים. בסופו של דבר, כל נושא צריך להיות מורגל בכל שלושת הכלובים לפני שיוצבו בזירה (כלוב הרביעי והאחרון) לעוד 15 דקות של התרגלות לפני הבדיקה. </li></ol> העיוור חוקר <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הפוך את המספר המתאים של 2 אינץ&#39; על 2 אינץ&#39; ריבועים של נייר סינון עבור דגימות ריח. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> באמצעות ריח שנבחרו מראש, בהתאם לדלל אותו. לקבלת דוגמיות הידרופובי כגון חמאת בוטנים, להשתמש בשמן כמו ממס; עבור כל האחרים, יש להשתמש במים מזוקקים. וורטקס. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הגדרת מכשיר הקלטת וידאו דיגיטלי בקצה המרוחק של הממשלה biosafety כזה בסוף כלוב כולו בפוקוס. קח וידאו ראשונית על מנת להבטיח פרמטרים נאותים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הקלט את הסדר שבו דילולים ייבדקו, מקפיד באופן אקראי את סדר המשפטים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> נושא שיא של פסולת מספרי זיהוי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר הנושא כבר מורגל במשך 15 דקות בזירה, להתחיל לקראת במשפט הראשון. פיפטה דילול הראשונים במעלה ובמורד בצינור חרוטי לפני pipetting אותו על ריבוע נייר הסינון. משטח נייר לסנן בצורה אופטימלית צריך להיות מכוסה ~ 85% (כ 0.50-MLS של פתרון). השתמש kimwipe כדי לוודא נייר הסינון אינו רווי יתר על המידה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בגין הקלטת וידאו. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מניחים את ריבוע נייר לסנן בכלוב בצד הנגדי של המיקום הנוכחי של בעל החיים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בגין תזמון. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר 3 דקות, לעצור את ההקלטה ולהסיר את ריח מדולל. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אם רק אחד ריח (למשל קינמון) הוא להיבדק, להסיר את הנושא המבחן הראשון מהזירה. חזור על שלבים 6-11 עבור כל חיה, כראוי דילול ריח לכל נושא. אם אחד או יותר של הריח הוא להיבדק, אך לא להסיר את נושא הבדיקה מהזירה. במקום זאת, העיתוי להתחיל. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כמתבקש לדלל את הניחוח הבא בשיטות כמו המפורטות לעיל. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אחרי דקה 1, להתחיל בהקלטת וידאו. מניחים את ריבוע נייר פילטר עם דילול של ניחוח הבא בכלוב בצד השני של positio הנוכחי של החיההערה </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חזור על שלבים 6-13 עבור כל ריח, וציין את מספר קובץ הווידאו עבור כל ניסוי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חזור על שלבים 6-14 עבור כל נושא. <img src="/files/ftp_upload/old/949_2009_1_14_10/image2new.png" alt="איור 2" /> איור 2. תוצאות נציג לישיבה של בדיקות רגישות חוש הריח. העכבר כל מקבוצת או שליטה (קבוצה א) או קבוצת הניסוי (קבוצה B) נחשף אחד מחמשת דילולים שונים של תמצית קינמון על נייר לסנן לגבי מושב אחד, שלוש, דקה. סה&quot;כ זמן לחקור את נייר הסינון הוערכה. העכברים בקבוצה A יש רגישות חוש הריח יותר מאשר אלו בקבוצת B. </li></ol> העדפות בדיקת חוש הריח בדיקה זו נועדה לזהות ליקויים זיהוי ספציפי, כלומר את היכולת לחוש ריחות אטרקטיביים או מרתיעה. ההליך הבא לווה בנדיבות מן הפרוטוקול של Kobayakawa, K., et al.3. שוב, שני חוקרים צריכים להיות מעורבים בדיקות, עם עיוור אחד גנוטיפים נושא ו / או מצבו. השעה גישוש בסך הכל נרשם שוב (עם הצגת וידאו) עבור ריחות שונים. ריחות אלה עם פעמים גישוש הכולל יותר מים המיועדים כמו &quot;אטרקטיבי&quot;, בעוד אלה עם פעמים פחות מים מכונים &quot;מרתיעה&quot;. החוקר אז ישקול אם ריחות אותו הם &quot;מושכים&quot; או &quot;מרתיעה&quot; עבור נבדקים שונים. אנא עקוב אחר צעדים 1-3 בסעיף בדיקת רגישות חוש הריח של החוקר הראשי. העיוור חוקר הנוהל לבדיקת העדפה הריח הוא זהה, עם שינויים קלים של שלבים 2 ו 4. אנא עקוב אחר הצעדים 1-15 בסעיף בדיקת רגישות חוש הריח של חוקר העיוור, עם השינויים הבאים: בשלב 2, באמצעות ניחוחות שנבחרו מראש (שילוב של שני ריחות אטרקטיביים מרתיעה), להפוך את פתרונות מדולל כראוי של כל אחד צינורות חרוטי. לקבלת דוגמיות הידרופובי כגון חמאת בוטנים, להשתמש בשמן כמו ממס; עבור כל האחרים, יש להשתמש במים מזוקקים. וורטקס. עבור לשלב 4, במקום להקליט את דילול להיבדק, להקליט את הסדר של ריחות מגוונים כי תיבחן, באופן אקראי, את הסדר של המשפטים. בדיקה זו נועדה לזהות ליקויים זיהוי ספציפי, כלומר את היכולת לחוש ריחות אטרקטיביים או מרתיעה. ההליך הבא לווה בנדיבות מן הפרוטוקול של Kobayakawa, K. et al. 3. שוב, שני חוקרים צריכים להיות מעורבים בדיקות, עם עיוור אחד גנוטיפים נושא ו / או מצבו. השעה גישוש בסך הכל נרשם שוב (עם הצגת וידאו) עבור ריחות שונים. ריחות אלה עם פעמים גישוש הכולל יותר מים המיועדים כמו &quot;אטרקטיבי&quot;, בעוד אלה עם פעמים פחות מים מכונים &quot;מרתיעה&quot;. החוקר אז ישקול אם ריחות אותו הם &quot;מושכים&quot; או &quot;מרתיעה&quot; עבור נבדקים שונים. אנא עקוב אחר צעדים 1-3 בסעיף בדיקת רגישות חוש הריח של החוקר הראשי. העיוור חוקר הנוהל לבדיקת העדפה הריח הוא זהה, עם שינויים קלים של 2 שלבים, 4 ו 13. אנא עקוב אחר הצעדים 1-15 בסעיף בדיקת רגישות חוש הריח של חוקר העיוור, עם השינויים הבאים: בשלב 2, באמצעות ניחוחות שנבחרו מראש (שילוב של שני ריחות אטרקטיביים מרתיעה), להפוך את פתרונות מדולל כראוי של כל אחד צינורות חרוטי. לקבלת דוגמיות הידרופובי כגון חמאת בוטנים, להשתמש בשמן כמו ממס; עבור כל האחרים, יש להשתמש במים מזוקקים. וורטקס. עבור לשלב 4, במקום להקליט את דילול להיבדק, להקליט את הסדר של ריחות מגוונים כי תיבחן, באופן אקראי, את הסדר במשפט אחד. עבור השלב 13, במקום מרובע נייר פילטר עם ניחוח הבא בכלוב בצד הנגדי של המיקום הנוכחי של בעל החיים. <img src="/files/ftp_upload/old/949_2009_1_14_11/image3new.png" alt="איור 3" /> איור 3. תוצאות נציג לישיבה של בדיקות העדפה חוש הריח. העכבר כל נחשף לכל אחד ריחות שונים על נייר לסנן לגבי מושב אחד, שלוש, דקה. סה&quot;כ זמן לחקור את נייר הסינון הוערכה. חמאת בוטנים ווניל הם ריחות אטרקטיביים (ניחוח זמן גישוש&gt; מים בזמן גישוש) ו 2-Methylbutyric חומצה היא מרתיעה (ניחוח זמן גישוש &lt;מים בזמן גישוש). ניקוד של בדיקות חוש הריח לאחר רכישת כל רגישות חוש הריח וסרטי וידאו העדפה, יש צורך לנתח את סה&quot;כ זמן לחקור כל דילול / ריח. האם החוקר עיוור לנתח את כל קטעי וידאו על עקביות. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תצוגה מקדימה של vidאיו, וציין את הדברים הבאים: א) כאשר נייר הסינון ממוקם בזירה, ב) כאשר העכבר מתקרב נייר פילטר, ג) כאשר העכבר חוקר את נייר לסנן ד) כאשר שלוש דקות חלפו (מ כאשר המסנן הנייר הונח בזירה). לדעת מתי להתמקד בהתנהגות של העכבר מקלה במדויק הציון סה&quot;כ זמן לחקור לאחר בדיקתה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> סקירת וידאו. הערה הזמן כאשר העכבר הראשון חוקר את נייר הסינון (latency). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שימוש זמן, סטופר חקירות כל תוך שלוש דקות של הצבת נייר לסנן בזירה. השעה החקירה מוגדרת עת כאשר nares של העכבר הם &lt;1 מ&quot;מ מהעיתון הסינון. חשוב שלא לכלול כל הזמן כאשר סמן העכבר נמצא בסמיכות נייר הסינון, אך אינו פעיל חוקרת אותו. אין לכלול התקפי ללקק וללעוס את הנייר או התקפי יושב על הנייר בזמן גישוש מוחלט. זה הכרחי כדי לדבוק מקרוב בעקביות כללים אלה במדויק לנתח התנהגות חוש הריח. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> השהיית זמן שיא, את סך כל הזמן בילה בחקירת נייר לסנן קובץ וידאו מספר. </li></ol>

<ol>
	<li>Crawley, J. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=What&amp;rsquo;s+Wrong+with+my+Mouse?+Behavioral+Phenotyping+of+Transgenic+and+Knockout+Mice.">What&amp;rsquo;s Wrong with my Mouse? Behavioral Phenotyping of Transgenic and Knockout Mice.</a> , 42-60 (2007).</li><li>Irwin, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comprehensive+observational+assessment:+Ia.+A+systematic,+quantitative+procedure+for+assessing+the+behavioral+and+physiologic+state+of+the+mouse.">Comprehensive observational assessment: Ia. A systematic, quantitative procedure for assessing the behavioral and physiologic state of the mouse.</a> Psychopharmacologia. 13, 222-257 (1968).</li><li>Kobayakawa, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Innate+versus+learned+odour+processing+in+the+mouse+olfactory+bulb.">Innate versus learned odour processing in the mouse olfactory bulb.</a> Nature. 450, 503-508 (2007).</li></ol>

הבדיקות הנ&quot;ל מאפשרים הערכה מהירה ואמינה של תפקוד בסיסי חוש הריח. זה לא יהיה להתעלם, עם זאת, כי אמינות זה מחייב את הבחירה הכנה נאותה של נושאים לבדיקה. בעלי חיים חולה או נכה אחרת הם לעתים קרובות הנבדקים מבחן עקבית. כמו כן, הרגלה של נבדקים היא המפתח. מצאנו כי השימוש בכלוב...

<!DOCTYPE html PUBLIC "-//W3C//DTD XHTML 1.0 Transitional//EN" "http://www.w3.org/TR/xhtml1/DTD/xhtml1-transitional.dtd">
<html xmlns="http://www.w3.org/1999/xhtml" xml:lang="en" lang="en">	
		
		<div>
		<table border="1">
		<thead>
		<tr>
		<th>Material Name</th>
		<th>Type</th>
		<th>Company</th>
		<th>Catalogue Number</th>
		<th>Comment</th>
		</tr>
		</thead>
		<tbody>
		
<tr>
<td>2-Methylbutyric acid</td>
<td>Reagent</td>
<td>Sigma-Aldrich</td>
<td>W269506</td>
<td>Concentrations Used:9.16 x 10-1 &#x2013; 10-8 M 
(in H20)</td>
</tr>
<tr>
<td>Pure Vanilla Extract</td>
<td>Reagent</td>
<td>McCormick & Co</td>
<td>n/a</td>
<td>Concentrations Used:10-1 &#x2013; 10-5 dilution 
(in H20)</td>
</tr>
<tr>
<td>Peanut Butter (Skippy, Extra Crunchy)</td>
<td>Reagent</td>
<td>Unilever</td>
<td>n/a</td>
<td>Concentrations Used:10% (w/v), in mineral oil</td>
</tr>
<tr>
<td>Cinnamon Extract</td>
<td>Reagent</td>
<td>McCormick & Co</td>
<td>n/a</td>
<td>Concentrations Used:10-1 &#x2013; 10-5 dilution 
(in H20)</td>
</tr>
<tr>
<td>Mineral Oil, light</td>
<td>Reagent</td>
<td>Fisher Scientific</td>
<td>O121-1</td>
<td>Concentrations Used:N/A</td>
</tr>		</tbody>
		</table>
		</div>

olfactory behavioral testing in the adult mouse

מערכת ההרחה היא מכרסם של הגדלת עניין למדענים, למד, בין השאר, בביולוגיה מערכות בגלל המעגלים סטריאוטיפית, נגיש עדיין שלה. בנוסף, יכולת ייחודית זו של האזור כדי לייצר נוירונים חדשים לאורך כל החיים של אורגניזם עושה את זה מערכת אטרקטיבי עבור ביולוגים התפתחותיים משובי כאחד. אינטרס כזה מחייב אמצעי להערכה מהירה, אך אמין של תפקוד חוש הריח. בדיקות רבות יכולת ההרחה הם מורכבים, משתנים או לא תוכנן במיוחד עבור עכברים. כמו כן, כמה בדיקות רגישים גירעונות זיכרון, כמו גם ליקויים ביכולות ההרחה, התוצאות שהושגו מבלבלים. כאן אנו מתארים סוללה פשוטה של ​​בדיקות שנועדו לזהות פגמים רגישות חוש הריח העדפה ו. ראשית, ההערכה הראשונית בריאות כללית מאפשרת זיהוי של בעלי חיים מתאים בדיקות נוספות. שנית, עכברים נחשפים דילולים שונים של ריחות על מנת לבדוק אם יש הבדל הסף. שלישית, עכברים מוצגים עם ריחות שונים, הן אטרקטיביות מרתיעה, אשר מאפשרים הערכה של העדפת חוש הריח. מחקרים אלה פשוט צריך לעשות את האפיון הראשוני של התנהגות הריח נגיש עבור מעבדות של משאבים מגוונים ומומחיות.

Watch this Scientific Journal Video about Olfactory Behavioral Testing in the Adult Mouse at JoVE.com

Olfactory Behavioral Testing in the Adult Mouse

יסוד, המאפיינים הייחודיים של המערכת עדיין מכרסם הריח הובילו מחקר הגוברת בקרב ביולוגים. הערכה פשוטה יחסית של תפקידה הוא צריך גם אז. כאן אנו מתארים בדיקות רגישות לאפיון של רגישות העכבר העדפה הריח ו.

בדיקה התנהגותית חוש הריח של העכבר למבוגרים

The rodent olfactory system is of increasing interest to scientists, studied, in part, in systems biology because of its stereotyped, yet accessible ...

olfactory-behavioral-testing-in-the-adult-mouse

Research

JoVE Journal

Biology

19.3K Views.  Dana Farber Cancer Institute. יסוד, המאפיינים הייחודיים של המערכת עדיין מכרסם הריח הובילו מחקר הגוברת בקרב ביולוגים. הערכה פשוטה יחסית של תפקידה הוא צריך גם אז. כאן אנו מתארים בדיקות רגישות לאפיון של רגישות העכבר העדפה הריח ו.

Video: Olfactory Behavioral Testing in the Adult Mouse

High-Resolution Video Tracking of Locomotion in Adult Drosophila Melanogaster

Flies provide an important model for studying complex behavior due to the plethora of genetic tools available to researchers in this field. Studying locomotor behavior in Drosophila melanogaster relies on the ability to be able to quantify changes in motion during or in response to a given task. For this reason, a high-resolution video tracking system, such as the one we describe in this paper, is a valuable tool for measuring locomotion in real-time. Our protocol involves the use of an initial air pulse to break the flies momentum, followed by a thirty second filming period in a square chamber. A tracking program is then used to calculate the instantaneous speed of each fly within the chamber in 10 msec increments. Analysis software then compiles this data, and outputs a variety of parameters such as average speed, max speed, time spent in motion, acceleration, etc. This protocol will discuss proper feeding and management of flies for behavioral tasks, handling flies without anesthetization or immobilization, setting up a controlled environment, and running the assay from start to finish.

The study of complex locomotor behavior in Drosophila melanogaster is dependent upon the ability to quantify changes in a given fly's movement. This article demonstrates how to do this using a high-resolution tracking system.

וידאו ברזולוציה גבוהה של מעקב אחר תנועה של מבוגרים תסיסנית melanogaster

Flies provide an important model for studying complex behavior due to the plethora of genetic tools available to researchers in this field.  Studying ...

In vivo Ca2+- Imaging of Mushroom Body Neurons During Olfactory Learning in the Honey Bee

The in vivo and semi-in vivo preparation for Calcium imaging has been developed in our lab by Joerges, K&uuml;ttner and Galizia over ten years ago, to measure odor evoked activity in the antennal lobe1. From then on, it has been continuously refined and applied to different neuropiles in the bee brain. Here, we describe the preparation currently used in the lab to measure activity in mushroom body neurons using a dextran coupled calcium-sensitive dye (Fura-2). We retrogradely stain mushroom body neurons by injecting dye into their axons or soma region. We focus on reducing the invasiveness, to achieve a preparation in which it is still possible to train the bee using PER conditioning. We are able to monitor and quantify the behavioral response by recording electro-myograms from the muscle which controls the PER (M17)2.
After the physiological experiment the imaged structures are investigated in greater detail using confocal scanning microscopy to address the identity of the neurons.

In vivo Ca2+- Imaging of Mushroom Body Neurons During Olfactory Learning in the Honey Bee

Bees can be conditioned in an appetitive olfactory learning paradigm (PER-conditioning). Using odors as stimuli, we established a method in which behavior is recorded while simultaneously Calcium Imaging is used to measure odor evoked activity in mushroom body neurons in vivo.

בשנת vivo Ca 2 + - הדמיה של נוירונים גוף אינפקטד במהלך הלמידה חוש הריח של דבורת הדבש

The in vivo and semi-in vivo preparation for Calcium imaging has been developed in our lab by Joerges, K&uuml;ttner and Galizia over ten years ago, to ...

In vivo Imaging and Therapeutic Treatments in an Orthotopic Mouse Model of Ovarian Cancer

Human cancer and response to therapy is better represented in orthotopic animal models. This paper describes the development of an orthotopic mouse model of ovarian cancer, treatment of cancer via oral delivery of drugs, and monitoring of tumor cell behavior in response to drug treatment in real time using in vivo imaging system. In this orthotopic model, ovarian tumor cells expressing luciferase are applied topically by injecting them directly into the mouse bursa where each ovary is enclosed. Upon injection of D-luciferin, a substrate of firefly luciferase, luciferase-expressing cells generate bioluminescence signals. This signal is detected by the in vivo imaging system and allows for a non-invasive means of monitoring tumor growth, distribution, and regression in individual animals. Drug administration via oral gavage allows for a maximum dosing volume of 10 mL/kg body weight to be delivered directly to the stomach and closely resembles delivery of drugs in clinical treatments. Therefore, techniques described here, development of an orthotopic mouse model of ovarian cancer, oral delivery of drugs, and in vivo imaging, are useful for better understanding of human ovarian cancer and treatment and will improve targeting this disease.

In vivo Imaging and Therapeutic Treatments in an Orthotopic Mouse Model of Ovarian Cancer

Orthotopic animal models of ovarian cancer replicate better human disease and therefore enhance our understanding of cancer progression and tumor response to therapy. A mouse model receives an intrabursal injection of luciferase-expressing ovarian tumor cells. Treatment is administered via oral gavage. Tumor growth is monitored by in vivo imaging system.

בשנת vivo ההדמיה לטיפולים במודל עכבר orthotopic של סרטן השחלות

Human cancer and response to therapy is better represented in orthotopic animal models.  This paper describes the development of an orthotopic mouse model ...

Intraperitoneal Injection into Adult Zebrafish

A convenient method for chemically treating zebrafish is to introduce the reagent into the tank water, where it will be taken up by the fish. However, this method makes it difficult to know how much reagent is absorbed or taken up per fish. Some experimental questions, particularly those related to metabolic studies, may be better addressed by delivering a defined quantity to each fish, based on weight. Here we present a method for intraperitoneal (IP) injection into adult zebrafish. Injection is into the abdominal cavity, posterior to the pelvic girdle. This procedure is adapted from veterinary methods used for larger fish. It is safe, as we have observed zero mortality. Additionally, we have seen bleeding at the injection site in only 5 out of 127 injections, and in each of those cases the bleeding was brief, lasting several seconds, and the quantity of blood lost was small. Success with this procedure requires gentle handling of the fish through several steps including fasting, weighing, anesthetizing, injection, and recovery. Precautions are required to minimize stress throughout the procedure. Our precautions include using a small injection volume and a 35G needle. We use Cortland salt solution as the vehicle, which is osmotically balanced for freshwater fish. Aeration of the gills is maintained during the injection procedure by first bringing the fish into a surgical plane of anesthesia, which allows slow operculum movements, and second, by holding the fish in a trough within a water-saturated sponge during the injection itself. We demonstrate the utility of IP injection by injecting glucose and monitoring the rise in blood glucose level and its subsequent return to normal. As stress is known to increase blood glucose in teleost fish, we compare blood glucose levels in vehicle-injected and non-injected adults and show that the procedure does not cause a significant rise in blood glucose.

We demonstrate intraperitoneal injection into adult zebrafish. We use a 10 &mu;l NanoFil microsyringe controlled by a Micro4 controller and UltraMicroPump III. This demonstration includes the use of cold water as an anesthetic.

הזרקה לתוך intraperitoneal דג הזברה למבוגרים

A convenient method for chemically treating zebrafish is to introduce the reagent into the tank water, where it will be taken up by the fish. However, ...

Generation of Mice Derived from Induced Pluripotent Stem Cells

The production of induced pluripotent stem cells (iPSCs) from somatic cells provides a means to create valuable tools for basic research and may also produce a source of patient-matched cells for regenerative therapies. iPSCs may be generated using multiple protocols and derived from multiple cell sources. Once generated, iPSCs are tested using a variety of assays including immunostaining for pluripotency markers, generation of three germ layers in embryoid bodies and teratomas, comparisons of gene expression with embryonic stem cells (ESCs) and production of chimeric mice with or without germline contribution2. Importantly, iPSC lines that pass these tests still vary in their capacity to produce different differentiated cell types2. This has made it difficult to establish which iPSC derivation protocols, donor cell sources or selection methods are most useful for different applications.
The most stringent test of whether a stem cell line has sufficient developmental potential to generate all tissues required for survival of an organism (termed full pluripotency) is tetraploid embryo complementation (TEC)3-5. Technically, TEC involves electrofusion of two-cell embryos to generate tetraploid (4n) one-cell embryos that can be cultured in vitro to the blastocyst stage6. Diploid (2n) pluripotent stem cells (e.g. ESCs or iPSCs) are then injected into the blastocoel cavity of the tetraploid blastocyst and transferred to a recipient female for gestation (see Figure 1). The tetraploid component of the complemented embryo contributes almost exclusively to the extraembryonic tissues (placenta, yolk sac), whereas the diploid cells constitute the embryo proper, resulting in a fetus derived entirely from the injected stem cell line.
Recently, we reported the derivation of iPSC lines that reproducibly generate adult mice via TEC1. These iPSC lines give rise to viable pups with efficiencies of 5-13%, which is comparable to ESCs3,4,7 and higher than that reported for most other iPSC lines8-12. These reports show that direct reprogramming can produce fully pluripotent iPSCs that match ESCs in their developmental potential and efficiency of generating pups in TEC tests. At present, it is not clear what distinguishes between fully pluripotent iPSCs and less potent lines13-15. Nor is it clear which reprogramming methods will produce these lines with the highest efficiency. Here we describe one method that produces fully pluripotent iPSCs and "all- iPSC" mice, which may be helpful for investigators wishing to compare the pluripotency of iPSC lines or establish the equivalence of different reprogramming methods.

Generating induced pluripotent stem cell (iPSC) lines produces lines of differing developmental potential even when they pass standard tests for pluripotency. Here we describe a protocol to produce mice derived entirely from iPSCs, which defines the iPSC lines as possessing full pluripotency1.

דור של עכברים שמקורם בתאי גזע pluripotent מושרים

The production of induced pluripotent stem cells (iPSCs) from somatic cells provides a means to create valuable tools for basic research and may also ...

Gavaging Adult Zebrafish

The zebrafish has become an important in vivo model in biomedical research. Effective methods must be developed and utilized to deliver compounds or agents in solutions for scientific research. Current methods for administering compounds orally to adult zebrafish are inaccurate due to variability in voluntary consumption by the fish. A gavage procedure was developed to deliver precise quantities of infectious agents to zebrafish for study in biomedical research. Adult zebrafish over 6 months of age were anesthetized with 150 mg/L of buffered MS-222 and gavaged with 5 &mu;l of solution using flexible catheter implantation tubing attached to a cut 22-G needle tip. The flexible tubing was lowered into the oral cavity of the zebrafish until the tip of the tubing extended past the gills (approximately 1 cm). The solution was then injected slowly into the intestinal tract. This method was effective 88% of the time, with fish recovering uneventfully. This procedure is also efficient as one person can gavage 20-30 fish in one hour. This method can be used to precisely administer agents for infectious diseases studies, or studies of other compounds in adult zebrafish.

The increasing use of zebrafish as an animal model requires the development of effective methods for the delivery of known quantities of compounds and solutions. The gavage procedure described below allows for the oral delivery of precise volumes of solution reliably, safely and efficiently to adult zebrafish.

Gavaging דג הזברה למבוגר

The zebrafish has become an important in vivo model in biomedical research. Effective methods must be developed and utilized to deliver compounds or ...

Isolation and Culture of Dental Epithelial Stem Cells from the Adult Mouse Incisor

Understanding the cellular and molecular mechanisms that underlie tooth regeneration and renewal has become a topic of great interest1-4, and the mouse incisor provides a model for these processes. This remarkable organ grows continuously throughout the animal&#39;s life and generates all the necessary cell types from active pools of adult stem cells housed in the labial (toward the lip) and lingual (toward the tongue) cervical loop (CL) regions. Only the dental stem cells from the labial CL give rise to ameloblasts that generate enamel, the outer covering of teeth, on the labial surface. This asymmetric enamel formation allows abrasion at the incisor tip, and progenitors and stem cells in the proximal incisor ensure that the dental tissues are constantly replenished. The ability to isolate and grow these progenitor or stem cells in vitro allows their expansion and opens doors to numerous experiments not achievable in vivo, such as high throughput testing of potential stem cell regulatory factors. Here, we describe and demonstrate a reliable and consistent method to culture cells from the labial CL of the mouse incisor.

The continuously growing mouse incisor provides a model for studying renewal of dental tissues from dental epithelial stem cells (DESCs). A robust system for consistently and reliably obtaining these cells from the incisor and expanding them in vitro is reported here.

בידוד והתרבות של תאי גזע השיניים אפיתל ממבוגרי העכבר הארקטיק

Understanding the cellular and molecular mechanisms that underlie tooth regeneration and renewal has become a topic of great interest1-4, and the mouse ...

The Mouse Isolated Perfused Kidney Technique

The mouse isolated perfused kidney (MIPK) is a technique for keeping a mouse kidney under ex vivo conditions perfused and functional for 1 hr. This is a prerequisite for studying the physiology of the isolated organ and for many innovative applications that may be possible in the future, including perfusion decellularization for kidney bioengineering or the administration of anti-rejection or genome-editing drugs in high doses to prime the kidney for transplantation. During the time of the perfusion, the kidney can be manipulated, renal function can be assessed, and various pharmaceuticals administered. After the procedure, the kidney can be transplanted or processed for molecular biology, biochemical analysis, or microscopy.
This paper describes the perfusate and the surgical technique needed for the ex vivo perfusion of mouse kidneys. Details of the perfusion apparatus are given and data are presented showing the viability of the kidney&#39;s preparation: renal blood flow, vascular resistance, and urine data as functional, transmission electron micrographs of different nephron segments as morphological readouts, and western blots of transport proteins of different nephron segments as molecular readout.

The mouse isolated perfused kidney (MIPK) is a technique for keeping a mouse kidney under ex vivo conditions perfused and functional for 1 hr. The buffers and surgical technique are described in detail.

טכניקת כלית עכבר המבודדת perfused

The mouse isolated perfused kidney (MIPK) is a technique for keeping a mouse kidney under ex vivo conditions perfused and functional for 1 hr. This is a ...

Trans-inner Cell Mass Injection of Embryonic Stem Cells Leads to Higher Chimerism Rates

In an effort to increase efficiency in the creation of genetically modified mice via ES Cell methodologies, we present an adaptation to the current blastocyst injection protocol. Here we report that a simple rotation of the embryo, and injection through Trans-Inner cell mass (TICM) increased the percentage of chimeric mice from 31% to 50%, with no additional equipment or further specialized training. 26 different inbred clones, and 35 total clones were injected over a period of 9 months. There was no significant difference in either pregnancy rate or recovery rate of embryos between traditional injection techniques and TICM. Therefore, without any major alteration in the injection process and a simple positioning of the blastocyst and injecting through the ICM, releasing the ES cells into the blastocoel cavity can potentially improve the quantity of chimeric production and subsequent germline transmission.

Here we present a protocol to increase chimera production without the use of new equipment. A simple orientation change of the embryo for injection can increase the number of embryos produced, and potentially reduce the timeline to germline transmission.

תא הטרנס-הפנימית המוני הזרקה של תאי גזע עובריים מוביל שיעור גבוה יותר של Chimerism

In an effort to increase efficiency in the creation of genetically modified mice via ES Cell methodologies, we present an adaptation to the current ...

Isolation of Enteric Glial Cells from the Submucosa and Lamina Propria of the Adult Mouse

The enteric nervous system (ENS) consists of neurons and enteric glial cells (EGCs) that reside within the smooth muscle wall, submucosa and lamina propria. EGCs play important roles in gut homeostasis through the release of various trophic factors and contribute to the integrity of the epithelial barrier. Most studies of primary enteric glial cultures use cells isolated from the myenteric plexus after enzymatic dissociation. Here, a non-enzymatic method to isolate and culture EGCs from the intestinal submucosa and lamina propria is described. After manual removal of the longitudinal muscle layer, EGCs were liberated from the lamina propria and submucosa using sequential HEPES-buffered EDTA incubations followed by incubation in commercially available non-enzymatic cell recovery solution. The EDTA incubations were sufficient to strip most of the epithelial mucosa from the lamina propria, allowing the cell recovery solution to liberate the submucosal EGCs. Any residual lamina propria and smooth muscle was discarded along with the myenteric glia. EGCs were easily identified by their ability to express glial fibrillary acidic protein (GFAP). Only about 50% of the cell suspension contained GFAP+ cells after completing tissue incubations and prior to plating on the poly-D-lysine/laminin substrate. However, after 3 days of culturing the cells in glial cell-derived neurotrophic factor (GDNF)-containing culture media, the cell population adhering to the substrate-coated plates comprised of &#62;95% enteric glia. We created a hybrid mouse line by breeding a hGFAP-Cre mouse to the ROSA-tdTomato reporter line to track the percentage of GFAP+ cells using endogenous cell fluorescence. Thus, non-myenteric enteric glia can be isolated by non-enzymatic methods and cultured for at least 5 days.

Here, we describe the isolation of enteric-glial cells from the intestinal-submucosa using sequential EDTA incubations to chelate divalent cations and then incubation in non-enzymatic cell recovery solution. Plating the resultant cell suspension on poly-D-lysine and laminin results in a highly enriched culture of submucosal glial cells for functional analysis.

בידוד תאי גליה המעית מן Submucosa פרופריה. מוסקולריס של העכבר למבוגרים

The enteric nervous system (ENS) consists of neurons and enteric glial cells (EGCs) that reside within the smooth muscle wall, submucosa and lamina ...