Hot Catalyse biologique: calorimétrie de titration isotherme pour caractériser enzymatiques Réactions

Résumé

Flux de chaleur des mesures de calorimétrie isotherme titrage libéré ou absorbé dans les réactions chimiques. Cette méthode peut être utilisée pour quantifier la catalyse enzymatique. Dans ce document, le protocole pour la configuration instrumentale, expérience en cours d'exécution, et l'analyse des données est généralement décrite, et appliquée à la caractérisation des enzymatique hydrolyse de l'urée par l'uréase jack bean.

Résumé

Calorimétrie de titration isotherme (ITC) est une technique bien décrite qui mesure la chaleur dégagée ou absorbée au cours d'une réaction chimique, en l'utilisant comme une sonde intrinsèque de caractériser pratiquement tous les processus chimiques. De nos jours, cette technique est largement utilisée pour déterminer des paramètres thermodynamiques des équilibres de liaison biomoléculaires. En outre, le CCI a été démontré pour être en mesure de mesurer directement la cinétique et les paramètres thermodynamiques (k _chat, K _M, AH) de réactions enzymatiques, même si cette application est encore sous-exploité. Comme les changements thermiques se produisent spontanément au cours de la catalyse enzymatique, le CCI ne nécessite aucune modification ou l'étiquetage du système en cours d'analyse et peut être réalisée en solution. En outre, le procédé a besoin de peu de quantité de matière. Ces propriétés font de l'ITC un outil précieux, unique et puissant pour étudier la cinétique enzymatique dans plusieurs applications, telles que, par exemple, la découverte de médicaments.

k _{cat M} et K de l'hydrolyse enzymatique de l'urée par Canavalia ensiformis (jack bean) uréase. Calcul de l'enthalpie molaire intrinsèque (AH _int) de la réaction est effectuée. Les valeurs ainsi obtenues sont en accord avec les données précédentes rapportés dans la littérature, ce qui démontre la fiabilité de la méthode.

Introduction

La détermination quantitative de réactions biochimiques permet de mieux comprendre les processus biologiques à la base de la vie. Calorimétrie propose une méthodologie sans étiquette pour caractériser quantitativement pratiquement toutes les réactions chimiques en solution. Cette technique mesure la chaleur dégagée ou absorbée au fil du temps, et est donc un système de détection universel et une méthodologie très pratique pour quantifier la quantité de molécules réagissant (c.-à-thermodynamique de liaison), ainsi que pour mesurer la vitesse de réaction (c.-à-cinétique). En particulier, calorimétrie de titration isotherme (ITC) a été adopté comme méthode de choix pour caractériser la thermodynamique des équilibres biomoléculaires, impliquant la protéine-ligand, protéine-protéine, protéine-ions métalliques et des interactions protéine-ADN ^1-6. En outre, la capacité de l'ITC de fournir des informations cinétique en fait un système très puissant pour mesurer la catalyse enzymatique, bien que le potentiel de cette application est encoresous-estimé ^7-9.

L'équation de Michaelis-Menten ¹⁰ est une description quantitative des réactions enzymatiques, car il fournit une relation entre la vitesse de réaction et la concentration du substrat, en fonction de deux paramètres cinétiques: la constante de Michaelis (K _M) et la constante de vitesse catalytique (k _cat) . Le k _cat / rapport K _M est mentionné comme l'efficacité catalytique d'une enzyme. Dans la pratique, la détermination de K et _M k _cat pour une réaction spécifique fournit une description complète de la catalyse.

Dans une réaction enzymatique typique (figure 1), un substrat (S) interagit avec l'enzyme (E) la formation du complexe enzyme-substrat (ES), qui est ensuite activé dans l'état de transition (ES *). Celui-ci est converti en le complexe enzyme-produit (EP) qui se dissocie éventuellement. Ces étapes sont décrits par la réaction suivante.

(1)

où k ₁ est la constante de vitesse pour la formation du complexe ES, _k-1 est la constante de vitesse de la dissociation du complexe ES, tandis que k _cat est la constante de vitesse catalytique ou le numéro de chiffre d'affaires.

Selon l'équation de Michaelis-Menten ^10, la vitesse de la réaction peut être calculé comme suit:

(2)

dans laquelle K = _{M (k-1} + k _cat) / k ₁ et k _cat = v _max / [E], avec v _max étant la vitesse maximale atteinte lorsque tous enzyme est lié au substrat.

La titration calorimétrique isotherme est l'instrument utilisé dans cette étude pour caractériser l'hydrolyse enzymatique de l'urée. Cet instrument est constitué d'un écran adiabatique contenant deux cellules en forme frappées (figure 1). Ceux-ci sont connectés à l'extérieur par des tubes d'accès étroits. La cellule de l'échantillon (environ 1,4 ml) est chargé avec la solution d'enzyme, tandis que la cellule de référence est généralement remplie avec de l'eau ou avec le solvant utilisé pour l'analyse. Une seringue en rotation avec une longue aiguille et une palette d'agitation attaché, contenant habituellement ca. 0,3 ml de solution de substrat, est monté sur la cellule d'échantillon. Un dispositif thermoélectrique mesure la différence de température entre l'échantillon et la cellule de référence et, à l'aide d'un "réseau de contre-réaction de la cellule", il maintient cette différence à zéro par addition ou soustraction de chaleur. Pendant l'expérience, le substrat est injecté dans la solution d'enzyme à une température constante choisie. Lorsque la sallezymatic réaction a lieu, la quantité de chaleur libérée ou absorbée est proportionnelle au nombre de molécules de substrat qui sont converties en molécules de produit. En outre, le taux de flux de chaleur est directement liée à la vitesse de la réaction. Les données mesurées, apparaissant comme un écart de la trace de la chaleur à partir de la ligne de base initiale (figure 1), représentent la puissance thermique (μcal / sec) fournie par l'instrument de la cellule d'échantillon, qui est proportionnel au flux de chaleur se produisant dans la cellule d'échantillonnage au fil du temps.

Figure 1. Représentation schématique de titration calorimétrique isotherme d'étudier les réactions enzymatiques. Une réaction enzymatique se produisant lors de la titration de substrat (dans la seringue d'injection) dans la solution d'enzyme (dans la cellule d'échantillon) a pour résultat un changement de la therpuissance mal dégagée par le calorimètre, nécessaire pour maintenir la différence de température entre la cellule de l'échantillon et la constante de la cellule de référence. Cliquez ici pour agrandir l'image.

Dans l'ensemble, le changement de chaleur (Q) est proportionnelle à l'enthalpie molaire de la réaction (AH) et le nombre de moles de produit généré (n), qui à son tour est donné par le temps de volume total de la concentration:

(3)

La formation de produit avec le temps (dP / dt), qui correspond à la vitesse de la réaction, peut ainsi être liée à la quantité de chaleur engendrée pendant la même période (dQ / dt) par la relation:

(4)

Selon cette équation, afin d'obtenir un Michaelis-Menten Parcelle il est nécessaire de mesurer i) l'enthalpie molaire totale AH, et ii) l'écoulement dQ / dt de la chaleur à différentes concentrations de substrat. Habituellement, ceci est effectué dans deux expériences différentes: dans la première expérience (méthode 1, M1), le substrat est injecté dans la solution d'enzyme et de la chaleur pour la conversion complète du substrat est mesurée; dans la seconde expérience (méthode 2, M2), de multiples injections de substrat sont effectuées et le taux de production de chaleur est mesuré à différentes concentrations de substrat. Ces deux ensembles de données sont suffisantes pour calculer les paramètres cinétiques K _M et k _cat.

Dans le présent article, un protocole général pour déterminer les paramètres cinétiques pour les réactions enzymatiques réalisées à l'aide ITC est décrite. Nous avons appliqué la méthode à hydrolyse de l'urée par Canavalia de l'uréesoi, comme un système de référence. Le bon accord entre les résultats obtenus en utilisant cette méthode et les données rapportées dans la littérature démontre la fiabilité de cette approche.

Protocole

Une. Préparation des échantillons

1. Préparer 2 ml de solution d'enzyme et 0,5 ml d'une solution de substrat pour chaque série expérimentale. Diluer les solutions mères concentrées de l'enzyme et du substrat dans des solutions tampons ayant une composition identique à minimiser la chaleur de dilution et de mélange au cours de l'addition du substrat.
   1. Choisissez les conditions de tampon qui sont adéquates pour prévenir les changements de pH pendant l'expérience. Par exemple, 20 mM HEPES pH 7 est adéquate pour des mesures à pH neutre.
      REMARQUE: si l'échange de proton est impliquée, les enthalpies de protonation des tampons utilisés doivent être considérées, car elles affectent l'AH de mesure de la réaction. Effets spécifiques possibles du tampon ou des molécules des additifs sur le système en cours d'analyse doivent être pris en compte. Si des solvants organiques (par exemple le DMSO) sont inclus dans la solution d'enzyme, les ajouter à la même concentration dans la solution de substrat.
   2. Pour l'expérience M1, commenceravec la concentration d'enzyme dans la plage nM (par exemple de 1 nM) et avec une concentration de substrat d'au moins trois ordres de grandeur plus élevée que la concentration en enzyme et au-dessus de la K _M.
   3. Pour l'expérience M2, commencer avec la concentration de l'enzyme dans la gamme pM-nM (par exemple 15 heures). concentration du substrat dans la seringue est dans la gamme mM (par exemple, 400 mM).
      NOTE: Dans l'expérience unique d'injection M1, les concentrations devraient être suffisants pour obtenir la conversion de substrat totale dans le produit au cours de la durée de l'essai. Par conséquent, la concentration de l'enzyme dépend de la vitesse de l'enzyme: si les enzymes ayant un faible k _cat sont à l'étude, les concentrations d'enzymes élevés (jusqu'à 10 uM) doivent être utilisés. D'autre part, les concentrations enzymatiques utilisées dans l'expérience M2 doivent assurer que le substrat est injecté seulement marginalement (moins de 5%) consommée et que la réaction enzymatique se déroule à l'état d'équilibre. Pour cette raison, plus lal'efficacité de l'enzyme, plus faible est la concentration de l'enzyme nécessaire. A la fin de l'expérience, la concentration du substrat dans la cellule d'échantillonnage doit être supérieure à K _M.
2. Vérifiez soigneusement enzyme et des concentrations de substrat avec une méthode d'analyse appropriée (par exemple l'absorption à 280 nm, colorimétriques, les dosages de BCA ^11. Cela est nécessaire pour obtenir un calcul précis et fiable des paramètres thermodynamiques et cinétiques.
3. Mesurer le pH des solutions et vérifier que le décalage de pH à la fois l'enzyme et les solutions de substrat est minimale dans les conditions expérimentales (± 0,05 unité de pH).

2. Exécution de l'expérience

REMARQUE: La même procédure doit être appliquée à la fois pour le M1 et M2 de l'expérience, qui sont réalisées l'une après l'autre.

1. Vérifier que la cellule d'échantillonnage et de la seringue d'injection sont nettoyés après le fabricant deinstructions. Remplir la seringue de chargement fournie avec l'instrument à l'eau distillée, insérez délicatement l'aiguille dans la cellule de l'échantillon, remplir la cellule et enlever le liquide en utilisant la même seringue. En utilisant cette méthode, laver la cellule d'échantillonnage deux fois avec de l'eau distillée et deux fois avec le tampon.
2. Charger la cellule d'échantillonnage avec 2 ml de solution d'enzyme à l'aide de la seringue de chargement, en évitant soigneusement formation de bulles d'air. Injecter lentement la solution dans la cellule jusqu'à ce qu'il se déverse sur la partie supérieure de la tige de la cellule. Produire une poussée de ca. 0,25 ml de solution dans la cellule. Répéter deux fois. Cette étape élimine les bulles d'air piégées dans la cellule d'échantillon.
3. Placer l'aiguille de la seringue de chargement sur le rebord entre la tige de la cellule et l'orifice de la cellule et retirer tout excès de solution.
4. Démarrez le programme VP-Viewer et, à partir de l'interface de l'ordinateur, équilibrer l'instrument ITC à une température de 3 ° C en dessous de la température expérimentale souhaitée. Cela est nécessaire pour éviter les longues équilibrationles périodes antérieures à l'expérience, à cause de l'appareil de refroidissement passif instrumentale.
5. Remplir la cellule de référence avec de l'eau distillée avec le même mode opératoire ci-dessus. Lorsque les tampons ayant une force ionique élevée ou élevée sont osmolalité dans la solution d'échantillon, le même tampon doit être utilisé en tant que solution de référence.
6. Relier une seringue en plastique à l'orifice de remplissage de la seringue d'injection, à l'aide d'un tube mince de silicium. Remplir la seringue d'injection de placer la pointe de l'aiguille dans l'eau et en tirant vers le haut, jusqu'à ce que l'eau qui sort de l'orifice de remplissage par le haut, ce qui indique que la seringue d'injection est remplie. Déplacez ensuite le bout de la seringue de l'eau et dresser l'air, pour vider la seringue d'injection. Avec cette procédure, laver la seringue d'injection avec un tampon, et aspirer l'air à travers le système. Par la suite, placer l'aiguille d'injection dans un tube étroit contenant 0,5 ml de solution de substrat, soigneusement élaborer et de remplir complètement la seringue d'injection, ce qui laisse peu de solution au fond du tube.
7. De l'interface de l'ordinateur, appuyez sur "Fermer remplissage port". Retirer le tube de chargement de silicium. Appuyez sur "Purge et recharge" pour permettre à la seringue d'injection pour déloger les bulles d'air et de les expulser de nouveau dans la solution globale. Répéter deux fois.
8. Déplacer la seringue d'injection, essuyer sur les côtés pour enlever les gouttes et placer l'aiguille de la seringue d'injection dans la cellule d'échantillon.
9. Sur l'ordinateur, définissez les paramètres de fonctionnement appropriés. L'enzyme expérimental et des concentrations en substrat peuvent être indiquées.
   1. Dans l'expérience M1, mettre au moins deux ajouts (5-30 pi) de substrat pour vérifier la reproductibilité. Réglez l'heure de l'espacement entre chaque injection (par exemple 1000 sec) suffisamment large pour assurer que les retours de signaux de chaleur à la ligne de base avant la prochaine addition.
   2. Dans l'expérience M2, mis multiple (par exemple 15 x 5-10 pi) injections. Définissez l'intervalle entre les injections (par exemple 180 sec) permettant au système de stabilize la puissance thermique à la nouvelle ligne de base après chaque injection.
      NOTE: Le temps d'espacement entre les injections dans l'expérience M2 doit être suffisamment courte pour éviter la conversion d'une quantité importante de substrat, ce qui permet les mesures soient effectuées dans des conditions de régime permanent.
   3. Dans l'expérience M2, utiliser de petits volumes (par exemple 2 pi) pour la première injection, dont la valeur correspondante est éliminée au cours de l'analyse ultérieure des données. En effet, il présente souvent des artefacts dus à la diffusion initiale de substrat à travers l'embout de la seringue, et pour la présence de bulles d'air emprisonnées dans l'aiguille de la seringue.
   4. Réglez la puissance de référence, le niveau approximatif dans lequel la ligne de base sera placé avant la réaction commence, à une valeur de 20. Définissez ensuite l'enzyme expérimental et des concentrations de substrat et choisir un nom pour l'expérience.
   5. Définir la température expérimentale, typiquement à 25 ° C. ITC permet des températures de travail entre 2 ° C et 80 ° C. L'expérience est prêt pour l'exécution. Appuyez sur le bouton "Démarrer" pour lancer l'expérience.
10. Une fois l'expérience terminée, nettoyer la cellule d'échantillonnage et la seringue selon les instructions du fabricant.
11. Répétez l'expérience au moins une ou deux fois de plus pour vérifier la reproductibilité des données.

3. Analyse des données

1. Dans le programme d'analyse, cliquez sur le bouton "Lecture des données", et naviguez vers le dossier où le fichier de l'expérience réalisée M2. Itc est situé. Cliquez sur la flèche déroulante de la "Type de fichiers" et sélectionnez "Enzyme Assay (il?)". Par la suite, cliquez sur et ouvrez le fichier de l'expérience M2. Itc.
2. Obtenir l'AH de la réaction à partir de l'intégration de la courbe de l'expérience M1 conformément à l'équation 5.
   "Width =" 126 "/> (5)
   1. Cliquez sur le bouton "Lecture des données", et sélectionnez le fichier. CCI de l'expérience M1 effectué. Utilisation origine, diviser la trace dans différentes parties contenant un pic pièce et économisez chaque pic en tant que fichier OPJ.. Ouvrir le fichier correspondant au premier pic, résultant de la déviation de référence dans le thermogramme de l'expérience unique M1 d'injection, intégrer et diviser la valeur de la surface obtenue, exprimée en μcal, par la concentration finale en substrat dans la cellule de l'échantillon, exprimée en uM, et par le volume de cellule exprimé en litres, la détermination, conformément à l'équation 5, l'AH de la réaction.
   2. Répétez la même procédure pour le deuxième pic de l'expérience M1 et obtenir une valeur moyenne pour les deux mesures de AH.
3. Déterminer dQ / dt à partir de l'expérience M2 mesurer la différence entre la valeur de référence initiale et la nouvelle ligne de base après chaque injection. Convertir le eXperimental données à des vitesses de réaction en fonction de l'équation 4, en utilisant la valeur de l'enthalpie obtenue dans l'expérience M1 et accrocher les données à l'équation de Michaelis-Menten.
   1. Dans le programme d'analyse, cliquez sur le bouton "Lecture des données", et sélectionnez le fichier. CCI de l'expérience réalisée M2. Cliquez sur la flèche déroulante de la "Type de fichiers" et sélectionnez "Enzyme Assay (il?)".
   2. La boîte de dialogue Enzyme Assay s'ouvre, permettant la sélection de l'un des quatre modèles. Sélectionnez "Méthode 2 - Substrat seulement" de la fenêtre.
   3. Dans la fenêtre AH, indiquer la valeur de AH obtenu à l'étape 4.2.
   4. Cliquez sur le bouton "Concentration" pour vérifier les valeurs de concentration pour être utilisé dans la procédure d'ajustement. Cliquez sur le bouton "Temps moyen (P)". La boîte de dialogue s'ouvre donnant la possibilité de changer ou accepter la valeur par défaut. Cette valeur représente le temps avant chaque injectionion, dans lequel les moyennes de l'appareil le signal de puissance pour déterminer le niveau de puissance à chaque concentration de substrat. Cliquez sur OK pour confirmer la valeur par défaut.
   5. Cliquez sur le bouton "zéro Axe Y". Le curseur se transforme en une croix permettant de double-cliquer sur un point, de mettre à y = 0. Double-cliquez juste avant le premier point d'injection.
   6. Cliquez sur le bouton Calculer Taux d'. Rate est tracée en fonction de la concentration du substrat, obtenu en divisant le substrat ajouté au cours du titrage pour le volume de la cellule de l'échantillon (en tenant compte des effets de dilution). Cette opération donne un terrain typique de Michaelis-Menten qui peut être monté pour obtenir K _M et k _cat.
   7. Si certains points doivent être supprimés, cliquez sur le bouton "Tronquer données". Déplacez les marqueurs de données pour exclure les points de données mauvaises et double-cliquez sur un des marqueurs ou appuyez sur Entrée.
   8. Utilisez la fonction "Ajuster à modéliser" pour s'adapter à la courbe et àobtenir les constantes cinétiques.

Résultats

Uréase (CE 3.5.1.5; urée amidohydrolase) est une enzyme contenant du nickel unités multiples trouvée dans archées, les bactéries, eucaryotes unicellulaires et les plantes. Ceci agit de protéines dans la dernière étape de minéralisation de l'azote organique, catalysant l'hydrolyse de l'urée en ammoniac et de carbamate, qui se décompose spontanément pour donner une deuxième molécule d'ammoniac et de bicarbonate (Equation 6) ^12.

Discussion

L'importance de l'ITC pour étudier l'activité enzymatique par rapport aux méthodes existantes

En plus de ses applications classiques pour étudier les équilibres de liaison, calorimétrie de titration isotherme offre une méthode fiable et rapide pour caractériser les réactions enzymatiques en solution en utilisant la chaleur de réaction comme une sonde, sans nécessiter de modification ou l'étiquetage système. Les paramètres cinétiques _kc...

matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
HEPES	Sigma	H3375	dissolving in water and adjusting pH with NaOH
TRIZMA-Base	Sigma	T1503	dissolving in water and adjusting pH with HCl
Sodium dihydrogen phosphate	Riedel-de-Haen	4270	dissolving in water
Sodium phosphate dibasic	Riedel-de-Haen	30427	dissolving in water
Urea	Sigma	U4128	dissolving in water at 40 °C
Canavalia ensiformis urease (type C-3)	Sigma	U0251	dissolving in 20 mM HEPES pH 7 and stored at -80 °C
VP-ITC on Origin 7.0	MicroCal (GE Healthcare)	SYS13901	instrument
VPViewer2000 1.30.00 on Origin 7.0	MicroCal (GE Healthcare)		data acquisition software supplied with the instrument