Hot Catalisi biologica: Calorimetria isotermica di titolazione per caratterizzare reazioni enzimatiche

Riepilogo

Isotermico misure titolazione calorimetria flusso di calore rilasciato o assorbito nelle reazioni chimiche. Questo metodo può essere utilizzato per quantificare enzima-catalisi. In questo documento, il protocollo per la configurazione strumentale, esperimento esecuzione e analisi dei dati è generalmente descritto, e applicato alla caratterizzazione di idrolisi enzimatica dell'urea da jack bean ureasi.

Abstract

Calorimetria isotermica di titolazione (ITC) è una tecnica ben descritto che misura il calore rilasciato o assorbito durante una reazione chimica, usandolo come una sonda intrinseca per caratterizzare praticamente ogni processo chimico. Oggi, questa tecnica è ampiamente applicata per determinare i parametri termodinamici di equilibri vincolanti biomolecolari. Inoltre, ITC ha dimostrato di essere in grado di misurare direttamente cinetiche e termodinamiche _(cat k, K _M, AH) di reazioni enzimatiche, anche se questa applicazione è ancora poco sfruttato. Come sbalzi termici avvengono spontaneamente durante la catalisi enzimatica, ITC non richiede alcuna modifica o etichettatura del sistema sotto analisi e può essere eseguita in soluzione. Inoltre, il metodo deve piccola quantità di materiale. Queste caratteristiche rendono ITC uno strumento prezioso, potente e unica di studiare cinetica enzimatica in diverse applicazioni, come, ad esempio, la scoperta della droga.

k _gatto e K _M del idrolisi enzimatica dell'urea da Canavalia ensiformis (fagiolo jack) ureasi. Viene eseguito il calcolo di entalpia molare intrinseca (AH _int) della reazione. I valori così ottenuti sono coerenti con i dati precedenti riportati in letteratura, dimostrando l'affidabilità del metodo.

Introduzione

Determinazione quantitativa di reazioni biochimiche fornisce approfondimenti sui processi biologici alla base della vita. Calorimetria offre una metodologia libero-label per caratterizzare quantitativamente praticamente ogni reazione chimica in soluzione. Questa tecnica misura il calore rilasciato o assorbito nel tempo, ed è quindi un sistema di rilevamento universale e una metodologia molto comodo per quantificare la quantità di molecole reagenti (cioè termodinamica vincolanti), nonché per misurare la velocità di reazione (cioè cinetica). In particolare, Calorimetria isotermica di titolazione (ITC) è stato adottato come metodo di scelta per caratterizzare la termodinamica di equilibri biomolecolari, coinvolgendo proteina-ligando, proteina-proteina, proteina-ioni metallici e le interazioni proteina-DNA ^1-6. Inoltre, la capacità di ITC di fornire informazioni cinetiche rende un sistema molto potente per misurare catalisi enzimatica, anche se il potenziale di questa applicazione è ancorasottovalutato ^7-9.

L'equazione di Michaelis-Menten ¹⁰ è una descrizione quantitativa di reazioni enzimatiche, in quanto fornisce una relazione tra la velocità di reazione e la concentrazione del substrato, a seconda di due parametri cinetici: la costante di Michaelis (K _M) e la costante di velocità catalitica (k _cat) . Il _gatto k / rapporto K _M viene definito come l'efficienza catalitica di un enzima. In pratica, la determinazione di K _M e K _gatto per una reazione specifica fornisce una descrizione completa della catalisi.

In una tipica reazione enzimatica (Figura 1), un substrato (S) interagisce con l'enzima (E) che formano il complesso enzima-substrato (ES), che viene successivamente attivato nello stato di transizione (ES *). Quest'ultimo viene convertito nel complesso enzima-prodotto (EP) che alla fine si dissocia. Questi steps sono descritti dalla seguente reazione.

(1)

dove k ₁ è la costante di velocità per la formazione del complesso ES, k _-1 è la costante di velocità per la dissociazione del complesso ES, mentre k _gatto è la costante di velocità catalitica o numero di turnover.

Secondo l'equazione di Michaelis-Menten ^10, la velocità di reazione può essere calcolato come:

(2)

in cui _M = K (k _-1 + k _cat) / k ₁ ek _cat = v _max / [E], con v _max essendo la velocità massima raggiunta quando tutti enzima è legato al substrato.

La titolazione calorimetro isotermico è lo strumento utilizzato in questo studio per caratterizzare l'idrolisi enzimatica dell'urea. Questo strumento è costituito da uno scudo adiabatico contenente due cellule a forma coniati (Figura 1). Questi sono collegati all'esterno con tubi accesso strette. La cella campione (ca. 1,4 ml) viene caricato con soluzione enzimatica, mentre la cella di riferimento è generalmente riempito con acqua o con il solvente utilizzato per l'analisi. Una siringa rotante con un lungo ago e una pagaia stir divisoria, generalmente comprendente ca. 0,3 ml di soluzione di substrato, è montato sulla cella campione. Un dispositivo termoelettrico misura la differenza di temperatura tra il campione e la cella di riferimento e, utilizzando una "rete di retroazione cella", mantiene questa differenza a zero aggiungendo o sottraendo calore. Durante l'esperimento, il substrato viene iniettato nella soluzione enzimatica a temperatura costante scelta. Quando l'enzymatic reazione ha luogo, la quantità di calore ceduto o assorbito è proporzionale al numero di molecole di substrato che vengono convertiti in molecole dei prodotti. Inoltre, il tasso di flusso di calore è direttamente correlata alla velocità di reazione. I dati misurati, che appare come una deviazione del tracciato calore dalla linea di base iniziale (Figura 1), rappresentano la potenza termica (μcal / sec) fornite dallo strumento alla cella campione, che è proporzionale al flusso di calore che si verificano nella cella campione nel tempo.

Figura 1. Rappresentazione schematica di titolazione isotermico calorimetro per studiare reazioni enzimatiche. Una reazione enzimatica si produce in conseguenza titolazione del substrato (prodotto nella siringa) nella soluzione enzimatica (nella cella campione) determina una variazione del therpotere mal rilasciato dal calorimetro, necessario per mantenere la differenza di temperatura tra la cella campione e la costante di cella di riferimento. Clicca qui per vedere l'immagine ingrandita.

Nel complesso, la variazione di calore (Q) è proporzionale alla entalpia molare della reazione (AH) e il numero di moli di prodotto generato (n), che a sua volta è dato dai tempi totali di volume la concentrazione:

(3)

La formazione del prodotto nel tempo (dP / dt), che corrisponde alla velocità di reazione, può quindi essere correlato alla quantità di calore generato nello stesso tempo (dQ / dt) attraverso la relazione:

(4)

Secondo questa equazione, al fine di ottenere un Michaelis-Menten trama è necessario misurare i) il totale entalpia molare AH, e ii) il flusso di calore dQ / dt a differenti concentrazioni di substrato. Solitamente, questa viene eseguita in due diversi esperimenti: nel primo esperimento (metodo 1, M1), il substrato viene iniettato nella soluzione enzimatica e il calore per la conversione completa del substrato viene misurata; Nel secondo esperimento (metodo 2, M2), iniezioni multiple di substrato vengono eseguite e il tasso di produzione di calore viene misurato a differenti concentrazioni di substrato. Questi due insiemi di dati sono sufficienti per ricavare i parametri cinetici K _M e K _cat.

Nel presente articolo, un protocollo generale per determinare i parametri cinetici per le reazioni enzimatiche eseguite utilizzando ITC è descritto. Abbiamo applicato il metodo di urea all'idrolisi da Canavalia ensiformis urease, come un sistema di riferimento. Il buon accordo tra i risultati ottenuti con questo metodo e dei dati riportati in letteratura dimostra l'affidabilità di questo approccio.

Protocollo

1. Campioni Preparazione

1. Preparare 2 ml della soluzione enzimatica e 0,5 ml di soluzione di substrato per ogni prova sperimentale. Diluire le soluzioni madre concentrate di enzima e substrato in soluzione tampone avente composizione identica per ridurre al minimo il calore di diluizione e miscelazione durante l'aggiunta del substrato.
   1. Scegliere le condizioni di buffer che siano adeguati a prevenire il cambiamento del pH durante l'esperimento. Ad esempio, HEPES 20 mM pH 7 è sufficiente per misurazioni a pH neutro.
      NOTA: Se scambio protonico è coinvolto, entalpie di protonazione dei buffer utilizzati devono essere considerati, in quanto influenzano l'AH misurato della reazione. Possibili effetti specifici del buffer o additivi molecole del sistema sotto analisi devono essere presi in considerazione. Se solventi organici (ad esempio DMSO) sono inclusi nella soluzione enzimatica, aggiungerli alla stessa concentrazione nella soluzione substrato.
   2. Per l'esperimento M1, avviarecon concentrazione dell'enzima nell'intervallo nM (ad esempio, 1 nM) e con una concentrazione del substrato almeno tre ordini di grandezza superiore alla concentrazione dell'enzima e sopra il K _M.
   3. Per l'esperimento M2, iniziare con concentrazione dell'enzima nel range pm-nM (ad esempio 15 pM). Concentrazione del substrato nella siringa è nell'intervallo mM (ad esempio 400 mM).
      NOTA: Nell'esperimento M1 singola iniezione, le concentrazioni dovrebbero essere sufficienti per ottenere la conversione totale del substrato nel prodotto nel tempo sperimentale. Pertanto, la concentrazione dell'enzima dipende dal tasso di enzima: se gli enzimi di bassa k _gatto sono in fase di studio, le concentrazioni enzimatiche più elevate (fino a 10 micron) devono essere usate. D'altra parte, le concentrazioni di enzima usato nell'esperimento M2 deve assicurare che il substrato iniettato è solo marginalmente (meno del 5%) consumata e che la reazione enzimatica procede allo stato stazionario. Per questo motivo, maggiore è laefficienza enzima, più bassa è la concentrazione di enzima necessario. Alla fine dell'esperimento, concentrazione del substrato nella cella campione deve essere superiore K _M.
2. Controllare attentamente enzimi e concentrazioni di substrato con una procedura analitica appropriata (ad es assorbanza a 280 nm, colorimetrici, saggi BCA ^11. Ciò è necessario per ottenere il calcolo preciso e affidabile dei parametri termodinamici e cinetici.
3. Misurare il pH delle soluzioni e verificare che il disallineamento pH sia della soluzioni substrato enzimatico ed è minima nelle condizioni sperimentali (± 0,05 unità di pH).

2. Esecuzione dell'esperimento

NOTA: La stessa procedura deve essere applicata sia per la M1 e M2 dell'esperimento, che vengono eseguiti uno dopo l'altro.

1. Verificare che la cella porta-campione e la siringa di iniezione vengono puliti secondo il produttore delistruzioni. Riempire la siringa caricamento fornito con lo strumento con acqua distillata, inserire delicatamente l'ago nella cella campione, riempire la cella e rimuovere il liquido usando la stessa siringa. Usando questo metodo, lavare la cella campione due volte con acqua distillata e due volte con il tampone.
2. Caricare la cella campione con 2 ml di soluzione enzimatica utilizzando la siringa carico, evitando accuratamente la formazione di bolle d'aria. Iniettare lentamente la soluzione nella cella finché non fuoriesce all'inizio della cellula staminale. Produrre un getto di ca. 0,25 ml di soluzione nella cella. Ripetere due volte. Questo passaggio rimuove le bolle d'aria intrappolate nella cella del campione.
3. Posizionare l'ago della siringa caricamento sulla sporgenza tra lo stelo e la cella porta cellulare e rimuovere la soluzione in eccesso.
4. Avviare il programma VP-Viewer e, dall'interfaccia computer equilibrare lo strumento ITC ad una temperatura di 3 ° C inferiore alla temperatura sperimentale desideri. Questo è necessario per evitare lunghe equilibraturaperiodi precedenti l'esperimento, a causa del dispositivo di raffreddamento passivo strumentale.
5. Riempire la cella di riferimento con acqua distillata con la stessa procedura di cui sopra. Quando buffer con elevata forza ionica o elevata osmolalità sono nella soluzione campione, lo stesso buffer deve essere utilizzata come soluzione di riferimento.
6. Collegare una siringa di plastica alla porta di riempimento della siringa di iniezione, utilizzando un tubo in silicone sottile. Riempire la siringa mettendo la punta dell'ago in acqua e stesura, fino a quando l'acqua esce dal porto di riempimento superiore, indicando che la siringa è pieno. Quindi spostare la punta della siringa da acqua e redigere aria, per svuotare la siringa. Con questa procedura, lavare la siringa con tampone, e aspirare aria attraverso il sistema. Successivamente, posizionare l'ago di iniezione in uno stretto tubo contenente 0,5 ml di soluzione di substrato, elaborare accuratamente e riempire completamente la siringa di iniezione, lasciando piccola quantità di soluzione al fondo della provetta.
7. Dallainterfaccia del computer, premere il tasto "Chiudi la porta di riempimento". Rimuovere il tubo di carico silicio. Premere "Purge e ricarica" ​​per consentire la siringa per rimuovere eventuali bolle d'aria e di espellere di nuovo nella soluzione di massa. Ripetere due volte.
8. Spostare la siringa di iniezione, pulire sui lati per rimuovere eventuali gocce e inserire l'ago della siringa nella cella per campioni.
9. Sul computer, impostare i parametri di funzionamento appropriati. L'enzima sperimentale e concentrazioni di substrato possono essere indicati.
   1. Nell'esperimento M1, impostare almeno due aggiunte (5-30 microlitri) di supporto per verificare la riproducibilità. Impostare il tempo di distanza tra ciascuna iniezione (ad esempio 1.000 sec) sufficientemente grande da garantire che il segnale di calore ritorna al basale prima della successiva aggiunta.
   2. Nell'esperimento M2, impostare multiple (ad esempio 15 x 5-10 microlitri) iniezioni. Impostare l'intervallo tra le iniezioni (ad esempio 180 sec) consente al sistema di stabilize la potenza termica per la nuova linea di base dopo ogni iniezione.
      NOTA: Il tempo spaziatura tra iniezioni nell'esperimento M2 dovrebbe essere sufficientemente breve da evitare la conversione di una notevole quantità di substrato, consentendo le misurazioni da effettuare in condizioni stazionarie.
   3. Nell'esperimento M2, usare piccoli volumi (ad esempio 2 mL) per la prima iniezione, il cui valore corrispondente viene scartato durante la successiva analisi dei dati. Infatti, spesso presenta artefatti dovuti alla diffusione substrato iniziale attraverso la siringa, e per la presenza di bolle d'aria intrappolate nel ago della siringa.
   4. Impostare la potenza di riferimento, il livello approssimativo in cui la linea di base viene posizionato prima la reazione si inneschi, ad un valore di 20. Quindi definire l'enzima sperimentale e concentrazioni di substrato e ha scelto un nome per l'esperimento.
   5. Definire la temperatura sperimentale, tipicamente a 25 ° C. ITC permette temperature di lavoro tra i 2 ° C e 80 ° C. L'esperimento è pronto per l'esecuzione. Premere il tasto "Start" per avviare l'esperimento.
10. Una volta che l'esperimento è finito, pulire la cella porta-campione e la siringa seguendo le istruzioni del produttore.
11. Ripetere l'esperimento almeno uno o due più volte per verificare la riproducibilità dei dati.

3. Analisi dei dati

1. Dal programma di analisi, fare clic sul pulsante "Leggi i dati", e passare alla cartella in cui si trova il file. Itc dell'esperimento M2 eseguita. Fare clic sulla freccia di scorrimento verso il basso del "File di tipo" e selezionare "Enzima Assay (vero?)". Successivamente, fare clic e aprire il file. Itc dell'esperimento M2.
2. Avere la AH della reazione da integrare la curva dell'esperimento M1 secondo l'equazione 5.
   "Width =" 126 "/> (5)
   1. Fare clic sul pulsante "Leggi i dati", e selezionare il file. Itc dell'esperimento M1 eseguita. Utilizzando Origin, dividere la traccia in diverse parti contenenti un picco e salva ogni picco come un file opj.. Aprire il file corrispondente al primo picco, risultante dalla deviazione basale nel termogramma dell'esperimento singolo M1 iniezione, integrarlo e dividere il valore dell'area ottenuto, espressa in μcal, dalla concentrazione del substrato finale nella cella campione, espresso in micron, e dal volume delle cellule espresso in litri, determinare, secondo l'equazione 5, la AH della reazione.
   2. Ripetere la stessa procedura per il secondo picco dell'esperimento M1 ed ottenere un valore medio per i due misurazioni AH.
3. Determinare dQ / dt dall'esperimento M2 misurando la differenza tra la linea di base originale e la nuova linea di base dopo ciascuna iniezione. Convertire l'indirizzoXperimental dati a velocità di reazione secondo l'equazione 4, utilizzando il valore di entalpia ottenuto nell'esperimento M1 e approssimare i dati per l'equazione di Michaelis-Menten.
   1. Dal programma di analisi, fare clic sul pulsante "Leggi i dati", e selezionare il file. Itc dell'esperimento M2 eseguita. Fare clic sulla freccia di scorrimento verso il basso del "File di tipo" e selezionare "Enzima Assay (vero?)".
   2. Si apre la finestra di dialogo Enzyme Assay, permettendo selezionando uno dei quattro modelli. Selezionare "Metodo 2 - solo substrato" dalla finestra.
   3. Nella finestra AH, indicare il valore di AH ottenuto nel passaggio 4.2.
   4. Fare clic sul pulsante "Concentrazione" per verificare i valori di concentrazione da utilizzare nella procedura di montaggio. Fare clic sul pulsante "Tempo medio (P)". La finestra di dialogo si apre dando la possibilità di cambiare o accettare il valore predefinito. Questo valore rappresenta il tempo prima di ogni iniezioneione in cui le medie strumento il segnale di alimentazione per determinare il livello di potenza ad ogni concentrazione del substrato. Fare clic su OK per confermare il valore predefinito.
   5. Fare clic sul pulsante "Zero Asse Y". Il cursore si trasforma in una croce che consente di fare doppio clic su un punto, a mettere a y = 0. Fare doppio clic appena prima del primo punto di iniezione.
   6. Fare clic sul pulsante Calcola Rate. Tasso è tracciata in funzione della concentrazione del substrato, ottenuta dividendo il substrato aggiunto durante la titolazione per il volume cella campione (tenendo conto degli effetti di diluizione). Questa operazione dà una tipica trama di Michaelis-Menten che può essere montato per ottenere K _M e K _cat.
   7. Se alcuni punti dovrebbero essere cancellati, selezionare il pulsante "Troncare dati". Spostare gli indicatori di dati per escludere i punti dati cattivi e fare doppio clic su uno dei marcatori o premere Invio.
   8. Utilizzare la funzione "Adatta al modello" per adattare la curva eottenere le costanti cinetiche.

Risultati

Ureasi (CE 3.5.1.5; urea amidoidrolasi) è un enzima contenente nichel multisubunit trovato Archea, batteri, eucarioti e piante unicellulari. Questa proteina agisce nell'ultima fase di mineralizzazione dell'azoto organico, che catalizzano l'idrolisi dell'urea in ammoniaca e carbammato, che si decompone spontaneamente a dare una seconda molecola di ammoniaca e bicarbonato (Equazione 6) ^12.

Discussione

Significato della ITC per studiare l'attività enzimatica rispetto ai metodi esistenti

Oltre alle sue applicazioni classiche per studiare equilibri vincolanti, Calorimetria isotermica di titolazione fornisce un metodo affidabile e veloce per caratterizzare reazioni enzimatiche in soluzione utilizzando il calore di reazione come sonda, senza richiedere modifiche o etichettatura sistema. I parametri cinetici k _gatto e K _M sono solita...

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
HEPES	Sigma	H3375	dissolving in water and adjusting pH with NaOH
TRIZMA-Base	Sigma	T1503	dissolving in water and adjusting pH with HCl
Sodium dihydrogen phosphate	Riedel-de-Haen	4270	dissolving in water
Sodium phosphate dibasic	Riedel-de-Haen	30427	dissolving in water
Urea	Sigma	U4128	dissolving in water at 40 °C
Canavalia ensiformis urease (type C-3)	Sigma	U0251	dissolving in 20 mM HEPES pH 7 and stored at -80 °C
VP-ITC on Origin 7.0	MicroCal (GE Healthcare)	SYS13901	instrument
VPViewer2000 1.30.00 on Origin 7.0	MicroCal (GE Healthcare)		data acquisition software supplied with the instrument