Hot Catálise Biológica: Calorimetria isotérmica de titulação para caracterizar reações enzimáticas

Resumo

Isotérmico medidas de calorimetria de titulação fluxo de calor liberado ou absorvido nas reações químicas. Este método pode ser usado para quantificar a enzima-catálise. Neste trabalho, o protocolo para a instalação instrumental, experiência em execução e análise de dados é geralmente descrito, e aplicada à caracterização de hidrólise enzimática de uréia por jack urease do feijão.

Resumo

Calorimetria de titulação isotérmica (ITC) é uma técnica bem descrito que mede o calor liberado ou absorvido durante uma reação química, utilizando-o como uma sonda intrínseca para caracterizar praticamente todos os processos químicos. Hoje em dia, esta técnica é amplamente aplicada para determinar os parâmetros termodinâmicos de equilíbrio de ligação biomoleculares. Além disso, o ITC demonstrou ser capaz de medir directamente a cinética e os parâmetros termodinâmicos _(cat K, K _M, ÔH) de reacções enzimáticas, embora esta aplicação é ainda pouco explorados. Como as mudanças de calor ocorrer espontaneamente durante a catálise enzimática, a ITC não exige qualquer modificação ou rotulagem do sistema sob análise e pode ser realizada em solução. Além disso, o método tem pouca quantidade de material. Estas propriedades fazem com que uma ferramenta de valor inestimável ITC, poderosa e única para o estudo da cinética de enzimas em várias aplicações, tais como, por exemplo, a descoberta de medicamentos.

k _cat e K _M da hidrólise enzimática de uréia por Canavalia ensiformis (feijão de porco) urease. Cálculo da entalpia molar intrínseca (AH _int) a reacção é realizada. Os valores assim obtidos são consistentes com os dados anteriores descritos na literatura, o que demonstra a fiabilidade do método.

Introdução

A determinação quantitativa de reações bioquímicas fornece insights sobre os processos biológicos a base da vida. Calorimetria oferece uma metodologia livre de etiqueta para caracterizar quantitativamente praticamente todas as reações químicas em solução. Esta técnica mede o calor libertado ou absorvido ao longo do tempo, e é, portanto, um sistema de detecção universal e uma metodologia muito conveniente para quantificar a quantidade de moléculas de reacção de ligação (ou seja, a termodinâmica), bem como para medir a velocidade da reacção (isto é, a cinética). Em particular, calorimetria de titulação isotérmica (ITC) foi adotado como método de escolha para caracterizar a termodinâmica dos equilíbrios biomoleculares, envolvendo proteína-ligante, proteína-proteína, proteína-íons metálicos e interações DNA-proteína ^1-6. Além disso, a capacidade de ITC para fornecer informação cinética faz com que seja um sistema poderoso para medir a catálise da enzima, embora o potencial desta aplicação é aindasubestimado ^7-9.

A equação de Michaelis-Menten ^{de 10} é uma descrição quantitativa das reacções enzimáticas, uma vez que proporciona uma relação entre a velocidade de reacção e a concentração do substrato, dependendo de dois parâmetros cinéticos: a constante de Michaelis (K _M) e a constante de velocidade catalítica _(kcat) . O _kcat / K _M é referida como a eficiência catalítica de uma enzima. Na prática, a determinação de K _M e K _cat para uma reacção específica proporciona uma descrição completa da catálise.

Numa reacção típica enzimática (Figura 1), um substrato (S) interage com a enzima (E), formando o complexo enzima-substrato (ES), que é subsequentemente activado no estado de transição (ES *). O último é convertido no complexo enzima-produto (PE) que, eventualmente, se dissocia. Estes passos são descritos através da reacção seguinte.

(1)

onde k é _uma constante de velocidade para a formação do complexo ES, k _-1 é a constante de velocidade da dissociação do complexo ES, enquanto _kcat é a constante de velocidade catalítica ou número de turnover.

De acordo com a equação de Michaelis-Menten ^{de 10,} a taxa da reacção pode ser calculado como:

(2)

em que _M = K _{(k-1 +} k _cat) / k ₁ e k _cat = _Vmax / [E], com v _max sendo a velocidade máxima atingida quando todos enzima é ligada ao substrato.

O calorímetro de titulação isotérmica é o instrumento utilizado neste estudo para caracterizar a hidrólise enzimática de ureia. Este instrumento é feito de um escudo adiabático contendo duas pilhas em forma de cunhadas (Figura 1). Estas estão ligadas ao lado de fora, com tubos de acesso estreitas. A célula da amostra (cerca de 1,4 ml) é carregado com a solução de enzima, enquanto que a célula de referência é geralmente cheia com água ou com o solvente usado para a análise. Uma seringa de rotação com uma agulha comprida e uma pá de agitação ligado, geralmente contendo ca. 0,3 ml de solução de substrato, é montada na célula de amostra. Um dispositivo termoeléctrico mede a diferença de temperatura entre a amostra e a célula de referência e, usando uma "rede de realimentação da célula", que mantém esta diferença a zero pela adição ou subtracção de calor. Durante o ensaio, o substrato é injectado na solução de enzima a uma temperatura escolhida constante. Quando o enzymatic reacção tem lugar, a quantidade de calor libertada ou absorvida é proporcional ao número de moléculas de substrato que são convertidos em moléculas do produto. Além disso, a taxa de fluxo de calor está directamente relacionada com a velocidade da reacção. Os dados medidos, aparecendo como um desvio de calor a partir do traçado da linha de base inicial (Figura 1), representam a energia térmica (μcal / seg) fornecido pelo aparelho para a célula de amostra, que é proporcional ao fluxo de calor que ocorre na célula de amostra ao longo do tempo.

Figura 1. Representação esquemática do calorímetro de titulação isotérmica para estudar as reacções enzimáticas. Uma reacção enzimática que ocorre na titulação do substrato (na seringa de injecção), para a solução de enzima (na célula de amostra) resulta em uma mudança da terapmal poder liberado pelo calorímetro, necessário para manter a diferença de temperatura entre a célula de amostra e a constante da célula de referência. Clique aqui para ver imagem ampliada.

Em geral, a troca de calor (Q) é proporcional à entalpia molar da reacção (AH) e o número de moles de produto gerado (n), que por sua vez é determinado pelos tempos totais de volume da concentração:

(3)

A formação do produto ao longo do tempo (dP / dt), o que corresponde à velocidade da reacção, pode, assim, ser relacionado com a quantidade de calor gerado durante o mesmo tempo (dQ / dt), através da relação:

(4)

De acordo com esta equação, a fim de se obter um lote de Michaelis-Menten, é necessário medir i) o total AH entalpia molar, e ii) o fluxo de calor dQ / dt, em diferentes concentrações de substrato. Geralmente, isto é realizado em duas experiências diferentes: na primeira experiência (Método 1, M1), o substrato é injectado na solução de enzima e do calor para a conversão completa do substrato é medida; na segunda experiência (Método 2, M2), injecções múltiplas de substrato são realizados e a taxa de produção de calor é medido em diferentes concentrações de substrato. Estes dois conjuntos de dados são suficientes para derivar os parâmetros cinéticos K _M e k _cat.

No presente artigo, um protocolo geral para determinar os parâmetros cinéticos de reações enzimáticas realizadas utilizando ITC é descrito. O método foi aplicado a hidrólise da uréia por Canavalia ensiformis uréiase, como um sistema de referência. A boa concordância entre os resultados obtidos através deste método e os dados relatados na literatura demonstra a confiabilidade desta abordagem.

Protocolo

1. Amostras Preparar

1. Prepare a 2 ml de solução de enzima, e de 0,5 ml de solução de substrato para cada ensaio experimental. Dilui-se as soluções de concentrados de enzima e substrato em soluções tampão com composição idêntica para minimizar o calor de diluição e mistura, durante a adição do substrato.
   1. Escolha das condições de buffer que forem adequadas para evitar alteração do pH durante o experimento. Por exemplo, HEPES 20 mM, pH 7, é adequada para medições em pH neutro.
      NOTA: Se troca de prótons está envolvido, entalpias de protonação dos buffers usados ​​devem ser considerados, porque eles afetam o AH medida da reação. Possíveis efeitos específicos do tampão ou moléculas de aditivos no sistema em análise devem ser tidos em conta. Se os solventes orgânicos (por exemplo, DMSO) são incluídos na solução de enzima, adicionar-lhes exactamente a mesma concentração em solução de substrato.
   2. Para o experimento M1, iniciarcom a concentração de enzima na gama de nM (por exemplo, 1 nM) e com uma concentração de substrato, pelo menos, três ordens de grandeza maior do que a concentração de enzima e, acima de K _M.
   3. Para o experimento M2, comece com concentração de enzima na faixa de pM-NM (por exemplo, 15 horas). A concentração do substrato na seringa está no intervalo mM (por exemplo, 400 mM).
      NOTA: Na única injeção M1 experimento, as concentrações devem ser suficientes para alcançar a conversão total do substrato no produto ao longo do tempo experimental. Portanto, a concentração da enzima depende da taxa de enzima: se enzimas com baixo _kcat estão em estudo, a concentração de enzima mais altas (até 10 uM) deve ser usado. Por outro lado, as concentrações de enzimas utilizadas na experiência M2 deve assegurar que o substrato é injectado apenas marginalmente (menos do que 5%) consumido e que a reacção enzimática prossegue no estado estacionário. Por esta razão, maior é oa eficiência da enzima, menor a concentração de enzima necessária. No final da experiência, a concentração do substrato na célula de amostra deve ser maior do que o K _H.
2. Verifique cuidadosamente enzima e concentrações de substrato com um procedimento analítico apropriado (por exemplo, a absorvância a 280 nm, colorimétricos, ensaios BCA ^11. Isso é necessário para obter o cálculo preciso e fiável dos parâmetros termodinâmicos e cinéticos.
3. Medir o pH das soluções e verificar que o desfasamento de ambos a enzima e as soluções de substrato pH é mínima sob as condições experimentais (± 0,05 unidades de pH).

2. Realização do experimento

NOTA: O mesmo procedimento deve ser aplicado tanto para a M1 e M2 do experimento, os quais são realizados um após o outro.

1. Verificar que a célula de amostra e a seringa de injecção são limpas de acordo com o fabricanteinstruções. Encher a seringa de carregamento fornecida com o aparelho com água destilada, inserir a agulha suavemente na célula de amostra, encher a célula e remover o líquido, usando a mesma seringa. Usando este método, lava-se a célula de amostra, duas vezes com água destilada e duas vezes com o tampão.
2. Coloque a célula de amostra com 2 ml de solução de enzima usando a seringa de carga, evitando cuidadosamente a formação de bolhas de ar. Injectar-se lentamente a solução para dentro da célula, até que derrama a parte superior da haste da célula. Produzir um surto de ca. De 0,25 ml de solução para dentro da célula. Repita duas vezes. Essa etapa remove bolhas de ar presas na célula de amostra.
3. Coloque a agulha da seringa de carga na borda entre a haste da célula e a porta de célula e remover qualquer solução em excesso.
4. Inicie o programa de VP-Viewer e, a partir da interface de computador, equilibrar o instrumento ITC a uma temperatura de 3 ° C abaixo da temperatura experimental desejado. Isso é necessário para evitar longas equilíbrioperíodos antes do experimento, devido ao dispositivo de resfriamento instrumental passiva.
5. Encher a célula de referência com água destilada, com o mesmo procedimento acima. Quando tampões com elevada força iónica ou alta osmolaridade são na solução da amostra, o mesmo tampão deve ser usada como solução de referência.
6. Ligação de uma seringa de plástico para a abertura de enchimento da seringa de injecção, utilizando um tubo de silicone fino. Encha a seringa de injeção colocando a ponta da agulha em água e elaboração, até que a água sai da porta de enchimento superior, indicando que a seringa está cheia. Em seguida, passar a ponta da seringa da água e elaborar o ar, para esvaziar a seringa de injeção. Com este procedimento, lavar a seringa de injecção com um tampão, e extrair o ar através do sistema. Posteriormente, coloca a agulha de injecção em um tubo estreito que contém 0,5 ml de solução de substrato, cuidadosamente elaborar e encher completamente a seringa de injecção, deixando pequena quantidade de solução no fundo do tubo.
7. Dointerface do computador, pressione "Fechar preenchimento porta". Remover o tubo de carga de silício. Pressione "Purge e reabastecer" para permitir que a seringa para retirar as bolhas de ar e expulsá-los de volta para a solução a granel. Repita duas vezes.
8. Mova a seringa de injeção, limpe nas laterais para remover todas as gotas e coloque a agulha da seringa de injeção na célula de amostra.
9. No computador, defina os parâmetros de funcionamento apropriadas. A enzima experimental e concentrações de substrato pode ser indicado.
   1. No experimento M1, definida, pelo menos, duas adições (5-30 ul) de substrato para verificar a reprodutibilidade. Ajustar o tempo de espaçamento entre cada injecção (por exemplo, 1000 seg) suficientemente grande para assegurar que os sinais de calor retorna à linha de base antes da adição seguinte.
   2. No experimento M2, definir múltiplas (por exemplo, 15 x 5-10 ul) injeções. Defina o intervalo entre as injeções (por exemplo, 180 seg), permitindo que o sistema stabilize a energia térmica para a nova linha de base após cada injecção.
      NOTA: O tempo de espaçamento entre as injecções no experimento M2 deve ser curto o suficiente para evitar a conversão de uma quantidade significativa de substrato, permitindo que as medições para ser realizada sob condições de estado estacionário.
   3. No experimento M2, utilizar pequenos volumes (por exemplo, 2 ul) para a primeira injecção, cujo valor correspondente é descartado durante a análise de dados subsequente. Com efeito, muitas vezes apresenta artefactos devido à difusão inicial de substrato por meio da ponta da seringa, e para a presença de bolhas de ar aprisionadas no interior da agulha de uma seringa.
   4. Definir a potência de referência, o nível aproximado em que a linha de base será colocada antes da reacção começar, a um valor de 20. Em seguida, defina a enzima experimental e as concentrações de substrato e escolheu um nome para o experimento.
   5. Definir a temperatura experimental, tipicamente a 25 ° C. ITC permite temperaturas de trabalho entre 2 ° C e 80 ° C. O experimento está pronto para correr. Pressione o botão "Start" para iniciar o experimento.
10. Uma vez que a experiência terminou, limpar a célula de amostra e a seringa de acordo com as instruções do fabricante.
11. Repetir o ensaio pelo menos uma ou duas vezes para verificar a reprodutibilidade dos dados.

3. Análise de Dados

1. A partir do programa de análise, clique no botão "Ler dados", e navegue até a pasta onde o arquivo. Itc do experimento M2 realizada está localizado. Clique na seta de rolagem para baixo do "Arquivos do tipo" e selecione "ensaio enzimático (é?)". Posteriormente, clique e abrir o arquivo. Itc do experimento M2.
2. Obter o AH da reacção de integração da curva do experimento M1 de acordo com a Equação 5.
   "Width =" 126 "/> (5)
   1. Clique no botão "Ler dados", e selecione o arquivo. Itc do experimento M1 realizada. Usando Origin, divida o traço em diferentes partes contendo um pico cada e salvar cada pico como um arquivo opj.. Abra o ficheiro correspondente ao primeiro pico, resultante do desvio da linha de base no termograma de uma única injecção M1 experimento, integrar e dividir o valor da área obtido, expresso em μcal, pela concentração final do substrato na célula da amostra, expressa em ^ M, e por o volume da célula expressa em litros, a determinação, de acordo com a Equação 5, o AH da reacção.
   2. Repetir o mesmo procedimento para o segundo pico da experiência M1 e obter um valor médio para as duas medições ÔH.
3. Determinar dQ / dt a partir do experimento M2 medindo a diferença entre a linha de base original e a nova linha de base a seguir a cada injecção. Converta o eXperimental dados para as taxas de reacção de acordo com a equação 4, utilizando o valor de entalpia obtido na experiência M1 e ajustar os dados à equação de Michaelis-Menten.
   1. A partir do programa de análise, clique no botão "Ler dados", e selecione o arquivo. Itc do experimento M2 realizada. Clique na seta de rolagem para baixo do "Arquivos do tipo" e selecione "ensaio enzimático (é?)".
   2. A caixa de diálogo Enzyme Assay abre, permitindo selecionar um dos quatro modelos. Selecione "Método 2 - só Substrato" da janela.
   3. Na janela de AH, indicam o valor de AH obtidos no passo 4.2.
   4. Clique no botão "Concentração" para verificar os valores da concentração a ser utilizada no procedimento de ajuste. Clique no botão "Tempo médio (P)". A caixa de diálogo é aberta dando a oportunidade de mudar ou aceitar o valor padrão. Este valor representa o tempo antes de cada injectarion em que as médias de instrumentos do sinal de potência para determinar o nível de energia em cada concentração de substrato. Clique em OK para confirmar o valor padrão.
   5. Clique no botão "Zero Eixo Y". O cursor se transforma em uma cruz permitindo dobrar clique em um ponto, para colocar em y = 0. Dê um duplo clique apenas antes do primeiro ponto de injeção.
   6. Clique no botão Calcular Taxa. A tarifa é representada graficamente em função da concentração de substrato, obtido pela divisão do substrato adicionado durante a titulação para o volume da célula de amostra (tendo em conta os efeitos de diluição). Esta operação dá uma curva típica de Michaelis-Menten, que pode ser montada para se obter o K e _M k _cat.
   7. Se alguns pontos devem ser excluídos, selecione o botão "Dados truncar". Mova os marcadores de dados para excluir os pontos de dados ruins e dê um duplo clique em um dos marcadores ou pressione Enter.
   8. Use a função "Fit para modelar" para ajustar a curva eobter as constantes cinéticas.

Resultados

A urease (EC 3.5.1.5; ureia amidohidrolase) é uma enzima que contém níquel multisubunit encontrado em Archea, bactérias, plantas e eucariotas unicelulares. Esta proteína actua no último passo da mineralização do azoto orgânico, que catalisam a hidrólise de ureia em amónia e carbamato, o qual se decompõe espontaneamente para dar uma segunda molécula de amoníaco e bicarbonato (Equação 6) ^12.

Discussão

Significado do ITC para estudar a atividade enzimática em relação a métodos existentes

Para além das suas aplicações clássicas para estudar equilíbrio de ligação, calorimetria de titulação isotérmica oferece um método rápido e confiável para caracterizar as reacções enzimáticas em solução usando o calor de reacção como uma sonda, sem a necessidade de modificação do sistema ou rotulagem. Os parâmetros cinéticos de k _cat e K ...

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
HEPES	Sigma	H3375	dissolving in water and adjusting pH with NaOH
TRIZMA-Base	Sigma	T1503	dissolving in water and adjusting pH with HCl
Sodium dihydrogen phosphate	Riedel-de-Haen	4270	dissolving in water
Sodium phosphate dibasic	Riedel-de-Haen	30427	dissolving in water
Urea	Sigma	U4128	dissolving in water at 40 °C
Canavalia ensiformis urease (type C-3)	Sigma	U0251	dissolving in 20 mM HEPES pH 7 and stored at -80 °C
VP-ITC on Origin 7.0	MicroCal (GE Healthcare)	SYS13901	instrument
VPViewer2000 1.30.00 on Origin 7.0	MicroCal (GE Healthcare)		data acquisition software supplied with the instrument