Горячая биологического катализа: изотермический титрования калориметрия для характеристики ферментативных реакций

Резюме

Изотермический титрования калориметрии меры теплового потока освобождены или поглощается в химических реакциях. Этот метод может быть использован для количественного фермента-катализа. В данной работе, протокол для инструментальной установки, эксперимент работает, и анализ данных, как правило, описывается, и применяется для характеризации ферментативного гидролиза мочевины Джеком бобов уреазы.

Аннотация

Изотермический титрования калориметрии (МТЦ) является хорошо описано техника, которая измеряет количество тепла, выделяемое или поглощается в ходе химической реакции, используя его в качестве неотъемлемого зонда охарактеризовать практически каждый химический процесс. В настоящее время, этот метод широко применяется для определения термодинамических параметров биомолекулярных обязательных равновесий. Кроме того, ИТЦ была продемонстрирована, чтобы иметь возможность прямого измерения кинетики и термодинамических параметров (к _{кошачьи,} К _M, ΔH) ферментативных реакций, хотя это приложение еще ​​недоиспользуются. Как изменения тепла спонтанно произойти во время ферментативного катализа, ITC не требует модификации или маркировки системы при анализе и может быть выполнена в растворе. Кроме того, способ не требует значительного количества материала. Эти свойства делают ИТЦ бесценным, мощный и уникальный инструмент для изучения ферментов кинетики в нескольких приложениях, таких как, например, лекарственных препаратов.

K _кошку и К _М ферментативного гидролиза мочевины по Canavalia ensiformis (разъем фасоль) уреазы. Расчет собственной молярной энтальпии (H) _{десятичного} реакции выполняется. Полученные таким образом значения согласуются с предыдущими данными, описанными в литературе, демонстрируя надежность методологии.

Введение

Количественное определение биохимических реакций дает представление о биологических процессах на основе жизни. Калориметрия предлагает методологию без наклеек, чтобы количественно охарактеризовать практически все химические реакции в растворе. Этот метод измеряет тепло, выделяющееся или поглощаются с течением времени, и, следовательно, универсальная система обнаружения и очень удобным методика для определения количества реагирующих молекул (например, связывающие термодинамики), а также для измерения скорости реакции (т.е. кинетику). В частности, изотермический титрования калориметрии (МТЦ) был принят в качестве метода выбора для характеристики термодинамики биомолекулярных равновесий с участием белка-лиганда, белок-белковых, ионы белково-металлические и взаимодействия белок-ДНК ^1-6. Кроме того, способность ЦМТ обеспечить кинетическую информации делает его очень мощная система для измерения ферментативного катализа, хотя потенциал этого приложения является ещенедооценивать ^7-9.

Уравнение Михаэлиса-Ментен ¹⁰ является количественное описание ферментативных реакций, так как она обеспечивает связь между скоростью реакции и концентрации субстрата, в зависимости от двух кинетических параметров: постоянных Михаэлис (К _М) и постоянных каталитического ставка (к _кот) . К _кот / отношение К _М называется в качестве каталитического эффективности фермента. На практике определение K _M и к _кот для специфической реакции обеспечивает полное описание катализа.

В типичной ферментативной реакции (рис. 1), субстратом (S) взаимодействует с ферментом (Е), образующего фермент-субстрат (ES) комплекс, который впоследствии активированного в переходном состоянии (ES *). Последний превращают в продукт с ферментом (EP) комплекса, который в конечном счете диссоциирует. Это шагс описываются следующей реакции.

(1)

где к ₁ является константа скорости образования комплекса ES, K _-1 является константа скорости диссоциации комплекса ES, в то время как к _кот каталитическая константа скорости или число оборотов.

В соответствии с уравнением Михаэлиса-Ментен ^10, скорость реакции может быть вычислена как:

(2)

в котором K _M = (K _-1 + к _кат) / K ₁ и K _кошка = V _макс / [С], с V _макс будучи максимальная скорость достигнута, когда все фермент связан с подложкой.

Изотермический калориметр титрования является прибор, используемый в этом исследовании, чтобы характеризовать ферментативный гидролиз мочевины. Этот инструмент сделан из адиабатического щита, содержащего два придуман формы клеток (рис. 1). Они соединены с внешней стороны узких трубках доступа. Образец клеток (приблизительно 1,4 мл) загружают раствора фермента, в то время как ссылка ячейки обычно заполнены водой или с растворителя, используемого для анализа. Вращающийся шприц с длинной иглой и с перемешиванием мешалкой прилагается, обычно содержащие ок. 0,3 мл раствора субстрата, установлен на ячейку для образца. Термоэлектрического устройства измеряет разницу температуры между образцом и опорной ячейки и, используя "сети обратной связи клеток", он поддерживает эту разницу в нуле путем сложения или вычитания тепло. В ходе эксперимента, подложка вводят в ферментном растворе при постоянной выбранной температуре. Когда анzymatic реакция происходит, количество тепла, выделяющегося или поглощается пропорциональна числу молекул подложки, которые преобразуются в молекулы продукта. Кроме того, скорость теплового потока напрямую связана со скоростью реакции. Измеренные данные, появляясь как отклонение теплового следа от первоначального базового уровня (рис. 1), представляют собой тепловую мощность (μcal / сек) поставляется векселю в кюветы, которая пропорциональна теплового потока, происходящего в кюветы с течением времени.

Рисунок 1. Схематическое представление изотермического титрования калориметра для изучения ферментативных реакций. Ферментативную реакцию происходит при титровании подложки (в шприц для инъекций) в ферментного раствора (в ячейку для образца) приводит к изменению термомал мощность, выделяемая калориметр, необходимой для поддержания разности температур между кюветы и постоянной ссылки на ячейку. Кликните здесь, чтобы посмотреть увеличенное изображение.

В целом, изменение тепла (Q) пропорциональна молярной энтальпии реакции (H) и числом молей продукта, генерируемого (п), который в свою очередь задается общего кратного объема концентрации:

(3)

Формирование продукт с течением времени (DP / дт), что соответствует скорости реакции, таким образом, может быть связана с количеством тепла, сгенерированного в течение того же времени (DQ / DT) через соотношением:

(4)

Согласно этому уравнению, для того, чтобы получить Михаэлиса-Ментен участок надо измерить I) общее молярное энтальпии ΔH, и б) тепловой поток DQ / дт при различных концентрациях субстрата. Как правило, это выполняется в двух различных экспериментах: в первом эксперименте (метод 1, M1), подложка вводят в ферментного раствора и теплота для полной конверсии субстрата измеряется; во втором эксперименте (метод 2, М2), неоднократно получавших инъекции подложки выполняются и скорость образования тепла измеряется в разных концентрациях субстрата. Эти два набора данных достаточно, чтобы получить кинетические параметры К _М и к _{кошачьи.}

В настоящей статье, общий протокол для определения кинетических параметров для ферментативных реакций, выполняемых с помощью ITC описывается. Мы применили этот метод для гидролиза мочевины на Canavalia ensiformis мочевинысебе, как система отсчета. Хорошее согласие между результатами, полученными с помощью этого метода и данных, представленных в литературе свидетельствует о надежности такого подхода.

протокол

1. Подготовка Образцы

1. Подготовка 2 мл раствора фермента и 0,5 мл раствора субстрата для каждого экспериментального пробега. Развести концентрированные растворы фермента и субстрата в буферных растворах, имеющих одинаковую композицию, чтобы минимизировать тепло разбавления и смешивания в течение подложки дополнительно.
   1. Выберите условия буфера, адекватные по предотвращению изменения рН в ходе эксперимента. Например, 20 мМ HEPES рН 7 является достаточным для измерений при нейтральном рН.
      Примечание: Если протонного обмена участвует, протонирования энтальпии используемых буферов следует рассматривать, так как они влияют на измеренную ΔH реакции. Возможные конкретные эффекты буфера или молекул добавок на рассматриваемой системы анализа должны быть приняты во внимание. Если органические растворители (например, ДМСО) включены в ферментного раствора, добавить их в одно и то же концентрации в раствор субстрата.
   2. Для эксперимента M1, начатьс концентрации фермента в диапазоне нМ (например 1 нМ) и с концентрацией субстрата, по крайней мере на три порядка выше, чем концентрации фермента и над K _М.
   3. Для эксперимента М2, начните с концентрации фермента в диапазоне PM-нм (например, 15 часов). Концентраци субстрата в шприце находится в диапазоне мМ (например, 400 мм).
      ПРИМЕЧАНИЕ: В одной инъекции M1 эксперимента, концентрация должна быть адекватной для достижения полной конверсии субстрата в продукт в течение времени эксперимента. Таким образом, концентрация фермента зависит от скорости ферментативной: если ферменты с низкой K _кошки находятся в стадии изучения, более высокие концентрации фермента (до 10 мкм) должны быть использованы. С другой стороны, концентрации фермента, используемой в эксперименте M2 должен гарантировать, что подложка вводили лишь незначительно (менее 5%) потребляется и что реакция фермента протекает в стационарном состоянии. По этой причине, чем вышеЭффективность фермент, тем ниже требуется концентрация фермента. В конце эксперимента, концентрация субстрата в ячейку для образца должна быть выше, чем K _M.
2. Тщательно проверьте фермента и концентрации субстрата с соответствующим аналитической процедуры (например поглощению при 280 нм, колориметрических, BCA анализов ^11. Это необходимо для получения точной и достоверной расчет термодинамических и кинетических параметров.
3. Измеряют рН растворов и проверки того, что рН несоответствие как фермента и субстрата решений является минимальным в условиях эксперимента (± 0,05 единицы рН).

2. Проведения эксперимента

Примечание: Та же процедура должна применяться как для M1 и M2 эксперимента, которые исполняются один за другим.

1. Убедитесь, что образец клеток и инъекции шприц убираются в соответствии с производителеминструкции. Заполните загрузки шприц, снабженный прибором с дистиллированной водой, осторожно ввести иглу в кюветы, заполнить ячейку и удалить жидкость, используя тот же шприц. С помощью этого метода, мыть кюветы дважды дистиллированной водой и дважды буфером.
2. Загрузить кюветы с 2 мл раствора фермента с использованием загрузки шприц, тщательно избегая образования пузырьков воздуха. Медленно вводить раствор в клетку, пока она не выливается в верхней части стволовых клеток. Произведите рывок ок. 0,25 мл раствора в клетку. Повторите два раза. Этот шаг снимает пузырьки воздуха в ловушке в кюветы.
3. Поместите иглу загрузки шприца на выступе между стволовых клеток и клеточной порта и удалите излишки раствора.
4. Запустите программу VP-просмотра и, с компьютерным интерфейсом, уравновесить инструмент ITC до температуры 3 ° С ниже желаемой температуры опыта. Это необходимо, чтобы избежать длинный уравновешиваниепериоды до эксперимента, в связи с пассивной инструментального устройства охлаждения.
5. Заполните опорную ячейку с дистиллированной водой с той же процедурой выше. Когда буферы с высокой ионной силы или высокой осмоляльности в растворе образца, таким же буфер должен быть использован в качестве контрольного раствора.
6. Ссылка пластмассовый шприц с загрузочной порту шприц для инъекций, с помощью тонкой силиконовой трубки. Заполните инъекционный шприц размещения кончика иглы в воду и составление, пока вода не выходит из верхней порта наполнения, указывая, что инъекции шприц заполнен. Затем переместите кончик шприца из воды и составить воздух, чтобы очистить инъекционный шприц. С помощью этой процедуры, промывают инъекционный шприц с буфером и втягивать воздух через систему. Затем поместите инъекционную иглу в узком пробирку, содержащую 0,5 мл субстратного раствора, тщательно разработать и полностью заполнить инъекционный шприц, в результате чего небольшое количество раствора в нижней части трубки.
7. Скомпьютерный интерфейс, нажмите "Закрыть заполнения порт". Снимите кремния загрузки трубку. Нажмите кнопку "Очистить и пополнить" кнопку, чтобы разрешить инъекции шприц, чтобы выбить пузырьки воздуха и изгнать их обратно в объеме раствора. Повторите два раза.
8. Перемещение инъекционный шприц, протирать по бокам, чтобы удалить любые капли и разместить иглы инъекционного шприца в ячейку для образца.
9. На компьютере, установить соответствующие параметры текущих. Экспериментальный фермент и концентрации субстрата может быть указано.
   1. В эксперименте M1, установлен по крайней мере два дополнения (5-30 мкл) субстрата для проверки воспроизводимости результатов. Установка времени расстояние между каждой инъекции (например, 1000 сек) достаточно большим, чтобы гарантировать, что сигнал возвращается тепло к базовой линии до следующей дополнение.
   2. В эксперименте М2, ​​установить несколько (например, 15 х 5-10 мкл) инъекции. Установить интервал между инъекциями (например 180 сек) позволяет системе сtabilize тепловую мощность на новый базовой линии после каждой инъекции.
      Примечание: время интервал между инъекциями в эксперименте M2 должен быть достаточно коротким, чтобы избежать превращение значительного количества субстрата, позволяя измерения должны быть выполнены в стационарных условиях.
   3. В эксперименте М2, ​​использовать небольшие объемы (например, 2 мкл) для первой инъекции, чьи соответствующее значение отбрасывается в ходе последующего анализа данных. Действительно, это часто представляет артефакты из-за исходного субстрата диффузии через наконечник шприца, и на присутствие воздушных пузырьков, захваченных в иглу шприца.
   4. Установите опорную мощность, примерный уровень, в котором базовый будут размещены перед реакцией начинается, при значении 20. Затем определите экспериментальную фермента и концентрации субстрата и выбрал имя для эксперимента.
   5. Определение температуры опыта, обычно при 25 ° С ИТЦ позволяет рабочие температуры между 2 ° C и 80 ° C. Эксперимент готов для запуска. Нажмите кнопку "Пуск", чтобы начать эксперимент.
10. После того, как эксперимент завершен, очистить кюветы и шприц в соответствии с инструкциями изготовителя.
11. Повторите эксперимент по крайней мере, один или два более раз, чтобы проверить воспроизводимость данных.

3. Анализ данных

1. Из программы анализа, нажмите на кнопку "Читать данные", и перейдите к папке, где лежит. ITC файл из выполненных эксперимента М2 находится. Нажмите на свиток со стрелкой вниз на "Тип файлов" и выберите "ферментный анализ (ли?)". Впоследствии нажмите и откройте. ITC файл эксперимента М2.
2. Получение ΔH реакции с интегрированием кривой эксперимента М1 в соответствии с уравнением 5.
   "Ширина =" 126 "/> (5)
   1. Нажмите на кнопку "Считать данные", и выберите файл. КВТ выполненной эксперимента M1. Использование Происхождение, разделите свой след в различных частях, содержащих один пик каждый и сохранить каждый пик качестве. Файл OPJ. Открыть файл, соответствующий первому пику, в результате чего по сравнению с исходными отклонения в термограмме единой инъекции M1 эксперимента, интегрировать его и разделить полученное значение площади, выраженное в μcal, в конечной концентрации субстрата в ячейку для образца, выраженный в мкМ, и по объему клеток выраженный в литрах, определение, в соответствии с уравнением 5, в ΔH реакции.
   2. Повторите ту же процедуру для второго пика эксперимента M1 и получить среднее значение для двух измерений ΔH.
3. Определить DQ / ТД из эксперимента М2 измерения разности между исходной базовой линии и новой базовой линии после каждого впрыска. Преобразование еxperimental данных на скорост х реакции в соответствии с уравнением 4, используя значение энтальпии, полученных в эксперименте M1 и соответствуют данные в уравнение Михаэлиса-Ментен.
   1. Из программы анализа, нажмите на кнопку "Читать данные", и выберите файл. КВТ выполненной эксперимента М2. Нажмите на свиток со стрелкой вниз на "Тип файлов" и выберите "ферментный анализ (ли?)".
   2. Откроется диалоговое окно ферментного анализа, что позволяет выбрать один из четырех моделей. Выберите "Метод 2 - только подложка» из окна.
   3. В окне ΔH, указывают величину ΔH, полученного на стадии 4.2.
   4. Нажмите кнопку "Концентрация" для проверки значений концентрации, которые будут использоваться в процессе подбора. Нажмите кнопку "Среднее время (Р)". Откроется диалоговое окно дает возможность изменить или принять значение по умолчанию. Это значение представляет собой время перед каждым Injectионный, в котором прибор усредняет мощность сигнала, чтобы определить уровень мощности, на каждой концентрации субстрата. Нажмите ОК для подтверждения значения по умолчанию.
   5. Нажмите кнопку "Нулевой Ось Y". Курсор превращается в перекрестие, позволяющей дважды щелкните точку, разместить у = 0. Двойной щелчок непосредственно перед первой точки впрыска.
   6. Нажмите кнопку Рассчитать Оценить. Оценить строили графики зависимости концентрации субстрата, полученных путем деления субстрат добавляется в результате титрования для объема ячейки образца (с учетом эффектов разбавления). Эта операция дает типичный Михаэлиса-Ментен сюжет, который может быть установлен, чтобы получить К _М и К _кошку.
   7. Если некоторые пункты должны быть удалены, нажмите кнопку "Обрезать данных". Перемещение маркеров данных, чтобы исключить отрицательные моменты данных и дважды щелкните на одном из маркеров или клавишу ВВОД.
   8. Используйте функцию "Fit для моделирования", чтобы соответствовать кривой иполучить кинетических констант.

Результаты

Уреаза (ЕС 3.5.1.5; мочевины amidohydrolase) является мультисубъединичный никельсодержащих фермент, обнаруженный в Archea, бактерий, одноклеточных эукариот и растений. Этот белок действует на последней стадии минерализации органического азота, катализирующие гидролиз мочевины до аммиака и карбам...

Обсуждение

Значение МТЦ изучить ферментативную активность по отношению к существующим методам

В дополнение к его классических приложений для изучения связывания равновесий, изотермического титрования калориметрии обеспечивает надежный и быстрый метод для характерис?...

Материалы

Name	Company	Catalog Number	Comments
HEPES	Sigma	H3375	dissolving in water and adjusting pH with NaOH
TRIZMA-Base	Sigma	T1503	dissolving in water and adjusting pH with HCl
Sodium dihydrogen phosphate	Riedel-de-Haen	4270	dissolving in water
Sodium phosphate dibasic	Riedel-de-Haen	30427	dissolving in water
Urea	Sigma	U4128	dissolving in water at 40 °C
Canavalia ensiformis urease (type C-3)	Sigma	U0251	dissolving in 20 mM HEPES pH 7 and stored at -80 °C
VP-ITC on Origin 7.0	MicroCal (GE Healthcare)	SYS13901	instrument
VPViewer2000 1.30.00 on Origin 7.0	MicroCal (GE Healthcare)		data acquisition software supplied with the instrument