Étudier les protéines prions comme épandage et la toxicité de l&#39;utilisation des Métazoaires organisme modèle<em&gt; C. elegans</em

Résumé

Prion-like propagation of protein aggregates has recently emerged as being implicated in many neurodegenerative diseases. The goal of this protocol is to describe, how to use the nematode C. elegans as a model system to monitor protein spreading and to investigate prion-like phenomena.

Résumé

Prions are unconventional self-propagating proteinaceous particles, devoid of any coding nucleic acid. These proteinaceous seeds serve as templates for the conversion and replication of their benign cellular isoform. Accumulating evidence suggests that many protein aggregates can act as self-propagating templates and corrupt the folding of cognate proteins. Although aggregates can be functional under certain circumstances, this process often leads to the disruption of the cellular protein homeostasis (proteostasis), eventually leading to devastating diseases such as Alzheimer’s disease (AD), Parkinson’s disease (PD), Amyotrophic lateral sclerosis (ALS), or transmissible spongiform encephalopathies (TSEs). The exact mechanisms of prion propagation and cell-to-cell spreading of protein aggregates are still subjects of intense investigation. To further this knowledge, recently a new metazoan model in Caenorhabditis elegans, for expression of the prion domain of the cytosolic yeast prion protein Sup35 has been established. This prion model offers several advantages, as it allows direct monitoring of the fluorescently tagged prion domain in living animals and ease of genetic approaches. Described here are methods to study prion-like behavior of protein aggregates and to identify modifiers of prion-induced toxicity using C. elegans.

Introduction

Beaucoup de maladies neurodégénératives, dont la maladie d'Alzheimer (MA), la maladie de Parkinson (PD), la sclérose latérale amyotrophique (SLA), et les encéphalopathies spongiformes transmissibles (EST), sont associés à des protéines d'agrégation sujette et sont donc collectivement connus comme mauvais repliement des protéines troubles (PMD ). EST ou maladies à prions constituent une classe unique de PMD en ce qu'ils peuvent être infectieux chez les humains et les animaux ^1. Au niveau moléculaire, les prions répliquent par le recrutement et la conversion de monomère α-hélice riche PrP cellulaire codée par l'hôte (PrP ^C) dans le pathologique β-feuille riche PrP ^Sc conformation ^2,3. agrégats auto-propagation protéines ont également été identifiés dans les champignons, qui partagent des caractéristiques importantes des prions de mammifères ^4,5. En outre, les prions de mammifères sont capables de se déplacer de cellule à cellule et infectent les cellules naïves ^6,7.

Alors que PMD OTHer que les EST ne sont pas infectieux, ils partagent un principe pathogène commun avec les maladies à prions ^8,9. Bien que les protéines liées à chacun des PMD ne sont pas liés dans la structure ou la fonction, ils tous les agrégats de formulaire via un processus de cristallisation comme appelés nucléé ou la polymérisation ensemencées; ailleurs semences protéiques grandir en recrutant leurs isoformes solubles ^2,10,11. L'efficacité de l'auto-propagation in vivo varie, en fonction des propriétés intrinsèques de la protéine, qui, avec d'autres facteurs cellulaires tels que les chaperons moléculaires finalement déterminer les taux de nucléation agrégat, l'ensemencement, la fragmentation et la diffusion de ^{12 à 15.} Par conséquent, il doit exister un juste équilibre entre ces facteurs qui permet la propagation efficace de l'agrégation des protéines. Cela pourrait aussi expliquer pourquoi seuls certains agrégats amyloïdogéniques abritent les caractéristiques d'un prion, et donc tous les PMD sont infectieux. Prions semblent représenter l'o 'top-interprètesfa large éventail d'agrégats protéiques auto-réplication, qui en fait un outil puissant pour étudier PMD ^8,13.

Curieusement, la toxicité associée aux agrégats liés à la maladie a souvent un composant non cellulaire autonome ^16,17. Cela signifie qu'ils affectent des cellules voisines qui ne expriment pas le gène correspondant, par opposition à un effet strictement cellule autonome, ce qui implique que seules les cellules exprimant le gène présentent le phénotype spécifique. Cela a été démontré de façon convaincante par l'expression spécifique d'un tissu ou d'abattre les protéines respectives dans de nombreux modèles de maladies neurodégénératives ^18-26. Divers mécanismes ont été suggérés comme une base pour cette toxicité autonome non-cellule dans les PMD, y compris l'approvisionnement en éléments nutritifs diminué, déséquilibre dans la signalisation neuronale, excitotoxicité du glutamate et neuroinflammation ^16,27,28. En outre, un mouvement de prion comme des agrégats de maladies liées entre cellules MIGHt contribuer à cet aspect ^29,30. Des preuves croissantes suggèrent que les protéines autres que les inclusions peuvent transmettre prions de cellule à cellule, ce qui peut expliquer la propagation de la caractéristique de la pathologie observée dans de nombreux PMD ^30-36. Cependant, il n'a pas encore été déterminé se il existe un lien de causalité évident entre le mouvement intercellulaire de protéines de la maladie et l'effet toxique sur les cellules voisines. Par conséquent, une meilleure compréhension des voies cellulaires qui sous-tendent la transmission de cellule à cellule et la toxicité cellulaire non autonome est nécessaire et essentiel pour le développement de nouveaux produits thérapeutiques. Cependant, de nombreux aspects de prion-like facteurs d'étalement et cellulaires qui influencent la transmission des protéines mal repliées de cellule à cellule dans métazoaires ne sont pas bien comprises, en particulier au niveau de organismal.

Le nématode Caenorhabditis elegans a plusieurs avantages qui fournissent le potentiel de découvrir de nouvelles facettes de prion-like spreading chez les métazoaires ^17. Il est transparent, ce qui permet le suivi in vivo de protéines par fluorescence marqués dans l'organisme vivant. En outre, de nombreux processus cellulaires et physiologiques touchées par la maladie sont conservés des vers pour la santé humaine, et C. elegans est également prête à une grande variété de manipulations génétiques et les analyses moléculaires et biochimiques ^{de 37 à 39.} Exactement 959 cellules somatiques constituent l'hermaphrodite adulte avec un plan de corps simple qui a encore plusieurs types de tissus distincts, y compris musculaires, les neurones et l'intestin.

Pour établir un nouveau modèle de prion en C. elegans, nous avons choisi d'exprimer la glutamine exogène / asparagine bien caractérisés (Q / N) riche prion domaine NM de la protéine cytosolique levure prion Sup35, car il n'y a pas de protéines prions endogènes connus vers ^4,40. prions de levure ont été inestimables pour élucider les mécanismes de base de la réplication du prion ^41-44. En outre, NM est le sapinst cytosolique protéine prion-like qui a été montré pour récapituler le cycle de vie complet d'un prion dans la culture de cellules de mammifères ^45,46. De même, lorsqu'il est exprimé dans C. elegans, le domaine de prion Sup35 adoptée remarquablement bien aux différentes exigences pour la propagation dans les cellules de métazoaires par rapport à des cellules de levure et les principales caractéristiques exposées de la biologie du prion agrégation ^40. NM a été associée à un phénotype toxique profonde, y compris la perturbation de l'intégrité mitochondriale et l'apparence de diverses vésicules autophagie liés au niveau cellulaire, ainsi que l'arrestation embryonnaire et larvaire, retard de développement, et une perturbation généralisée de l'environnement de repliement des protéines au niveau de organismal. Étonnamment, le domaine de prion cellulaire présente une toxicité cellulaire autonome et non autonome, affectant les tissus avoisinants, dans lequel le transgène ne est pas exprimé. En outre, le transport vésiculaire du domaine des prions dans et entre les cellules est surveillée en temps réel in vivo ^40.

Nous décrivons ici comment examiner prion-like diffusion en C. elegans. Nous allons vous expliquer comment surveiller le transport intra et intercellulaire de vésicules contenant le domaine de prion utilisant time-lapse microscopie à fluorescence. Nous mettrons l'accent sur l'utilisation de capteurs de pliage tissu-spécifiques et exprimée de manière ubiquitaire journalistes de stress pour évaluer les effets cellulaires autonomes cellules autonomes et non sur la forme physique cellulaire. Enfin, nous allons décrire la procédure d'un écran récemment effectué du génome grande interférence ARN (ARNi) pour identifier de nouveaux modificateurs de la toxicité induite par le prion. En combinaison, ces méthodes peuvent aider à démêler les voies génétiques impliquées dans le mouvement intercellulaire de protéines et de leur toxicité autonome non cellulaire.

Protocole

1. Surveillance transcellulaire épandage des protéines à prions comme par In Vivo imagerie time-lapse

NOTE: Cultivez C. elegans de type sauvage (WT) (N2) et lignées transgéniques selon des méthodes standard et de contrôler attentivement la température de la culture ^47.

1. Générer des lignées transgéniques de C. elegans exprimant la protéine prion-like, marqués avec la protéine fluorescente rouge monomère (RDRF). Regardez cette vidéo qui montre comment utiliser la micro-injection ^48. Pour plus de détails et les méthodes décrivant comment intégrer ces lignes extrachromosomiques, voir ^49.
2. Préparer populations synchronisés par ponte ou de blanchiment selon les méthodes standard ^50.
   1. Synchronisation par la ponte
      1. Transfert 10-20 adultes gravides sur une plaque et les laisser pondent des œufs pour les 1-2 heures. Retirer les adultes de la plaque et laisser la descendance grandir jusqu'à l'âge désiré.
   2. Synchronisation par le blanchissement
      1. Recueillir une population non synchronisé des adultes gravides et de les blanchir avec une solution alcaline d'hypochlorite (NaOH 250 mM et 1: 4 (v / v) la dilution d'eau de Javel commerciale en H ₂ O). Lavez les œufs deux fois (218 g pendant 1 min) avec le tampon M9 ⁴⁷ (21 MMNA ₂ HPO ₄ · 7H ₂ O, 22 mMKH ₂ PO _4, 86 mMNaCl, une mMMgSO ₄ · 7H ₂ O, ajoutez dH ₂ O jusqu'à 1 L).
      2. Permettez-leur d'éclore dans un tampon M9 avec agitation douce O / N à 20 ° C. le développement de Worm arrêtera au stade L1 en l'absence d'une source de nourriture, laissant une population synchronisée. Transfert N1 sur frais nématodes croissance médias (NGM) plaques ensemencées avec OP50 E. coli et bactéries permettent de développer la descendance jusqu'à ⁴⁷ l'âge désiré.
3. Préparer tampons d'agarose à 2% (en H ₂ O) sur une lame de microscope ⁵⁰ comme décrit.
   1. Préparer deux kmdiapositives croscope avec du ruban d'étiquetage placé sur toute leur longueur à être utilisés comme entretoises. Placez tiers lame de microscope entre eux.
   2. Dissoudre 2% d'agarose en H ₂ O et une pipette goutte sur la lame propre.
   3. Placez quart diaporama perpendiculaire aux trois autres diapositives sur le dessus de la chute agar. Appuyez doucement sur pour aplatir le pad pour la même épaisseur que la bande d'étiquetage.
   4. Laissez sécher pendant 1 min avant de retirer les entretoises et en tirant doucement les lames dehors. Le pad agar se en tiendra à l'un d'eux.
4. Introduire à la pipette 10 ul ~ anesthésique (2 lévamisole mM dans du tampon M9) sur le tampon et le transfert ~ 10 animaux en utilisant une pointe de fil de platine. Couvrir avec une lamelle (~ 22 x 22 mm) et de prendre des images dans une heure.
5. Alternativement, d'acquérir des films sur une période de temps plus ou pour réduire davantage la possibilité de tout mouvement des animaux, utiliser une combinaison d'anesthésique et le talon ⁵¹ immobilisation.
   1. Préparer 10% agatampons rose (dans du tampon M9) comme décrit ⁵¹ ajouter et vers solution à 3 ul de standards de taille de nanosphères (billes de polystyrène, de 100 nm) plus 3 ul d'anesthésie (4 lévamisole mM dans du tampon M9). Couvrir délicatement avec une lamelle. Pour éviter la dessiccation, sceller la lamelle avec valap (mélange de quantités égales de la vaseline, de la lanoline, la cire de paraffine).
6. Image en immobilisée vers l'utilisation d'un microscope confocal.
   NOTE: Les résultats sont obtenus en utilisant un disque Spinning AF microscope confocal équipé d'une caméra EM-CCD et un logiciel Microscopie Automation & Analyse d'image tels que MetaMorph et décrivent les détails ci-dessous, mais d'autres systèmes d'imagerie confocale comparables peuvent également être utilisés.
   1. Utilisez l'objectif 63X ou 100X / 1.4NA pétrole et placer la lame de microscope contenant des vers dans le support de lame de microscope.
   2. Ouvrez le logiciel. Régler la puissance du laser et des filtres pour l'imagerie mRFP. Utilisez le laser 561 nm à 10% de la puissance et l'émission filtre> 600 nm.
   3. Ouvrir "MultiDimensional acquisition». Sous l'onglet "Principal", cochez les cases pour "Timelapse» et «Run Journals" (Hardware Auto Focus: off).
   4. Sous l'onglet "Enregistrement" sélectionner ou créer le dossier du répertoire où les fichiers doivent être sauvegardés. Attribuez un nom au fichier.
   5. Sous l'onglet "Wave Longueur" sélectionnez l'éclairage approprié et ajuster l'exposition et gain. Utiliser "YokoQuad Red" (ou un réglage d'éclairage pour l'imagerie mRFP équivalent) avec une exposition entre 100 et 300 ms et un gain de la caméra entre 100 et 300, en fonction de l'échantillon individuel (évaluée en utilisant l'image en direct).
   6. Sous l'onglet «Timelapse», sélectionnez «Nombre de points de temps" = 301, "Durée" = 5 min et "Durée / Intervalle" = 1 sec.
   7. Dans le cadre du "Journaux" Sélectionnez l'onglet Journal: "AFC SET Z HOLD" et "AFC retour à Z HOLD", Type: &# 8220; spécial "(deux fois), point de départ:" Début de l'heure le point "et" Fin de point de temps. " Cette option de mise au point est important pour l'image de la même section sur une période de temps plus longue.
   8. Lorsque l'installation est terminée, appuyez sur "Acquérir". La vidéo timelapse est Safed sous forme de fichiers TIFF séparés.
   9. Ouvrez tous les fichiers .tiff d'une série de temps donné dans ImageJ. Allez à "Image" → "Stacks" → "Images à Stacks". Eventuellement, régler la luminosité et le contraste, ajouter une barre de taille, etc. exporter le film dans "Fichier" → "Enregistrer sous" → "AVI ..." (pour un exemple, voir la vidéo 1 et 2 correspondant à la figure 1).

2. Utilisation de capteurs pliants et Reporters stress d'enquêter cellulaire autonome et non cellulaire autonome affecte sur protéostasie et toxicité

1. Générer des lignées transgéniques qui coexprimer un capteur de pliage ou de stress reporter avec la protéine prion-like. Pour les méthodes sur la façon d'établir des croix ou de générer des lignées transgéniques, voir ^48,49,52. Voir le tableau 1 pour une liste de C. elegans souches qui peuvent être utilisées.
2. Préparer populations synchronisées d'animaux transgéniques et de les cultiver jusqu'à l'âge désiré comme décrit ci-dessus (section 1.2) ^50.
3. L'utilisation d'un stéréomicroscope, d'examiner le phénotype du capteur respectif de pliage ou de stress reporter.
   1. Pour le capteur de pliage, de déterminer le nombre d'animaux hébergeant agrégats de chaque jour après la synchronisation (pour un exemple, voir la figure 2E et F).
   2. Pour le journaliste de stress, test si la co-expression des résultats de protéines prion-like dans une fluorescence accrue de la journaliste (pour un exemple, voir la figure 3).

3. Écran d'échelle du génome pour la répression de la toxicité induite Prion-en C. elegans

Figure 4. Représentation schématique du protocole de dépistage ARNi. Voir la section 3 du protocole pour une description détaillée des étapes individuelles.

1. Synchronisation de C. vers elegans et le dédoublement de la bibliothèque de l'ARNi
   1. Pour l'écran ARNi, utiliser la bibliothèque Ahringer ARNi (ou la bibliothèque Vidal ARNi) ^53,54. Rearray la bibliothèque de l'ARNi 384 format bien d'origine dans des plaques 96 puits en remplissant les plaques avec 100 ul de milieu LB-amp (50 ug / ml d'ampicilline dans LB) supplémenté avec 10% de glycerol et inoculer en utilisant un réplicateur à 96 broches. Croître à 37 ° CO / N avec agitation et conserver à -80 ° C.
   2. Maintenir C. elegans WT et lignées transgéniques à 20 ° C sur des plaques NGM ensemencées avec OP50 E. bactéries coli selon des procédés standard ^47.
   3. Synchronisez le domaine de prion transgénique et WT (contrôle) nématodes par le blanchiment (voir section 1.2).
   4. Le même jour que les vers sont blanchies, préparer milieu LB additionné de 50 ug / ml d'ampicilline. Utilisez un distributeur de réactif automatisée à distribuer (ou d'une pipette manuelle) 65 pi des médias LB-ampères dans chaque puits d'une plaque de 96 puits.
   5. Retirer 96 des plaques de bibliothèque Ahringer ARNi de -80 ° C et les amener à une hotte stérile avec des serviettes en papier. Immédiatement retirer le joint-bande en maintenant la plaque à l'envers pendant plaques sont encore gelés, prenant soin d'éviter la contamination de la glace à l'extérieur des plaques. Reinvert les plaques et laissez-les décongeler pendant environ 30 min.
   6. Trempez une stérile 96 broches réplicateur dans une plaque bibliothèque ARNi, puis dans une plaque LB-ampères frais. Utilisez un réplicateur frais stérile pour chaque plaque. Sceller toutes les plaques avec du papier adhésif et retourner les plaques de la bibliothèque à -80 ° C. Les réplicateurs peuvent être trempées dans l'eau de Javel, rincées,et passé à l'autoclave pour être utilisé à nouveau.
   7. Permettre plaques ARNi doubles de croître O / N dans un incubateur réglé à 37 ° C et 300 rpm. Pour utiliser HT115 E. coli bactéries hébergeant le vecteur vide (L4440) comme témoin, se développent séparément dans un tube de culture puis pipeter 65 pi de la culture avec une pipette multicanaux en quart de deux plaques à 96 puits.
2. Induction de la production bactérienne ARNdb et l'ajout de vers
   1. Diluer isopropyl-β-D-thiogalactopyranosid (IPTG) à une concentration de 5 mM dans ddH ₂ O. Utilisez un poste de travail automatisé avec une tête multicanal à distribuer (ou une pipette manuelle) 10 pi de IPTG dilué dans chaque puits des bactéries ARNi et les plaques de contrôle. Refermer et placer les plaques de nouveau dans l'incubateur. Qu'ils tremblent pendant 3 heures à 37 ° C.
   2. Alors que les bactéries sont tremblaient, préparer les vers. Mélanger le / ver suspension M9 bien, et la pipette un petit échantillon (~ 5-10 pi) sur une lame de microscope en verre. Compterle nombre de vers sous un stéréomicroscope et de calculer le nombre de vers par ul.
   3. En utilisant une technique stérile, préparer une solution de M9 supplémenté (M9 +) avec les concentrations finales suivantes: 0,20 mg / ml d'IPTG, 8,0 ug / Cholestérol ml, 50 pg / ml d'ampicilline, 9,6 pg / ml de tetracycline, 0,0835 ug / ml de Fungizone, et 15 vers par 50 ul.
      1. Faire des solutions séparées pour le domaine de prion transgénique et les vers WT. Le volume final de la solution de ver M9 + nécessaire dépendra du nombre de plaques ARNi copiés (voir ci-dessous), plus ~ 30 ml de volume mort qui restera dans le réservoir, si un distributeur automatique est utilisé.
   4. Après l'induction de 3 h de la production bactérienne ARN double brin, prendre les plaques de l'incubateur et laisser refroidir à température ambiante (~ 30 minutes) pour éviter la chaleur soulignant les animaux.
   5. Distribuer M9 + solution de ver transgénique de domaine prion de 50 ul à chaque puits des plaques ARNi et l'une des plaques de lutte antivectorielle vides. FaireAssurez-vous de mélanger la solution à vis sans fin, avant chaque étape que les animaux ont tendance à sédimenter au fond du réservoir.
   6. Distribuer vers WT dans la seconde plaque de commande. Laissez les plaques non scellées pour permettre l'aération. Pour garder la culture liquide de se évaporer, empiler 4-5 plaques ensemble et enveloppez-les avec une serviette en papier humide et une feuille d'aluminium. Incuber à 200 tours par minute à 20 ° C pendant 4 jours.
3. Points
   NOTE: Après 4 jours dans l'incubateur, les vers seront à la deuxième journée de l'âge adulte et sont prêts à l'écran. Laissez les animaux à se adapter à des conditions non secousse pendant 30 min avant de dépistage pour se assurer volée sans être dérangé.
   1. L'utilisation d'un appareil Falcon 4M60 connecté à un ordinateur avec un moniteur, écran visuellement augmenté volée par rapport aux témoins traités domaine prion animaux transgéniques.
   2. Dresser une liste de hits préliminaires pour confirmer utilisant wrMTrck (voir la section suivante).

4. Confirmation de préliminaireVisites écran

1. Motilité test sur des plaques solides
   1. Préparer des plaques NGM avec supplémenté avec 100 ug / ml d'ampicilline, 12,5 ug / ml de tetracycline et 1 mM d'IPTG, selon des procédés standard ^47. Si possible, utilisez une machine en forme de plaque de coulée pour assurer toutes les plaques ont la même hauteur des médias, ce qui permettra un processus d'acquisition vidéo plus simple.
   2. Cultiver les différents clones d'ARNi dans ~ 1 ml de LB + 50 ug / ml d'ampicilline, O / N à 37 ° C et 250 tours par minute.
   3. Le lendemain, induisent l'expression de l'ARN double brin avec IPTG 1 mM pendant 3 heures. Ensemencer les plaques avec 150 pi de chaque clone bactérien ARNi, répartis dans une couche mince. Que les bactéries sèches pendant 2 jours à la température ambiante dans l'obscurité. Préparer 3 plaques par ARNi clone.
   4. Synchroniser la population du ver par blanchiment selon des méthodes standard ⁵⁰ (voir section 1.2), et de laisser les œufs éclosent O / N dans des milieux M9.
   5. Prélever un échantillon de la suspension de vis sans fin et déterminer le montant de nematodes par ul à la loupe binoculaire. Puis, une pipette le bon volume de M9 ainsi vers dans chaque plaque expérimentale de sorte qu'il contient 25 à 30 vers L1. Cultivez les nématodes à 20 ° C pendant quatre jours jusqu'à ce que les vers atteignent deux jours de l'âge adulte.
2. L'analyse quantitative de ver motilité avec le plugin pour ImageJ wrMTrck
   REMARQUE: Les vidéos ont été enregistrés en utilisant un stéréomicroscope à un grossissement de 10X avec un Hamamatsu Orca-R2 appareil photo numérique C10600-10B et le logiciel d'imagerie PCI simple Hamamatsu.
   1. Allumez l'appareil photo et le logiciel d'imagerie PCI simple. Cliquer sur "direct" pour permettre le réglage des conditions de formation d'image.
   2. Mettre en place les conditions vidéo comme suit: Gain = 0; Mode Voyant = haut; Indice de vitesse = 1; Binning = 2. Cliquez sur «Exposer Auto», puis ajuster les conditions d'éclairage, le déplacement des miroirs de microscope et la luminosité et le contraste cadrans.
      REMARQUE: La vidéo doit avoir un contraste élevé sans être EXPOSED, de sorte que les animaux affichent comme des formes noires sur un fond clair.
   3. Cliquez sur "Scan Time" et choisissez un dossier et un nom de fichier. Réglez "Champ Delay" à 20 ms et "Arrêtez-vous à l'heure" à 30 sec. Appuyez sur "Revoir Live" pour choisir la zone de la plaque d'enregistrer (où la plupart des vers sont). Appuyez sur la plaque 3 ou 4 fois sur la scène, rapidement confirmer sa position dans le champ de vision et appuyez sur "Démarrer".
   4. Après le film a fini d'enregistrer, cliquez droit sur l'image et choisissez "Exporter Montage Séquence" pour exporter le film d'un format à un .cxd .avi.
3. L'analyse des vidéos de la motilité
   1. Ouvrez le logiciel ImageJ, allez dans l'onglet "Plugins", puis "wrmtrck" et sélectionnez "Batch wrMTrck". Sélectionnez le répertoire contenant tous les fichiers à analyser.
   2. Dans la fenêtre de wrMTrck_Batch d'entrée principale, charger les valeurs d'entrée comme détaillé dans Figure 5C. Explication pour chacun des paramètres peut être trouvée dans les instructions qui accompagnent le plugin. Cliquez sur "OK" et laisser l'analyse du mouvement terme.
   3. Pour prendre soin des résultats et de confirmer que toutes les pistes sont détectées à partir réelle C. elegans et éliminer les artefacts, ouvrir chacun des fichiers .txt créés pour chaque film et de copier les informations dans un fichier de logiciel d'analyse de données. Ouvrez les "*" _labels.zip fichiers créés et exécutez le résultat "* _labels.tif" pour vérifier et éliminer les pistes de vers de fausses manuellement.

Résultats

Suivi intercellulaire propagation de protéines prion-like in vivo par imagerie time-lapse

Transgénique C. elegans lignes exprimant le domaine des prions sont particulièrement bien adaptées pour l'analyse de certains aspects de protéines prions en forme, par exemple, la transmission de cellule à cellule et la toxicité non autonome cellulaire. La transparence des animaux permet un suivi de fluorescence protéines marquées au sein de l'...

Discussion

Les procédés décrits ici permettent d'illustrer la propagation cellulaire et la toxicité de la cellule autonome et non autonome complexe de protéines prion-like. Nous avons récemment découvert que un domaine prion cytosolique agrégation sujette est repris dans des vésicules membranaires dans un processus d'autophagie liés. Un sous-ensemble spécifique de ces vésicules transporte le domaine de prion dans et entre les cellules et les tissus ^40. La clé pour contrôler leur mouvement dans l...

matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
Reagent
Nanosphere size standards 100 nm	ThermoScientific	3100A
Levamisole	Sigma	L-9756
IPTG	Sigma	15502-10G
Ahringer RNAi library	Source BioScience LifeSciences		http://www.lifesciences.sourcebioscience .com/clone-products/non-mammalian/c-elegans/c-elegans-rnai-library/
Equipment
Sorvall Legend XTR Refrigerated Centrifuge, 120VAC	ThermoScientific	75004521	http://www.coleparmer.com/Product/Thermo_Scientific_Sorvall_Legend_ XTR_Refrigerated_Centrifuge_120 VAC/EW-17707-60
96 pin replicator	Scionomix		http://www.scinomix.com/all-products/96-pin-replicator/
HiGro high-capacity, incubating shaker	Digilab		http://www.digilabglobal.com/higro
Multidrop Combi Reagent Dispenser	Titertrek		http://groups.molbiosci.northwestern.edu/hta/titertek.htm
Biomek FX AP96 Automated Workstation	Beckman Coulter		http://groups.molbiosci.northwestern.edu/hta/biomek_multi.htm
Innova44 shaker	New Brunswick		http://www.eppendorf.com/int///index.php?sitemap=2.3&pb=d78efbc05310ec 04&action=products&contentid=1& catalognode=83389
M205 FA	Leica		http://www.leica-microsystems.com/de/produkte/stereomikroskope-makroskope/fluoreszenz/details/product/leica-m205-fa/
ORCA-R2 C10600-10BDigital CCD camera	Hamamatsu		http://www.hamamatsu.com/jp/en/community/life_science_camera/product/search/C10600-10B/index.html
Spinning Disc AF Confocal Microscope	Leica		http://www.leica-microsystems.com/products/light-microscopes/life-science-research/fluorescence-microscopes/details/product/leica-sd-af/
Falcon 4M60 camera	Teledyne Dalsa		http://www.teledynedalsa.com/imaging/products/cameras/area-scan/falcon/PT-41-04M60/
Software
MetaMorph Microscopy Automation & Image Analysis Software	Molecular Devices		http://www.moleculardevices.com/products/software/meta-imaging-series/metamorph.html
Hamamatsu SimplePCI Image Analysis Software	Meyer Instruments		http://meyerinst.com/imaging-software/hamamatsu/index.htm
ImageJ	NIH		http://rsbweb.nih.gov/ij/download.html
wrMTrck plugin for ImageJ			http://www.phage.dk/plugins/wrmtrck.html
C. elegans strains
N2 (WT)	Caenorhabditis Genetics Center (CGC)		http://www.cgc.cbs.umn.edu/strain.php?id=10570
AM815                                                    rmIs323[myo-3p::sup35(r2e2)::rfp]	Morimoto lab		available from our laboratory
See table 1 for a source for folding sensor and stress reporter strains