ARN polymérase attachée à l’ADN pour la transcription in vitro programmable et le calcul moléculaire

Résumé

Nous décrivons l’ingénierie d’une nouvelle ARN polymérase T7 attachée à l’ADN pour réguler les réactions de transcription in vitro. Nous discutons des étapes de la synthèse et de la caractérisation des protéines, validons la régulation transcriptionnelle de la preuve de concept et discutons de ses applications en informatique moléculaire, en diagnostic et en traitement de l’information moléculaire.

Résumé

La nanotechnologie de l’ADN permet l’auto-assemblage programmable des acides nucléiques en formes et dynamiques prescrites par l’utilisateur pour diverses applications. Ces travaux démontrent que les concepts de la nanotechnologie de l’ADN peuvent être utilisés pour programmer l’activité enzymatique de l’ARN polymérase T7 dérivée des phages (RNAP) et construire des réseaux de régulation de gènes synthétiques évolutifs. Tout d’abord, un RNAP T7 attaché à un oligonucléotide est conçu par l’expression d’un RNAP marqué SNAP N-terminal et le couplage chimique ultérieur du marqueur SNAP avec un oligonucléotide modifié par benzylguanine (BG). Ensuite, le déplacement des brins d’acide nucléique est utilisé pour programmer la transcription de la polymérase à la demande. En outre, les assemblages auxiliaires d’acides nucléiques peuvent être utilisés comme « facteurs de transcription artificiels » pour réguler les interactions entre l’ARNP T7 programmé par l’ADN et ses modèles d’ADN. Ce mécanisme de régulation de la transcription in vitro peut mettre en œuvre une variété de comportements de circuit tels que la logique numérique, la rétroaction, la cascade et le multiplexage. La composabilité de cette architecture de régulation des gènes facilite l’abstraction, la normalisation et la mise à l’échelle de la conception. Ces caractéristiques permettront le prototypage rapide de dispositifs génétiques in vitro pour des applications telles que la biodétection, la détection de maladies et le stockage de données.

Introduction

Le calcul de l’ADN utilise un ensemble d’oligonucléotides conçus comme support de calcul. Ces oligonucléotides sont programmés avec des séquences pour s’assembler dynamiquement selon la logique spécifiée par l’utilisateur et répondre à des entrées d’acide nucléique spécifiques. Dans les études de preuve de concept, le résultat du calcul consiste généralement en un ensemble d’oligonucléotides marqués par fluorescence qui peuvent être détectés par électrophorèse sur gel ou lecteurs de plaques de fluorescence. Au cours des 30 dernières années, des circuits de calcul de l’ADN de plus en plus complexes ont été démontrés, tels que diverses cascades logiques numériques, des ....

Protocole

1. Préparation du tampon

REMARQUE: La préparation du tampon de purification des protéines peut se produire n’importe quel jour; ici, cela a été fait avant de commencer les expériences.

1. Préparer un tampon d’lyse/équilibrage contenant 50 mM de tris(hydroxyméthyl)aminométhane (Tris), 300 mM de chlorure de sodium (NaCl), 5 % de glycérol et 5 mM de β-mercaptoéthanol (BME), pH 8. Ajouter 1,5 mL de Tris 1M, 1,8 mL de NaCl 5M, 1,5 mL de glycérol, 25,2 mL d’eau désionisée (ddH₂O) dans un tube centrifuge de 50 mL et ajouter 10,5 μL de 14,2 M BME juste avant utilisation.
   REMARQUE: Tris peut causer une toxicité aiguë; par conséq....

Résultats

Figure 5: Analyse SDS-PAGE de l’expression snap T7 RNAP et du test de transcription in vitro. (A) Analyse de purification de la protéine SNAP T7 RNAP, poids moléculaire SNAP T7 RNAP: 119.4kDa. FT = écoulement à partir de la colonne, W1 = fractions d’élution du tampon de lavage contenant des impuretés, E1-3 = fractions d’élution c.......

Discussion

Cette étude démontre une approche inspirée de la nanotechnologie de l’ADN pour contrôler l’activité de l’ARN polymérase T7 en couplant de manière covalente un RNAP T7 recombinant marqué N-terminal SNAP avec un oligonucléotide fonctionnalisé BG, qui a ensuite été utilisé pour programmer les réactions TMDSD. De par sa conception, la balise SNAP a été positionnée à la terminaison N de la polymérase, car la terminaison C de l’ARNR T7 de type sauvage est enfouie dans le noyau de la structure protéi.......

matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
0.5% polysorbate 20 (TWEEN 20)	BioShop	TWN510.5
0.5M ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA)	Bio Basic	SD8135
10 mM sodium phosphate buffer (pH 7)	Bio Basic	PD0435	Tablets used to make 10 mM buffer
10% ammonium persulfate (APS)	Sigma Aldrich	A3678-100G
100 kDa Amicon Ultra-15 Centrifugal Filter Unit	Fisher Scientific	UFC910008
100% acetone	Fisher Chemical	A18P4
100% ethanol (EtOH)	House Brand	39752-P016-EAAN
10x in vitro transcription (IVT) buffer	New England Biolabs	B9012
10x Tris-Borate-EDTA (TBE) buffer	Bio Basic	A0026
1M Isopropyl β- d-1-thiogalactopyranoside (IPTG)	Sigma Aldrich	I5502-1G
1M sodium bicarbonate buffer	Sigma Aldrich	S6014-500G
1M Tris(hydroxymethyl)aminomethane (Tris)	Sigma Aldrich	648311-1KG
1X Tris-EDTA (TE) buffer	ThermoFisher	12090015
2M imidazole	Sigma Aldrich	56750-100G
2-mercaptoethanol (BME)	Sigma Aldrich	M3148
3M sodium acetate	Bio Basic	SRB1611
40% acrylamide (19:1)	Bio Basic	A00062
4x LDS protein sample loading buffer	Fisher Scientific	NP0007
5M sodium chloride (NaCl)	Bio Basic	DB0483
5mM dithiothreitol (DTT)	Sigma Aldrich	43815-1G
6x gel loading dye	New England Biolabs	B7024S
agarose B powder	Bio Basic	AB0014
BG-GLA-NHS	New England Biolabs	S9151S
BL21 competent E. coli	Addgene	C2530H
BLUeye prestained protein ladder	FroggaBio	PM007-0500
bromophenol blue	Bio Basic	BDB0001
coomassie blue (SimplyBlue SafeStain)	ThermoFisher	LC6060
cyanine dye (SYBR Gold nucleic acid gel stain)	Fisher Scientific	S11494
cyanine dye (SYBR Safe nucleic acid gel stain)	Fisher Scientific	S33102
dry dimethyl sulfoxide (DMSO)	Fisher Scientific	D12345
formamide	Sigma Aldrich	F9037-100ML
glycerol	Bio Basic	GB0232
kanamycin sulfate	BioShop	KAN201.5
lysogeny broth	Sigma Aldrich	L2542-500ML
malachite green oxalate	Sigma Aldrich	2437-29-8
N,N,N'N'-Tetramethylethane-1,2-diamine (TEMED)	Sigma Aldrich	T9281-25ML
NuPAGE MES SDS running buffer (20x)	Fisher Scientific	LSNP0002
NuPAGE Novex 4-12% Bis-Tris gel 1.0 mm 12-well	Life Technologies	NP0322BOX
oligonucleotide (cage antisense)	IDT	N/A	TATAGTGAGTCGTATTAATTTG
oligonucleotide (cage sense)	IDT	N/A	TCAGTCACCTATCTGTTTCAAA TTAATACGACTCACTATA
oligonucleotide (malachite green aptamer antisense)	IDT	N/A	GGATCCATTCGTTACCTGGCT CTCGCCAGTCGGGATCCTATA GTGAGTCGTATTACAGTTCCAT TATCGCCGTAGTTGGTGTACT
oligonucleotide (malachite green aptamer sense)	IDT	N/A	TAATACGACTCACTATAGGATC CCGACTGGCGAGAGCCAGGT AACGAATGGATCC
oligonucleotide (Transcription Factor A)	IDT	N/A	AGTACACCAACTACGAGTGAG
oligonucleotide (Transcription Factor B)	IDT	N/A	TCAGTCACCTATCTGGCGATAA TGGAACTG
oligonucleotide with 3’ Amine modification (tether)	IDT	N/A	GCTACTCACTCAGATAGGTGAC TGA/3AmMO/
Pierce strong ion exchange spin columns	Fisher Scientific	90008
plasmid encoding SNAP T7 RNAP and kanamycin resistance genes	Genscript	N/A	custom gene insert
protein purification column (HisPur Ni-NTA spin column)	Fisher Scientific	88226
rNTP mix	New England Biolabs	N0466S
Roche mini quick DNA spin column	Sigma Aldrich	11814419001
Triton X-100	Sigma Aldrich	T8787-100ML
Ultra Low Range DNA ladder	Fisher Scientific	10597012
urea	BioShop	URE001.1