Для просмотра этого контента требуется подписка на Jove Войдите в систему или начните бесплатную пробную версию.

В этой статье

  • Резюме
  • Аннотация
  • Введение
  • протокол
  • Результаты
  • Обсуждение
  • Раскрытие информации
  • Благодарности
  • Материалы
  • Ссылки
  • Перепечатки и разрешения

Резюме

Мы описываем разработку новой ДНК-привязанной РНК-полимеразы Т7 для регулирования реакций транскрипции in vitro. Мы обсуждаем этапы синтеза и характеристик белка, проверяем доказательство концепции транскрипционной регуляции и обсуждаем ее приложения в молекулярных вычислениях, диагностике и обработке молекулярной информации.

Аннотация

Нанотехнология ДНК позволяет программируемую самосборку нуклеиновых кислот в предписанные пользователем формы и динамику для различных применений. Эта работа демонстрирует, что концепции из нанотехнологий ДНК могут быть использованы для программирования ферментативной активности фаговой РНК-полимеразы T7 (RNAP) и построения масштабируемых синтетических регуляторных сетей генов. Во-первых, Олигонуклеотид-привязанный T7 RNAP спроектирован путем экспрессии N-терминально помеченного SNAP RNAP и последующей химической связи SNAP-метки с бензилгуанином (BG)-модифицированным олигонуклеотидом. Затем смещение нитей нуклеиновых кислот используется для программирования транскрипции полимеразы по требованию. Кроме того, вспомогательные сборки нуклеиновых кислот могут использоваться в качестве «искусственных факторов транскрипции» для регулирования взаимодействия между запрограммированным ДНК РНКП Т7 с его шаблонами ДНК. Этот регуляторный механизм транскрипции in vitro может реализовывать различные варианты поведения схем, такие как цифровая логика, обратная связь, каскадирование и мультиплексирование. Компонуемость этой генной регуляторной архитектуры облегчает абстракцию, стандартизацию и масштабирование дизайна. Эти функции позволят быстро создавать прототипы генетических устройств in vitro для таких применений, как биозондирование, обнаружение заболеваний и хранение данных.

Введение

ДНК-вычисления используют набор разработанных олигонуклеотидов в качестве среды для вычислений. Эти олигонуклеотиды запрограммированы последовательностями для динамической сборки в соответствии с заданной пользователем логикой и реагируют на конкретные входы нуклеиновых кислот. В экспериментальных исследованиях результат вычислений обычно состоит из набора флуоресцентно меченых олигонуклеотидов, которые могут быть обнаружены с помощью гелевого электрофореза или флуоресцентных пластинчатых считывателей. За последние 30 лет были продемонстрированы все более сложные вычислительные схемы ДНК, такие как различные цифровые логические каскады, сети химических реакций и нейро....

протокол

1. Подготовка буфера

ПРИМЕЧАНИЕ: Очистка белка буферным препаратом может происходить в любой день; здесь это было сделано до начала экспериментов.

  1. Приготовьте буфер лизиса/равновесия, содержащий 50 мМ трис (гидроксиметил)аминометан (Tris), 300 мМ хлорида натрия (NaCl), 5% глицерина и 5 мМ β-меркаптоэтанола (BME), рН 8. Добавьте 1,5 мл 1M Tris, 1,8 мл 5M NaCl, 1,5 мл глицерина, 25,2 мл деионизированной воды (ddH2O) в 50 мл центрифужной трубки и добавьте 10,5 мкл 14,2 M BME непосредственно перед использованием.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Трис может вызвать острую токсичность; Следовательно, избегайте вдыхания его пыли и избегайте кон....

Результаты

figure-results-58
Рисунок 5:SDS-PAGE анализ экспрессии SNAP T7 RNAP и анализа транскрипции in vitro. (A) Анализ очистки белка SNAP T7 RNAP, молекулярная масса SNAP T7 RNAP: 119,4 кДа. FT = протекание из колонны, W1 = фракции элюирования про?.......

Обсуждение

Это исследование демонстрирует основанный на нанотехнологиях подход к контролю активности РНК-полимеразы Т7 путем ковалентного соединения N-терминально помеченного SNAP рекомбинантного Т7-РНКП с BG-функционализированным олигонуклеотидом, который впоследствии использовался для програ?.......

Раскрытие информации

Нет никаких конкурирующих финансовых интересов, которые мог бы декларировать ни один из авторов.

Благодарности

L.Y.T.C признает щедрую поддержку со стороны Фонда исследований «Новые рубежи в исследованиях» (NFRF-E), Гранта Совета по естественным наукам и инженерным исследованиям Канады (NSERC) Discovery Grant и Инициативы «Медицина по дизайну» Университета Торонто, которая получает финансирование от Канадского фонда первого научного совершенства (CFREF).

....

Материалы

NameCompanyCatalog NumberComments
0.5% polysorbate 20 (TWEEN 20)BioShopTWN510.5
0.5M ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA)Bio BasicSD8135
10 mM sodium phosphate buffer (pH 7)Bio BasicPD0435Tablets used to make 10 mM buffer
10% ammonium persulfate (APS)Sigma AldrichA3678-100G
100 kDa Amicon Ultra-15 Centrifugal Filter UnitFisher ScientificUFC910008
100% acetoneFisher ChemicalA18P4
100% ethanol (EtOH)House Brand39752-P016-EAAN
10x in vitro transcription (IVT) bufferNew England BiolabsB9012
10x Tris-Borate-EDTA (TBE) bufferBio BasicA0026
1M Isopropyl β- d-1-thiogalactopyranoside (IPTG)Sigma AldrichI5502-1G
1M sodium bicarbonate bufferSigma AldrichS6014-500G
1M Tris(hydroxymethyl)aminomethane (Tris)Sigma Aldrich648311-1KG
1X Tris-EDTA (TE) bufferThermoFisher12090015
2M imidazoleSigma Aldrich56750-100G
2-mercaptoethanol (BME)Sigma AldrichM3148
3M sodium acetateBio BasicSRB1611
40% acrylamide (19:1)Bio BasicA00062
4x LDS protein sample loading bufferFisher ScientificNP0007
5M sodium chloride (NaCl)Bio BasicDB0483
5mM dithiothreitol (DTT)Sigma Aldrich43815-1G
6x gel loading dyeNew England BiolabsB7024S
agarose B powderBio BasicAB0014
BG-GLA-NHSNew England BiolabsS9151S
BL21 competent E. coliAddgeneC2530H
BLUeye prestained protein ladderFroggaBioPM007-0500
bromophenol blueBio BasicBDB0001
coomassie blue (SimplyBlue SafeStain)ThermoFisherLC6060
cyanine dye (SYBR Gold nucleic acid gel stain)Fisher ScientificS11494
cyanine dye (SYBR Safe nucleic acid gel stain)Fisher ScientificS33102
dry dimethyl sulfoxide (DMSO)Fisher ScientificD12345
formamideSigma AldrichF9037-100ML
glycerolBio BasicGB0232
kanamycin sulfateBioShopKAN201.5
lysogeny brothSigma AldrichL2542-500ML
malachite green oxalateSigma Aldrich2437-29-8
N,N,N'N'-Tetramethylethane-1,2-diamine (TEMED)Sigma AldrichT9281-25ML
NuPAGE MES SDS running buffer (20x)Fisher ScientificLSNP0002
NuPAGE Novex 4-12% Bis-Tris gel 1.0 mm 12-wellLife TechnologiesNP0322BOX
oligonucleotide (cage antisense)IDTN/ATATAGTGAGTCGTATTAATTTG
oligonucleotide (cage sense)IDTN/ATCAGTCACCTATCTGTTTCAAA
TTAATACGACTCACTATA
oligonucleotide (malachite green aptamer antisense)IDTN/AGGATCCATTCGTTACCTGGCT
CTCGCCAGTCGGGATCCTATA
GTGAGTCGTATTACAGTTCCAT
TATCGCCGTAGTTGGTGTACT
oligonucleotide (malachite green aptamer sense)IDTN/ATAATACGACTCACTATAGGATC
CCGACTGGCGAGAGCCAGGT
AACGAATGGATCC
oligonucleotide (Transcription Factor A)IDTN/AAGTACACCAACTACGAGTGAG
oligonucleotide (Transcription Factor B)IDTN/ATCAGTCACCTATCTGGCGATAA
TGGAACTG
oligonucleotide with 3’ Amine modification (tether)IDTN/AGCTACTCACTCAGATAGGTGAC
TGA/3AmMO/
Pierce strong ion exchange spin columnsFisher Scientific90008
plasmid encoding SNAP T7 RNAP and kanamycin resistance genesGenscriptN/Acustom gene insert
protein purification column (HisPur Ni-NTA spin column)Fisher Scientific88226
rNTP mixNew England BiolabsN0466S
Roche mini quick DNA spin columnSigma Aldrich11814419001
Triton X-100Sigma AldrichT8787-100ML
Ultra Low Range DNA ladderFisher Scientific10597012
ureaBioShopURE001.1

Ссылки

  1. Cherry, K. M., Qian, L. Scaling up molecular pattern recognition with DNA-based winner-take-all neural networks. Nature. 559 (7714), 370-376 (2018).
  2. Qian, L., Winfree, E., Bruck, J. Neural network com....

Перепечатки и разрешения

Запросить разрешение на использование текста или рисунков этого JoVE статьи

Запросить разрешение

Смотреть дополнительные статьи

178in vitroin vitro

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Конфиденциальность

Условия эксплуатации

Политика

СВЯЖИТЕСЬ С НАМИ

РЕКОМЕНДОВАТЬ БИБЛИОТЕКЕ

НОВОСТИ JoVE

Исследования

Образование

АВТОРЫ

Библиотекарь

О JoVE

Авторские права © 2025 MyJoVE Corporation. Все права защищены