Dépistage de la résistance à Phytophthora nicotianae des génotypes du tabac

Résumé

Ici, un protocole est présenté pour le dépistage efficace et précis des génotypes de tabac pour la résistance à Phytophthora nicotianae chez les semis. Il s’agit d’une approche pratique pour la sélection de précision, ainsi que pour la recherche sur les mécanismes moléculaires.

Résumé

Le jarret noir, causé par les oomycètes Phytophthora nicotianae, est destructeur pour le tabac, et cet agent pathogène est hautement pathogène pour de nombreuses cultures solanacées. P. nicotianae est bien adapté aux températures élevées; par conséquent, la recherche sur cet agent pathogène gagne en importance dans l’agriculture du monde entier en raison du réchauffement climatique. Les variétés de plants de tabac résistantes à P. nicotianae sont généralement dépistées par inoculation avec des grains d’avoine colonisés par P. nicotianae et par surveillance des symptômes de la maladie. Cependant, il est difficile de quantifier l’intensité de l’inoculation car une inoculation précise est cruciale dans ce cas. Cette étude visait à développer une méthode efficace et fiable pour évaluer la résistance du tabac à l’infection par P. nicotianae. Cette méthode a été utilisée avec succès pour identifier les variétés résistantes, et l’efficacité de l’inoculation a été confirmée par PCR en temps réel. La méthode d’évaluation de la résistance présentée dans cette étude est efficace et pratique pour la sélection de précision, ainsi que pour la recherche sur les mécanismes moléculaires.

Introduction

P. nicotianae est destructeur pour de nombreuses cultures solanacées. Il peut causer la « jarret noir »¹ du tabac, la pourriture foliaire et tuberculeuse de la pomme de ^terre2, la pourriture de la couronne et de la racine de la tomate et du poivron ^doux3, ainsi que la pourriture du collier et des racines de Goji4. P. nicotianae peut attaquer toutes les parties des plants de tabac, y compris les racines, les tiges et les feuilles à n’importe quel stade de ^croissance5. Le symptôme le plus courant de la maladie est la base noire de la tige. Les racines sont d’abord visibles comme imbibées d’eau, puis deviennent nécrotiques, et les feuilles présentent de grandes lésions ^circulaires5. Cette maladie peut être dévastatrice pour une plante de tabac dans la serre, ainsi que sur le ^terrain6. La méthode la plus pratique et la plus économique pour lutter contre P. nicotianae est l’utilisation de variétés ^{résistantes7}. Cependant, un protocole de dépistage efficace est nécessaire pour l’identification des accessions résistantes à P. nicotianae provenant des collections de matériel génétique du tabac.

Diverses méthodes d’identification ont été décrites pour évaluer la résistance à P. nicotianae dans le tabac7,8,9,10,11,12,13,14,15,16. En général, trois approches principales ont été utilisées pour l’identification des génotypes de tabac résistants à P. nicotianae. La première consiste à mélanger le mycélium avec un milieu agar sur des plaques de Petri contenant P. nicotianae. Les mycéliums sont ensuite cultivés dans l’obscurité à température ambiante pendant 2 semaines. 1 L d’eau désionisée est ajoutée au mycélium et homogénéisée pendant 30 s. L’inoculum est conservé sur la glace jusqu’à ce qu’il soit nécessaire. Deux trous (1 cm de diamètre et 4-5 cm de profondeur) sont faits de chaque côté de la plante, et 10 mL de l’inoculum sont versés dans chaque trou. Les trous sont ensuite remplis avec le sol environnant et le développement de la maladie est surveillé quotidiennement pendant 2 ^semaines8,10.

Dans la deuxième méthode, les plantes sont inoculées avec des cure-dents infestés d’agents pathogènes. Pour cette approche, les plantes doivent être utilisées environ 6 semaines après le repiquage et doivent avoir une hauteur minimale de 30 cm. Les cure-dents autoclavés sont placés à la surface des cultures contenant P. nicotianae mycelia. Les plats de culture sont ensuite conservés à la lumière à température ambiante pendant 7 jours. Ensuite, des cure-dents colonisés sont utilisés pour inoculer les plantes. Les cure-dents sont insérés dans les tiges de tabac entre les quatrième et cinquième nœuds. Les plantes sont surveillées quotidiennement pendant 5 ^jours9,15. Cette méthode ne s’applique pas aux petits semis. Comme l’inoculum est infesté de cure-dents infestés d’agents pathogènes, l’intensité de l’inoculation ne peut pas être contrôlée avec précision.

L’approche la plus fréquemment utilisée implique des grains d’avoine pour l’inoculation. Dans ce cas, les grains d’avoine sont préparés par autoclavage 500 mL d’avoine et 300 mL d’eau désionisée à 121 °C pendant 1 h une fois par jour pendant 3 jours. Ensuite, des grains d’avoine sont ajoutés au milieu de culture colonisé par un agent pathogène. Les plats sont scellés avec un film de paraffine et incubés à 25 ° C à la lumière pendant 7 à 12 jours. Quatre trous séparés de 5 cm de profondeur sont faits sur le terreau, à 4 cm de chaque plante, et un grain d’avoine infesté d’agents pathogènes est placé dans chaque trou. La période d’incubation est déterminée en fonction du moment où le premier symptôme en surface se ^{produit7,11,12,13,14,15,16}. Cette méthode est efficace et applicable pour le criblage de résistance à grande échelle. Cependant, l’une des limites de cette approche est que l’inoculum est constitué de grains d’avoine infestés d’agents pathogènes, de sorte que l’intensité de l’inoculation ne peut pas être contrôlée avec précision.

Cependant, présenté ici est une méthode plus précise qui est applicable à l’évaluation de la résistance de la chambre de croissance. Par rapport aux autres approches, l’inoculum est en suspension de zoospore, d’où l’intensité de l’inoculation est contrôlable et réglable. Comme les plants de tabac de cette étude sont cultivés sans sol, les résultats sont plus faciles à observer. De plus, l’échantillonnage des racines des plantes dans le sol endommage toujours les racines, ce qui induit une série de réponses ^{physiologiques17}. Dans cette méthode, comme les plantes sont cultivées sans sol, l’interférence dans les dommages aux racines peut être éliminée. En conclusion, cette méthode est plus pratique pour la recherche sur les mécanismes moléculaires et la sélection de précision. En utilisant ce protocole, les données sont généralement obtenues dans les 5 jours, avec plus de 200 plantes évaluées en une seule expérience.

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Protocole

1. Matériaux

1. Obtenir des variétés de tabac.
   NOTE: Pour cette expérience, « Beinhart1000-1 » (une sélection de Beinhart 1000) (BH) et « Xiaohuangjin1025 » (XHJ) ont été obtenus auprès de la Banque nationale de génétique à moyen terme de la ressource en matériel génétique du tabac de Chine. Bh est résistant, tandis que XHJ est sensible à l’infection à P. nicotianae16. Un isolat de champ de P. nicotianae race 0, qui a été conservé à l’Institut de recherche sur le tabac de l’Académie chinoise des sciences agricoles, a été utilisé pour toutes les inoculations tout au long de l’étude.

2. Plantation de génotypes de tabac pour l’évaluation de la résistance à P. nicotianae

1. Mélanger les graines de tabac avec de la vermiculite et diffuser doucement les graines sur le terreau stérilisé. Placez les pots dans la chambre de croissance. Maintenir une température constante de 25 °C, sous une photopériode de 16 h de lumière/8 h d’obscurité.
2. Préparez des appareils hydroponiques avec des plateaux et des feuilles de mousse. Une fois les graines germées, piquez les semis du terreau, lavez doucement les racines avec de l’eau désionisée stérile et transplantez-les dans les appareils hydroponiques.
3. Placer les appareils dans des chambres climatiques à 25 °C sous une photopériode de 16 h de lumière/8 h d’obscurité pendant 24 h.
4. Préparer la solution nutritive Hoagland à l’avance (tableau 1). Transplantez les semis dans des dispositifs hydroponiques avec une solution nutritive Hoagland (environ 125 mL par plante).
5. Placez les appareils dans une chambre climatique à 25 °C sous une photopériode de 16 h de lumière/8 h d’obscurité pendant 2 semaines.

3. Préparation de la suspension de P. nicotianae zoospore

1. Préparer le milieu de la gélose à l’avoine.
   1. Peser 33 g de flocons d’avoine et transférer dans la verrerie et ajouter 1 000 mL d’eau stérile. Faire bouillir sur une cuisinière électromagnétique.
   2. Une fois que la farine d’avoine devient collante, filtrer la solution liquide à travers un morceau de gaze stérile.
   3. Versez la solution liquide dans un cylindre gradué de 1 000 mL et réglez le volume à 1 000 mL avec de l’eau stérile.
   4. Versez la solution liquide dans un flacon de réactif en verre et ajoutez 18 g de gélose. Bien agiter et autoclaver le mélange (milieu de gélose à l’avoine) à 121 °C pendant 15 min. Laissez-le à température ambiante pendant 30 min.
   5. Versez environ 20 ml du milieu de gélose à l’avoine stérilisé dans chaque boîte de Pétri. Laissez les boîtes de Petri à température ambiante refroidir soigneusement avant la culture mycélienne.
2. Effectuer la culture mycélienne.
   1. Préparez au préalable les poinçons et les cure-dents de 1 cm de diamètre en les autoclavant à 121 °C pendant 15 min.
   2. Percer des trous dans les cultures d’agar mycélienne P. nicotianae pour faire des tapis mycéliens ronds.
   3. Choisissez les tapis mycéliens, placez le côté mycélien vers le bas sur le milieu de la gélose à l’avoine et incubez le mycélium à 25 ° C dans l’obscurité pendant 14 jours.
3. Préparer la suspension de P. nicotianae zoospore.
   1. Ajouter une solution de _KNO3 à 0,1 % à chaque culture mycélienne (15 mL/plat), puis cultiver à 4 °C pendant 20 min pour induire le sporange.
   2. Conserver les plats à 25 °C pendant 25 min pour libérer les zoospores.
   3. Recueillir la suspension de zoospore dans un bécher et mesurer la concentration de zoospore à l’aide d’un microscope et d’un hémocytomètre.
   4. Ajuster la concentration de zoospores à 1 x ¹⁰⁴ zoospores/mL avec de l’eau stérile.

4. Identification des variétés de tabac résistantes aux maladies

1. Prenez les semis de la solution nutritive Hoagland et inoculez-les en immergeant les racines dans 20 mL de suspension zoospore de P. nicotianae dans une boîte de Pétri (90 mm) à 25 °C pendant 3 h dans l’obscurité.
2. Après l’inoculation, mettez les plants de tabac dans de nouvelles boîtes de Pétri avec 10 mL d’eau stérile immergeant les racines. Gardez les racines humides en les recouvrant de deux morceaux de papier filtre. Conserver la vaisselle à 25 °C avec une photopériode de 16 h de lumière/8 h d’obscurité.
3. Après 2-3 jours, observez la gravité de la maladie.
   1. Pour le traitement de contrôle, placez les plants de tabac directement dans les boîtes de Pétri avec 10 ml d’eau stérile immergeant les racines et recouvrez les racines de deux morceaux de papier filtre.
      NOTE: Chaque traitement avait trois réplications, avec 8 plantes par expérience.

5. Évaluation de l’infection à P. nicotianae

1. Évaluez la gravité de la maladie 4 à 5 jours après l’inoculation. Sur la base de la norme nationale ^chinoise18, évaluer la gravité de chaque maladie des plantes sur une échelle de 0 à 9 (tableau 2, figure 1).
2. Calculez l’indice de maladie à l’aide de la formule ^suivante18 :
   Indice de maladie =
   où a, b, c, d, e et f sont le nombre de plantes dans chaque grade de gravité de la maladie.
   REMARQUE : La gravité de la maladie a été divisée en 6 ^grades18 (tableau 3).

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Résultats

Les plantes âgées de 4 semaines de la variété résistante BH et de la variété sensible XHJ ont été confrontées à P. nicotianae en utilisant la méthode présentée dans cet article. L’expérience a été conçue avec trois répliques, chacune avec 8 plantes par groupe. L’infection à P. nicotianae des deux variétés de tabac, BH et XHJ, est présentée à la figure 2. 3 jours après l’inoculation, pour XHJ, les lésions de la tige couvraient environ la moi...

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Discussion

De multiples sources de résistance ont été utilisées pour améliorer la résistance à P. nicotianae dans le tabac cultivé. Les gènes R dominants uniques, Php et Phl, ont été introduits à partir de Nicotiana plumbaginifolia et Nicotiana longiflora, respectivement10. La variété de tabac à cigares Beinhart 1000 a le plus haut niveau de résistance quantitative signalé à P. nicotianae13. De multiples expérien...

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matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
(NH4)2SO4	Sinopharm	10002917	Analytical Reagent
(NH4)6 Mo7O24•2 H2O	Sinopharm	XW131067681	Analytical Reagent
1.5 ml Safe-lock Microcentrifuge Tubes	Eppendorf	30120086	Used for Sample Extarction
2 ml Safe-lock Microcentrifuge Tubes	Eppendorf	30120094	Used for Sample Extarction
Agar	MDBio, Inc	9002-18-0	Materials of Culture Medium
Analytical Balance	AOHAOSI	AX2202ZH	Equipment
Autoclave	Yamatuo	SQ510C	Equipment
Autoclave	YAMATUO	SQ510C	Equipment
Beaker	Bio Best	DHSB-2L	Materials of Culture Medium
Biological Incubator	JINGHONG	SHP-250	Equipment
Ca(NO3)2•4 H2O	Sinopharm	80029062	Analytical Reagent
CaCl2	Sinopharm	10005817	Analytical Reagent
CuSO4•5 H2O	Sinopharm	10008218	Analytical Reagent
Electromagnetic Oven	Bio Best	DHDCL	Equipment
FeSO4•7 H2O	Sinopharm	10002918	Analytical Reagent
Filter Paper	Bio Best	DHLZ-9CM	Material
Fluorescence Ration PCR Instrument	Roche	LightCycler96	Equipment
Gauze	Bio Best	17071202	Materials of Culture Medium
H3BO3	Phytotechnology	B210-500G	Analytical Reagent
Hemocytometer	Solarbio	17072801	Material for disease-resistant  identification
K2SO4	Sinopharm	10017918	Analytical Reagent
KNO3	Sinopharm	10017218	Analytical Reagent
KT Foam Sheet	Bio Best	DHKTB	Material for Seedling
Low Constant Incubator	Jinghong	SHP-250	Equipment
Measuring Cylinder	Bio Best	DHBLLT-1000ML	Materials of Culture Medium
MgSO4•7 H2O	Sinopharm	10013080	Analytical Reagent
Microscope	ECHO	RVL-100-G	Equipment
MnCl2•4 H2O	Sinopharm	G5468154	Analytical Reagent
Na2-EDTA	Sinopharm	G21410-250	Analytical Reagent
NaH2PO4•2 H2O	Sinopharm	20040717	Analytical Reagent
NH4NO3	Sinopharm	B64586-100g	Analytical Reagent
Oatmeal	Bio Best	DHYMP-1.5KG	Materials of Culture Medium
Petri Dish	Bio Best	DHPYM-9CM	Material for disease-resistant  identification
Pipettor	THERMO	S1	Equipment
Potting	Bio Best	DHYCXHP-12CM	Material for Seedling
Potting Soil	Bio Best	DHYMJZ-50L	Seedling Material
Punch	Bio Best	DHDKW	Material
qRT-PCR Plate	Monad	MQ50401S	qRT-PCR Plate
SYBR Green Premix Pro Taq HS qPCR Kit	Accurate Biology	AG11718	PCR Reagent
Toothpick	Bio Best	DHYQ-900	Material
Total RNA Kit II	Omega	R6934-01	PCR Reagent
TransScript® II One-Step gDNA Removal and cDNA Synthesis SuperMix	Transgen	AH311-02	PCR Reagent
Trays	Bio Best	DHYMTP-90G	Material for Seedling
Vermiculite	Bio Best	DHZS	Seedling Material
Water Purification System	HEAL FORCE	HSE68-2	Equipment
ZnSO4•7 H2O	Sinopharm	10024018	Analytical Reagent