Triagem de Genótipos de Tabaco para Resistência de Phytophthora nicotianae

Resumo

Aqui, é apresentado um protocolo para a triagem eficiente e precisa dos genótipos do tabaco para resistência à Phytophthora nicotianae em mudas. Trata-se de uma abordagem prática para a reprodução de precisão, bem como para a pesquisa de mecanismos moleculares.

Resumo

A haste preta, causada pelos oomycetes Phytophthora nicotianae, é destrutiva para o tabaco, e este patógeno é altamente patogênico para muitas culturas solanáceos. P. nicotianae é bem adaptado a altas temperaturas; portanto, a pesquisa sobre esse patógeno está ganhando importância na agricultura mundial por causa do aquecimento global. As variedades resistentes à p. nicotianae de plantas de tabaco são comumente rastreadas pela inoculação com grãos de aveia colonizados por P. nicotianae e monitoramento dos sintomas da doença. No entanto, é difícil quantificar a intensidade da inoculação, uma vez que a inoculação precisa é crucial neste caso. Este estudo teve como objetivo desenvolver um método eficiente e confiável para avaliar a resistência do tabaco à infecção com P. nicotianae. Este método tem sido usado com sucesso para identificar variedades resistentes, e a eficiência da inoculação foi confirmada por PCR em tempo real. O método de avaliação de resistência apresentado neste estudo é eficiente e prático para a reprodução de precisão, bem como para a pesquisa de mecanismos moleculares.

Introdução

P. nicotianae é destrutivo para muitas culturas solanáceas. Pode causar tabaco "pernil preto"¹, batata foliar e tuber ^rot2, tomate e pimenta doce coroa e raiz ^rot3, e goji colar e raiz ^rot4. P. nicotianae pode atacar todas as partes das plantas de tabaco, incluindo as raízes, caules e folhas em qualquer estágio de ^crescimento5. O sintoma mais comum da doença é a base negra do talo. As raízes são inicialmente visíveis como encharcadas de água e depois tornam-se necrosadas, e as folhas apresentam grandes lesões ^circulares5. Essa doença pode ser devastadora para uma planta de tabaco na estufa, bem como no ^campo6. O método mais prático e econômico para controlar p. nicotianae é o uso de variedades ^resistentes7. No entanto, é necessário um protocolo de triagem eficaz para a identificação de adesões resistentes à P. nicotianae a partir de coleções de germoplasma de tabaco.

Vários métodos de identificação foram descritos para avaliar a resistência à P. nicotianae no tabaco7,8,9,10,11,12,13,14,15,16. Em geral, três abordagens importantes têm sido utilizadas para a identificação de genótipos de tabaco resistentes à P. nicotianae. O primeiro inclui a mistura de micélia com meio de ágar em placas de Petri contendo P. nicotianae. As micélias são então cultivadas no escuro à temperatura ambiente por 2 semanas. 1 L de água deionizada é adicionado à micélia e homogeneizado para 30 s. O inóculo é mantido no gelo até que seja necessário. Dois orifícios (1 cm de diâmetro e 4-5 cm de profundidade) são feitos em cada lado da planta, e 10 mL do inóculo são derramados em cada orifício. Os buracos são então preenchidos com o solo circundante, e o desenvolvimento de doenças é monitorado diariamente por 2 ^semanas8,10.

No segundo método, as plantas são inoculadas com palitos infestados de patógenos. Para esta abordagem, as plantas devem ser utilizadas aproximadamente 6 semanas após o transplante e devem ter uma altura mínima de 30 cm. Palitos de dente autoclavados são colocados na superfície de culturas que contêm P. nicotianae mycelia. Os pratos de cultura são então armazenados sob a luz à temperatura ambiente por 7 dias. Então, palitos colonizados são usados para vacinar as plantas. Palitos de dente são inseridos nas hastes de tabaco entre o quarto e o quinto nós. As plantas são monitoradas diariamente durante 5 ^dias9,15. Este método não é aplicável para pequenas mudas. Como o inóculo é um palito infestado de patógenos, a intensidade da inoculação não pode ser precisamente controlada.

A abordagem mais utilizada envolve grãos de aveia para inoculação. Neste caso, os grãos de aveia são preparados por autoclaving 500 mL de aveia e 300 mL de água deionizada a 121 °C por 1h uma vez por dia durante 3 dias. Em seguida, os grãos de aveia são adicionados ao meio de cultura colonizada por patógenos. Os pratos são selados com filme de parafina e incubados a 25 °C em luz por 7-12 dias. Quatro buracos de 5 cm de profundidade separados são feitos no solo de vasos, 4 cm de cada planta, e um grão de aveia infestado de patógenos é colocado em cada orifício. O período de incubação é determinado com base em quando o primeiro sintoma acima do solo ocorre7,11,12,13,14,15,16. Este método é eficiente e aplicável para a triagem de resistência em larga escala. No entanto, uma limitação dessa abordagem é que o inóculo é de grãos de aveia infestados de patógenos, portanto a intensidade da inoculação não pode ser precisamente controlada.

No entanto, aqui apresentado é um método mais preciso que é aplicável à avaliação da resistência da câmara de crescimento. Em comparação com as outras abordagens, o inóculo é a suspensão do zoospore, portanto a intensidade da inoculação é controlável e ajustável. Como as plantas de tabaco neste estudo são cultivadas sem solo, os resultados são mais fáceis de observar. Além disso, a amostragem das raízes vegetais do solo sempre causa danos às raízes, o que induz uma série de respostas fisiológicas17. Neste método, como as plantas são cultivadas sem solo, a interferência no dano radicular pode ser eliminada. Em conclusão, este método é mais prático para pesquisa de mecanismos moleculares e criação de precisão. Usando este protocolo, os dados são normalmente obtidos dentro de 5 dias, com mais de 200 plantas avaliadas em um único experimento.

Protocolo

1. Materiais

1. Obter variedades de tabaco.
   NOTA: Para este experimento "Beinhart1000-1" (uma seleção de Beinhart 1000) (BH) e "Xiaohuangjin1025" (XHJ) foram obtidos do Genbank Nacional de Médio Prazo do Recurso de Germplasma do Tabaco da China. BH é resistente, enquanto XHJ é suscetível à infecção por P. nicotianae16. Um isolamento de campo da P. nicotianae race 0, que foi preservada no Instituto de Pesquisa do Tabaco da Academia Chinesa de Ciências Agrícolas, foi usado para todas as vacinas ao longo do estudo.

2. Plantio de genótipos de tabaco para avaliação de resistência p. nicotianae

1. Misture as sementes de tabaco com vermiculite e transmita as sementes suavemente no solo esterilizado. Coloque os potes na câmara de crescimento. Mantenha uma temperatura constante de 25 °C, sob um fotoperíodo escuro de 16 h/8 h.
2. Prepare dispositivos hidropônicos com bandejas e folhas de espuma. Após as sementes germinarem, pique as mudas do solo de vaso, lave as raízes suavemente com água deionizada estéril e transplante-as nos dispositivos hidropônicos.
3. Coloque os dispositivos em câmaras climáticas a 25 °C sob um fotoperíodo escuro de 16 h/8 h por 24 h.
4. Prepare a solução de nutrientes Hoagland com antecedência (Tabela 1). Transplante das mudas para dispositivos hidropônicos com solução de nutrientes Hoagland (aproximadamente 125 mL por planta).
5. Coloque os dispositivos em uma câmara climática a 25 °C sob um fotoperíodo escuro de 16 h/8h por 2 semanas.

3. Preparação da suspensão do zoológico de P. nicotianae

1. Prepare o ágar médio de aveia.
   1. Pesar 33 g de aveia e transferir para vidros e adicionar 1.000 mL de água estéril. Ferva em um forno de fogão eletromagnético.
   2. Depois que a aveia ficar pegajosa, coe a solução líquida através de um pedaço de gaze estéril.
   3. Despeje a solução líquida em um cilindro graduado de 1.000 mL e ajuste o volume para 1.000 mL com água estéril.
   4. Despeje a solução líquida em uma garrafa de reagente de vidro e adicione 18 g de ágar. Agite bem e autoclave a mistura (meio de áteis de aveia) a 121 °C por 15 min. Deixe em temperatura ambiente por 30 minutos.
   5. Despeje cerca de 20 mL do meio de ágar de aveia esterilizado em cada placa de Petri. Deixe as placas de Petri à temperatura ambiente para esfriar bem antes do cultivo micelial.
2. Realize o cultivo de micélio.
   1. Prepare socos de 1 cm de diâmetro e palitos de dente de antemão, autoclavando-os a 121 °Cfor 15 min.
   2. Furos nas culturas mycelial mycelial P. nicotianae para fazer tapetes miceliais redondos.
   3. Escolha os tapetes de micrúbio, coloque o lado mycelial no meio de ágar de aveia e incuba o micélio a 25 °C no escuro por 14 dias.
3. Prepare a suspensão do zoológico de P. nicotianae .
   1. Adicione 0,1% de solução _KNO3 a cada cultivo micelial (15 mL/prato), seguido de cultivo a 4 °C por 20 min para induzir esporangium.
   2. Mantenha os pratos a 25 °C por 25 minutos para liberar zoospores.
   3. Colete a suspensão do zoospore em um béquer e meça a concentração de zoospore usando um microscópio ehemocímetro.
   4. Ajuste a concentração de zoospore para 1 x ¹⁰⁴ zoospores/mL com água estéril.

4. Identificação de variedades de tabaco resistentes a doenças

1. Pegue as mudas da solução de nutrientes Hoagland e inocula-as imergindo as raízes em 20 mL de suspensão zoospora P. nicotianae em uma placa de Petri (90 mm) a 25 °C por 3 h no escuro.
2. Após a inoculação, coloque as mudas de tabaco em novas placas de Petri com 10 mL de água estéril imergindo as raízes. Mantenha as raízes úmidas cobrindo com dois pedaços de papel filtro. Mantenha os pratos a 25 °C com um fotoperíodo escuro de 16h/8 h.
3. Após 2-3 dias, observe a gravidade da doença.
   1. Para o tratamento de controle, coloque as mudas de tabaco diretamente nas placas de Petri com água estéril de 10 mL imergindo as raízes, e cubra as raízes com dois pedaços de papel filtro.
      NOTA: Cada tratamento teve três replicações, sendo 8 plantas por experimento.

5. Avaliação da infecção por P. nicotianae

1. Avalie a gravidade da doença de 4 a 5 dias após a inoculação. Com base no padrão nacional ^chinês18, escore a gravidade da doença vegetal individual em uma escala de 0 a 9 (Tabela 2, Figura 1).
2. Calcule o índice da doença usando a seguinte ^fórmula18:
   Índice da doença =
   onde a, b, c, d, e, e e e f são o número de plantas em cada grau de gravidade da doença.
   NOTA: A gravidade da doença foi dividida em 6 ^séries18 (Tabela 3).

Resultados

Plantas de 4 semanas de idade da variedade resistente BH e variedade suscetível XHJ foram desafiadas com P. nicotianae utilizando o método apresentado neste artigo. O experimento foi projetado com três réplicas, cada uma com 8 plantas por grupo. A infecção por P. nicotianae das duas variedades de tabaco, BH e XHJ, é apresentada na Figura 2. Aos 3 dias após a inoculação, para XHJ, as lesões do caule cobriram aproximadamente metade da cintura do caule, e metade da...

Discussão

Múltiplas fontes de resistência têm sido usadas para melhorar a resistência à P. nicotianae no tabaco cultivado. Os genes R dominantes únicos, Php e Phl, foram introgressados de Nicotiana plumbaginifolia e Nicotiana longiflora, ^{respectivamente10}. A variedade de tabaco de charuto Beinhart 1000 tem o maior nível de resistência quantitativa relatado a P. nicotianae13. Experimentos de mapeamento de intervalo múltipl...

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
(NH4)2SO4	Sinopharm	10002917	Analytical Reagent
(NH4)6 Mo7O24•2 H2O	Sinopharm	XW131067681	Analytical Reagent
1.5 ml Safe-lock Microcentrifuge Tubes	Eppendorf	30120086	Used for Sample Extarction
2 ml Safe-lock Microcentrifuge Tubes	Eppendorf	30120094	Used for Sample Extarction
Agar	MDBio, Inc	9002-18-0	Materials of Culture Medium
Analytical Balance	AOHAOSI	AX2202ZH	Equipment
Autoclave	Yamatuo	SQ510C	Equipment
Autoclave	YAMATUO	SQ510C	Equipment
Beaker	Bio Best	DHSB-2L	Materials of Culture Medium
Biological Incubator	JINGHONG	SHP-250	Equipment
Ca(NO3)2•4 H2O	Sinopharm	80029062	Analytical Reagent
CaCl2	Sinopharm	10005817	Analytical Reagent
CuSO4•5 H2O	Sinopharm	10008218	Analytical Reagent
Electromagnetic Oven	Bio Best	DHDCL	Equipment
FeSO4•7 H2O	Sinopharm	10002918	Analytical Reagent
Filter Paper	Bio Best	DHLZ-9CM	Material
Fluorescence Ration PCR Instrument	Roche	LightCycler96	Equipment
Gauze	Bio Best	17071202	Materials of Culture Medium
H3BO3	Phytotechnology	B210-500G	Analytical Reagent
Hemocytometer	Solarbio	17072801	Material for disease-resistant  identification
K2SO4	Sinopharm	10017918	Analytical Reagent
KNO3	Sinopharm	10017218	Analytical Reagent
KT Foam Sheet	Bio Best	DHKTB	Material for Seedling
Low Constant Incubator	Jinghong	SHP-250	Equipment
Measuring Cylinder	Bio Best	DHBLLT-1000ML	Materials of Culture Medium
MgSO4•7 H2O	Sinopharm	10013080	Analytical Reagent
Microscope	ECHO	RVL-100-G	Equipment
MnCl2•4 H2O	Sinopharm	G5468154	Analytical Reagent
Na2-EDTA	Sinopharm	G21410-250	Analytical Reagent
NaH2PO4•2 H2O	Sinopharm	20040717	Analytical Reagent
NH4NO3	Sinopharm	B64586-100g	Analytical Reagent
Oatmeal	Bio Best	DHYMP-1.5KG	Materials of Culture Medium
Petri Dish	Bio Best	DHPYM-9CM	Material for disease-resistant  identification
Pipettor	THERMO	S1	Equipment
Potting	Bio Best	DHYCXHP-12CM	Material for Seedling
Potting Soil	Bio Best	DHYMJZ-50L	Seedling Material
Punch	Bio Best	DHDKW	Material
qRT-PCR Plate	Monad	MQ50401S	qRT-PCR Plate
SYBR Green Premix Pro Taq HS qPCR Kit	Accurate Biology	AG11718	PCR Reagent
Toothpick	Bio Best	DHYQ-900	Material
Total RNA Kit II	Omega	R6934-01	PCR Reagent
TransScript® II One-Step gDNA Removal and cDNA Synthesis SuperMix	Transgen	AH311-02	PCR Reagent
Trays	Bio Best	DHYMTP-90G	Material for Seedling
Vermiculite	Bio Best	DHZS	Seedling Material
Water Purification System	HEAL FORCE	HSE68-2	Equipment
ZnSO4•7 H2O	Sinopharm	10024018	Analytical Reagent