Utilisation de Crystal Violet pour améliorer la lecture visuelle basée sur les effets cytopathiques pour la tittration virale à l’aide des tests TCID50

Résumé

Ce protocole montre une approche précise et objective pour visualiser les titrages viraux à l’aide de violet cristallin, en le comparant à la microscopie optique et à la coloration immunocytochimique.

Résumé

La titration virale est un test clé pour la recherche en virologie. La détection de l’effet cytopathique (CPE) via les tests TCID50 et les tests d’unités formant de plaque (PFU) sont les deux principales méthodes pour calculer le titre d’un stock de virus et sont souvent basées sur la détection par microscopie ou la coloration cellulaire pour la visualisation. Dans le cas du test TCID50, la visualisation objective est généralement basée sur la coloration immunocytochimique (ICC) du virus intracellulaire pour calculer les titres combinés à la détection visuelle du CPE par microscopie. Cependant, la coloration ICC est coûteuse et prend beaucoup de temps. Dans cette étude, nous avons comparé l’observation visuelle du CPE par microscopie, la coloration ICC et la coloration violette cristalline pour déterminer les titres de deux virus formant des CPE, le virus de la grippe A (IAV) d’origine porcine et le virus du syndrome reproducteur et respiratoire porcin (SDRP). Nous montrons que la coloration au violet cristallin et à l’ICC est plus précise que la détection visuelle du CPE, présentant des niveaux de précision presque identiques sur l’IAV et le PRRSV. Pour cette raison, nous présentons ici la coloration violette cristalline comme un moyen plus rapide et plus abordable de déterminer les titrages viraux sur un test TCID50 pour les virus formant des CPE titrés dans des lignées cellulaires.

Introduction

La titration virale par dosage TCID50 est une technique couramment utilisée dans la recherche sur les maladies ^{infectieuses1}. Bien que des variations sur les mathématiques derrière cette méthode aient été proposées au fil du ^temps1,2,3,4, les méthodes actuellement appliquées de détection des infections reposent sur la confirmation visuelle par la présence d’effet cytopathique (CPE) à l’aide de la ^microscopie5. Pour confirmer la visualisation du CPE de manière plus objective sur les tes....

Protocole

1. Protocole de titrage

REMARQUE: Utilisez un virus cytopathique infectant les cellules adhérentes. Pour cette démonstration, le virus de la grippe A (IAV) d’origine porcine (A/California/07/2009/(H1N1)) et le virus du syndrome reproducteur et respiratoire porcin (SDRP) de type 2, souche NC 1-7-4 ont été utilisés.

1. Titrer ces virus dans 96 plaques de puits pendant 7 jours dans une armoire de biosécurité située dans un laboratoire de niveau de biosécurité 2 (BSL-2).
   1. Pour effectuer ces titrages, ensemencez 96 plaques de puits avec la lignée cellulaire requise. Pour le SDRP, utilisez la lignée cellulaire MA-10....

Résultats

Les équations utilisées pour calculer mathématiquement le titre ont été décrites ^{précédemment2,3}.

En bref, pour le SDRP, nous appliquons la méthode Karber :

Titre (TCID50) = 10 ^{T + 1,3} où:

Dans cette formule d = log négatif de la dernière dilution avec réponse vir.......

Discussion

Les titrages viraux sont couramment utilisés dans la recherche en virologie, la détection de l’UFC et les tests TCID50 étant les plus couramment ^{utilisés1,2,3,4}. Les deux méthodes reposent sur la détection du CPE dans les cellules infectées, et même si elles peuvent être évaluées visuellement par microscopie, une coloration est généralement appliquée pour obtenir un ré.......

matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
96-well cell culture plates	Genesee	25-221	Clear, flat bottom
AEC solution	Thermo Fisher	1122
Crystal violet	Thermo Fisher	C581-25; C581-100
DMEM	Corning	10-017-CV
Fetal bovine serum	BioWest	S1480
Paraformaldehide	Thermo Fisher	J19943
Primary Influenza Antibody	Bioss	BS-0344R
Primary PRRSV Antibody	Bioss	BS-10043R
Saponin	Thermo Scientific	AAA1882014
Secondaty antibody	Invitrogen	31460
Tris Hydrochloride	Thermo Scientific	AM9856