Использование кристаллической фиалки для улучшения визуального цитопатического эффекта для титрования вируса с использованием анализов TCID50

Резюме

Этот протокол показывает точный и объективный подход к визуализации титрования вируса с использованием кристаллического фиолетового, сравнивая его с оптической микроскопией и иммуноцитохимическим окрашиванием.

Аннотация

Титрование вируса является ключевым анализом для вирусологических исследований. Обнаружение цитопатического эффекта (CPE) с помощью анализов TCID50 и анализов бляшечно-образующих единиц (PFU) являются двумя основными методами расчета титра запаса вируса и часто основаны на микроскопическом обнаружении или окрашивании клеток для визуализации. В случае анализа TCID50 объективная визуализация обычно основана на иммуноцитохимическом (ICC) окрашивании внутриклеточного вируса для расчета титров в сочетании с визуальным обнаружением CPE с помощью микроскопии. Однако окрашивание ICC является дорогостоящим и трудоемким. В этом исследовании мы сравнили визуальное наблюдение CPE с помощью микроскопии, окрашивания ICC и кристаллического фиолетового окрашивания для определения титров двух CPE-образующих вирусов, вируса гриппа A (IAV) свиного происхождения и вируса репродуктивного и респираторного синдрома свиней (PRRSV). Мы показываем, что как кристаллическое фиолетовое, так и ICC окрашивание являются более точными, чем визуальное обнаружение CPE, обеспечивая почти одинаковые уровни точности как на IAV, так и на PRRSV. По этой причине здесь мы представляем кристаллическое фиолетовое окрашивание как более быстрый и доступный способ определения титрования вируса на анализе TCID50 для CPE-образующих вирусов, титрованных в клеточных линиях.

Введение

Титрование вируса с помощью анализа TCID50 является широко используемым методом в исследованиях инфекционных ^{заболеваний1}. Хотя вариации математики, лежащей в основе этого метода, были предложены с течением ^{времени1,2,3,4}, применяемые в настоящее время методы обнаружения инфекции основаны на визуальном подтверждении через наличие цитопатического эффекта (CPE) с использованием микроскопии5. Чтобы подтвердить визуализацию CPE более объективно на анализах TCID50, иммуноцитохимическое (ICC) внутриклеточное окрашивание, нацеленное на белки вируса, является одним из наиболее часто используемых ^{методов6,} поскольку различные вирусы могут продуцировать различные формы CPE. В нашем случае клеточные морфологические изменения аналогичны при заражении как вирусом гриппа А (IAV), так и вирусом репродуктивного и респираторного синдрома свиней (PRRSV), где инфицированные клетки округляются и отделяются от пластины. В случае PRRSV он вызывает CPE, известный как «полное разрушение», когда все клетки в конечном итоге отделяются от колодца. IAV, с другой стороны, может представлять как полное разрушение, так и дополнительный CPE, известный как «субтотальное разрушение», когда небольшое количество клеток не отделяется после ^{заражения7}. Однако этот метод занимает много времени и требует использования относительно дорогостоящих реагентов. Важно отметить, что ICC не маркирует CPE, а скорее количество клеток, успешно инфицированных вирусом. Это означает, что клетки, которые были успешно инфицированы к концу инкубации, будут рассматриваться как положительные, даже если инфекция еще не вызвала CPE, и, таким образом, ожидается более высокий процент положительных клеток ICC по сравнению с CPE. По этой причине в этом исследовании мы описываем дополнительный метод визуального обнаружения CPE в анализе TCID50 на основе кристаллического фиолетового, химического вещества с положительным зарядом, которое прикрепляется к клеточным мембранам и используется для окрашивания адгезивных клеток. Кристаллическая фиалка часто используется в вирусологических исследованиях для измерения бляшечных единиц, среди ^{прочих8}.

В этом исследовании мы сравниваем чувствительность обнаружения CPE в неокрашенной микроскопии с окрашиванием кристаллического фиолетового цвета и иммуноцитохимическим окрашиванием на основе распознавания вирусного белка, которое, как известно, является более объективным из-за его высокой чувствительности. Это исследование показывает, что как кристаллическое фиолетовое, так и иммуноцитохимическое окрашивание являются более точными, чем обнаружение CPE на основе визуальной микроскопии, и могут быть использованы для объективной идентификации инфицированных скважин при титровании TCID50. Учитывая их способность достигать почти одинакового уровня точности на цитопатических вирусах, протестированных в клеточных линиях, кристаллический фиолетовый представлен как более быстрый и доступный способ определения титрования вируса на анализе TCID50. Предлагаемый способ с использованием кристаллического фиолетового окрашивания занимает в общей сложности 40 мин для выполнения, с 15 мин для инкубации параформальдегида (PFA), 5 мин для инкубации кристаллической фиалки и максимум 15 мин для подготовки материала, буферной промывки и сушки. Протокол иммуноцитохимии, применяемый для сравнения, занимает в среднем 4 ч 30 мин и был выполнен так, как описано ^{ранее9,10}. Предложенный метод направлен на то, чтобы помочь визуализировать завершенное титрование вируса. Время заражения и инкубации может быть выполнено с различной компоновкой в зависимости от вируса. Здесь мы протестировали два РНК-вируса с цитопатическим действием на клеточные линии.

протокол

1. Протокол титрования

ПРИМЕЧАНИЕ: Используйте цитопатический вирус, заражающий адгезивные клетки. Для этой демонстрации использовались вирус гриппа А (IAV) свиного происхождения (A/California/07/2009/(H1N1)) и вирус репродуктивно-респираторного синдрома свиней (PRRSV) типа 2, штамм NC 1-7-4.

1. Титруйте эти вирусы в 96 луночных пластинах в течение 7 дней в шкафу биобезопасности, расположенном в лаборатории уровня биобезопасности 2 (BSL-2).
   1. Для выполнения этих титрований засейте 96 луночных пластин необходимой клеточной линией. Для PRRSV используйте клеточную линию MA-104, а для IAV используйте клеточную линию MDCK. Для клеточной культуры используйте среду DMEM, дополненную 10% FBS, L-глутамином и пенициллин-стрептомицином, и выращивайте клетки до слияния.
   2. Перед заражением промывайте клетки, используя 200 мкл PBS.
   3. Разбавляют запасы вируса с помощью 10-кратного серии разбавлений путем смешивания 900 мкл среды и 100 мкл вируса. Убедитесь, что трубка правильно вихре, чтобы обеспечить правильное смешивание среды и вируса и избежать ошибок разбавления.
   4. Отметьте расположение пластины на крышке. Промывайте колодцы 1x фосфатным солевым буфером (PBS). Добавьте 50 мкл инокулята в соответствующие скважины, следуя ранее описанным методам ^{титрования2,3}.
   5. Инкубировать при 37 °C в 5% _CO2 инкубаторе в течение 7 дней.

2. Оценка цитопатического эффекта (CPE) с помощью микроскопии

1. После 7-дневной инкубации дважды промыть все колодцы 200 мкл 1x PBS.
2. Оцените все колодцы пластины под световым микроскопом, чтобы визуально обнаружить CPE. В случае как PRRSV, так и IAV, их CPE состоит из гибели клеток и последующего отрыва от пластины, что приводит к разрушению монослоя. Однако другие вирусы могут представлять различные типы CPE.

3. Протокол окрашивания

ПРИМЕЧАНИЕ: Цитопатический эффект (CPE) оценивали с помощью кристаллического фиолетового окрашивания.

1. После 7-дневной инкубации промыть все колодцы, используя 200 мкл 1x PBS дважды.
2. Зафиксируйте клетки, добавив 50 мкл/лунку 4% параформальдегида (PFA) в 1x PBS и инкубируйте в течение 15 мин при комнатной температуре (RT).
3. После инкубации промыть клетки дважды 200 мкл 1x PBS. Затем добавляют 50 мкл/лунку кристаллической фиалки, разведенной до 4% в воде, и инкубируют в течение 5 мин при РТ.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Кристалло-фиолетовый химический окрашивает клетки, которые остаются прикрепленными к пластине в момент фиксации, оставляя участки колодца, где ячейки отделяются, как незапятнанные.
4. Наконец, аспирируйте кристалл фиолетового цвета из лунок и необязательно оставьте пластины сушиться на воздухе в течение 2-5 минут на RT или промыть пластину 200 мкл воды, чтобы удалить лишнее пятно перед визуализацией.
5. Используйте ранее описанные методы для математического вычисления титра. Здесь формула Карбера и формула Мюнха были применены для PRRSV и IAV ^{соответственно2,3}. Подробная информация об этих уравнениях представлена в разделе репрезентативных результатов.

4. Иммуноцитохимическая (ICC) маркировка

ПРИМЕЧАНИЕ: Иммуноцитохимическую маркировку для обоих вирусов проводили по ранее описанным способам9,10,11.

1. После 7-дневной инкубации титрования зафиксируйте клетки с помощью PFA, как описано в шаге 3.2.
2. Промыть пластины раствором, состоящим из 100 мл 1 М триса гидрохлорида, 1 г сапонина и 8,5 г NaCl в 900 мл _H2O. Затем завершите две дополнительные промывки смесью 1x PBS и 5% фетальной бычьей сыворотки (FBS) и инкубируйте с этим раствором Tris-Saponin-NaCl при комнатной температуре (RT) в течение 20 минут.
3. Инкубируют все лунки с первичным антителом в течение 2 ч при РТ.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Объем первичных антител для каждого вируса составлял 100 мкл и был получен с использованием разведения 1:300 2% FBS в 1x PBS.
4. Промыть клетки дважды раствором Tris, Saponin и NaCl, приготовленным на этапе 4.2.
5. Инкубируют все лунки с вторичным антителом в течение 1 ч при РТ.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Объем вторичного антитела составлял 100 мкл и был получен с использованием разведения 1:250 2% FBS в 1x PBS.
6. Промыть клетки разбавлением Tris, Saponin и NaCl, как описано в шаге 4.2.
7. Аспирировать предыдущее разведение и инкубировать пластины с 200 мкл/лунку раствора аминоэтилкарбазола (АЭК) при окончательном разведении 1:50 в воде по указанию производителя в течение 30 мин при РТ.
8. После инкубации отбросьте раствор AEC и добавьте 100 мкл/лунку 1x PBS для визуализации с помощью микроскопии.
9. Математически выведите титр, как описано в шаге 3.5.

Результаты

Уравнения, используемые для математического вычисления титра, были ранее ^{описаны2,3}.

Вкратце, для PRRSV мы применяем метод Карбера:

Титр (TCID50) = 10 ^{T + 1,3} где:

В ...

Обсуждение

Титрование вирусов обычно используется в вирусологических исследованиях, при этом наиболее часто используются определения PFU и анализы TCID501,2,3,4. Оба метода основаны на обнаружении CPE в инфицированных клетках, и хотя ?...

Материалы

Name	Company	Catalog Number	Comments
96-well cell culture plates	Genesee	25-221	Clear, flat bottom
AEC solution	Thermo Fisher	1122
Crystal violet	Thermo Fisher	C581-25; C581-100
DMEM	Corning	10-017-CV
Fetal bovine serum	BioWest	S1480
Paraformaldehide	Thermo Fisher	J19943
Primary Influenza Antibody	Bioss	BS-0344R
Primary PRRSV Antibody	Bioss	BS-10043R
Saponin	Thermo Scientific	AAA1882014
Secondaty antibody	Invitrogen	31460
Tris Hydrochloride	Thermo Scientific	AM9856