TACI : un plugin ImageJ pour l’analyse d’imagerie calcique 3D

Résumé

TrackMate Analysis of Calcium Imaging (TACI) est un plugin ImageJ open-source pour l’analyse 3D de l’imagerie calcique qui examine le mouvement sur l’axe z et identifie la valeur maximale de chaque pile z pour représenter l’intensité d’une cellule au point de temps correspondant. Il peut séparer les neurones qui se chevauchent dans la direction latérale (x / y) mais sur des plans z différents.

Résumé

La recherche en neurosciences a évolué pour utiliser des outils complexes d’imagerie et de calcul pour extraire des informations complètes à partir d’ensembles de données. L’imagerie calcique est une technique largement utilisée qui nécessite un logiciel sophistiqué pour obtenir des résultats fiables, mais de nombreux laboratoires ont du mal à adopter des méthodes de calcul lors de la mise à jour des protocoles pour répondre aux normes modernes. Des difficultés surviennent en raison d’un manque de connaissances en programmation et de paywalls pour les logiciels. De plus, les cellules d’intérêt affichent des mouvements dans toutes les directions pendant l’imagerie calcique. De nombreuses approches ont été développées pour corriger le mouvement dans la direction latérale (x/y).

Ce document décrit un flux de travail utilisant un nouveau plug-in ImageJ, TrackMate Analysis of Calcium Imaging (TACI), pour examiner le mouvement sur l’axe z en imagerie calcique 3D. Ce logiciel identifie la valeur de fluorescence maximale de toutes les positions z dans lesquelles un neurone apparaît et l’utilise pour représenter l’intensité du neurone à la position t correspondante. Par conséquent, cet outil peut séparer les neurones qui se chevauchent dans la direction latérale (x / y) mais apparaissent sur des plans z distincts. En tant que plugin ImageJ, TACI est un outil de calcul convivial et open-source pour l’analyse d’imagerie calcique 3D. Nous avons validé ce flux de travail en utilisant des neurones thermosensibles aux larves de mouches qui affichaient des mouvements dans toutes les directions pendant la fluctuation de température et un ensemble de données d’imagerie calcique 3D acquises à partir du cerveau de la mouche.

Introduction

Le taux de calcium intracellulaire est un marqueur précis de l’excitabilité neuronale. L’imagerie calcique mesure les changements dans le calcium intracellulaire pour comprendre l’activité neuronale¹. Les études en neurosciences ont de plus en plus utilisé cette méthode en raison du développement de techniques de mesure de la concentration intracellulaire de calcium, y compris des indicateurs de calcium génétiquement codés (GECI), tels que GCaMP^2,3, qui peuvent être exprimés de manière non invasive dans des ensembles spécifiques de neurones par des approches génétiques. La baisse des co....

Protocole

1. Imagerie calcique

1. Préparation des larves de mouches
   NOTE: Les mouches et les larves sont maintenues à 25 ° C sous un cycle lumière:obscurité de 12 h:12 h.
   1. Anesthésiez les mouches avec du CO₂. Trier 20 à 45 mâles et 20 à 45 femelles dans chaque flacon de mouches et leur donner au moins 24 h à 48 h pour se remettre de l’exposition au CO₂ .
      REMARQUE : L’exposition des mouches au CO₂ devrait durer le moins longtemps possible.
   2. Pour synchroniser l’âge des larves, tapotez les mouches dans de nouveaux flacons contenant des granules de levure et laissez-leur pondre 4 à 8 heures pour pondre d....

Résultats

Flux de travail d’analyse d’imagerie calcique 3D
Dans cette étude, nous avons développé un nouveau plugin ImageJ, TACI, et décrit un flux de travail pour suivre la dérive z et analyser l’imagerie calcique 3D qui identifie les réponses des cellules individuelles apparaissant dans plusieurs positions z (Figure 1). Cet outil a quatre fonctions : RENOMMER, ORGANISER, EXTRAIRE et FUSIONNER. Tout d?.......

Discussion

Cette étude a développé un nouveau plugin ImageJ, TACI, et décrit un flux de travail analysant l’imagerie calcique 3D. De nombreux outils actuellement disponibles se concentrent sur la correction du mouvement x/y, bien que le mouvement sur l’axe z doive également être explicitement diagnostiqué ou corrigé⁶. Lors de l’acquisition d’images dans un organisme vivant, le mouvement sur l’axe z est inévitable même lorsque l’organisme est immobilisé, et certains stimuli, tels que le.......

matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
Blunt Fill Needel	BD	303129
Calcium chloride dihydrate	Fisher Scientific	10035-04-8	Fly food ingredient
Carbon dioxide	Airgas	UN1013	Size 200 High Pressure Steel Cylinder
CO2 bubbler kit	Genesee	59-180
Confocal microscope LSM880	Zeiss	4109002107876000	An inverted Axio Observer Z1, equipped with 5 lasers, 2 standard PMT detectors, 32-channel GaAsP dectectors, an Airyscan detector, and Definite Focus.2.
DAQami software	Measurement Computing
Dextrose	Genesee	62-113	Fly food ingredient
Drosophila Agar	Genesee	66-111	Fly food ingredient
Ethanol	Decon Labs, Inc.	64-17-5	Fly food ingredient
Fly line: Ir21a-Gal4	Dr. Paul Garrity lab		A kind gift
Fly line: Ir21a-Gal80	Dr. Lina Ni lab
Fly line: Ir68a-Gal4	Dr. Aravinthan DT Samuel lab		A kind gift
Fly line: Ir93a-Gal4	Dr. Paul Garrity lab		A kind gift
Fly line: UAS-GCaMP6	Bloomington Drosophila Stock Center	42750
Flypad	Genesee	59-114
General purpose forged brass regulator	Gentec	G152
Gibco PBS pH 7.4 (1x)	Thermo Fisher Scientific	10010-031
Green Drosophila tubing	Genesee	59-124
Heat transfer compound	MG Chemicals	860-60G
Heatsink	Digi-Key Electronics	ATS2193-ND	Resize to 12.9 x 5.5 cm
Illuminator	AmScope	LED-6W
Inactive Dry Yeast	Genesee	62-108	Fly food ingredient
Incubator	Pervical	DR-41VL	Light: dark cycle: 12h:12h; temperature: 25 °C; humidity: 40-50% RH.
Methyl-4-hydroxybenzoate	Thermo Scientific	126965000	Fly food ingrediete
Micro cover glass	VWR	48382-126	22 x 40 mm
Microscope slides	Fisher Scientific	12-544-2	25 x 75 x 1.0 mm
Nail polish	Kleancolor
Narrow Drosophila vials	Genesee	32-113RL
Objective	Zeiss	420852-9871-000	LD LCI Plan-Apochromat 25x/0.8 Imm Corr DIC M27
Peltier cooling module	TE Technology	TE-127-1.0-0.8	30 x 30 mm
Plugs	Genesee	49-102
Power Supply	Circuit Specialists	CSI1802X	10 volt DC 2.0 amp linear bench power supply
Princeton Artist Brush Nepture	Princeton Artist Brush Co.		Series 4750, size 2
Sodium potassium L-tartrate tetrahydrate	Thermo Scientific	033241-36	Fly food ingredient
Stage insert	Wienecke and Sinske	432339-9030-000
Stereo Microscope	Olympus	SZ61	Any stereo microscope works
T-Fitting	Genesee	59-123
Thermocouple data acquisition device	Measurement Computing	USB-2001-TC	Single channel
Thermocouple microprobe	Physitemp	IT-24P
Yellow Cornmeal	Genesee	62-101	Fly food ingredient
Z-axis piezo stage	Wienecke and Sinske	432339-9000-000