TACI: un plugin ImageJ per l'analisi 3D dell'imaging del calcio

Riepilogo

TrackMate Analysis of Calcium Imaging (TACI) è un plugin ImageJ open source per l'analisi 3D dell'imaging del calcio che esamina il movimento sull'asse z e identifica il valore massimo di ogni z-stack per rappresentare l'intensità di una cella nel punto temporale corrispondente. Può separare i neuroni che si sovrappongono nella direzione laterale (x / y) ma su diversi piani z.

Abstract

La ricerca nelle neuroscienze si è evoluta per utilizzare complessi strumenti di imaging e computazionali per estrarre informazioni complete dai set di dati. L'imaging del calcio è una tecnica ampiamente utilizzata che richiede un software sofisticato per ottenere risultati affidabili, ma molti laboratori faticano ad adottare metodi computazionali quando aggiornano i protocolli per soddisfare gli standard moderni. Le difficoltà sorgono a causa della mancanza di conoscenze di programmazione e paywall per il software. Inoltre, le cellule di interesse mostrano movimenti in tutte le direzioni durante l'imaging del calcio. Sono stati sviluppati molti approcci per correggere il movimento nella direzione laterale (x/y).

Questo documento descrive un flusso di lavoro che utilizza un nuovo plug-in ImageJ, TrackMate Analysis of Calcium Imaging (TACI), per esaminare il movimento sull'asse z nell'imaging 3D del calcio. Questo software identifica il valore massimo di fluorescenza da tutte le posizioni z in cui appare un neurone e lo utilizza per rappresentare l'intensità del neurone nella posizione t corrispondente. Pertanto, questo strumento può separare i neuroni che si sovrappongono nella direzione laterale (x / y) ma appaiono su piani z distinti. Come plug-in ImageJ, TACI è uno strumento computazionale open source e facile da usare per l'analisi 3D dell'imaging del calcio. Abbiamo convalidato questo flusso di lavoro utilizzando neuroni termosensibili larvali di mosca che mostravano movimenti in tutte le direzioni durante la fluttuazione della temperatura e un set di dati di imaging del calcio 3D acquisito dal cervello del moscerino.

Introduzione

Il livello di calcio intracellulare è un marcatore preciso di eccitabilità neuronale. L'imaging del calcio misura i cambiamenti nel calcio intracellulare per comprendere l'attività neuronale¹. Gli studi nelle neuroscienze hanno sempre più utilizzato questo metodo a causa dello sviluppo di tecniche per misurare la concentrazione intracellulare di calcio, compresi gli indicatori di calcio geneticamente codificati (GECI), come GCaMP^2,3, che possono essere espressi in modo non invasivo in specifici gruppi di neuroni attraverso approcci genetici. I minori costi dei laser e dei componenti del microscopio hanno anche aumentato l'uso dell'imaging del calcio⁴. È importante sottolineare che l'imaging del calcio consente di registrare e studiare contemporaneamente singoli neuroni e grandi popolazioni di neuroni in animali che si muovono liberamente⁵.

Tuttavia, l'analisi dei dati di imaging del calcio è impegnativa perché (1) comporta il monitoraggio dei cambiamenti nella fluorescenza delle singole cellule nel tempo, (2) il segnale di fluorescenza scompare o riappare in modo intermittente con risposte neuronali e (3) i neuroni possono muoversi in tutte le direzioni, in particolare dentro e fuori da un piano focale o apparire su più piani^{4, 6}. L'analisi manuale richiede molto tempo e diventa poco pratica con l'aumentare della lunghezza delle registrazioni e del numero di neuroni. Sono stati sviluppati vari programmi software per accelerare il processo di analisi dell'imaging del calcio. In precedenza, il software era stato progettato in un contesto sperimentale limitato, rendendo difficile per altri laboratori adottarlo. I recenti sforzi per soddisfare i moderni standard per la condivisione del software hanno portato allo sviluppo di diversi strumenti in grado di analizzare costantemente i dati di imaging del calcio in diversi gruppi 7,8,9,10,11,12,13,14,15,16,17,18,19 . Tuttavia, la maggior parte di questi strumenti richiede conoscenze di programmazione e / o dipende da software commerciali. La mancanza di conoscenze di programmazione e paywall software scoraggiano i ricercatori dall'adottare questi metodi. Inoltre, molti di questi strumenti si concentrano sulla correzione del movimento x/y, sebbene anche il movimento sull'asse z debba essere esplicitamente diagnosticato e corretto⁶. C'è bisogno di uno strumento computazionale per analizzare l'imaging 3D del calcio che si concentra sui neuroni che mostrano z-drift e appaiono su più piani z. Idealmente, questo strumento dovrebbe utilizzare software open source e non richiedere conoscenze di programmazione per consentire ad altri laboratori di adottarlo prontamente.

Qui, abbiamo sviluppato un nuovo plug-in ImageJ, TACI, per analizzare i dati di imaging 3D del calcio. Innanzitutto, il software rinomina, se necessario, e organizza i dati di imaging del calcio 3D per posizioni z. Le celle di interesse sono tracciate in ogni posizione z e le loro intensità di fluorescenza sono estratte da TrackMate o altri strumenti computazionali. TACI viene quindi applicato per esaminare il movimento sull'asse z. Identifica il valore massimo di uno z-stack e lo utilizza per rappresentare l'intensità di una cella nel punto temporale corrispondente. Questo flusso di lavoro è adatto all'analisi dell'imaging 3D del calcio con movimento in tutte le direzioni e / o con neuroni sovrapposti nella direzione laterale (x / y) ma che appaiono in diverse posizioni z. Per convalidare questo flusso di lavoro, sono stati utilizzati set di dati di imaging del calcio 3D da neuroni termosensibili larvali di mosca e neuroni di funghi nel cervello. Da notare che TACI è un plugin ImageJ open source e non richiede alcuna conoscenza di programmazione.

Protocollo

1. Imaging del calcio

1. Preparazione delle larve di mosca
   NOTA: Le mosche e le larve sono mantenute a 25 °C in un ciclo luce:buio di 12 ore:12 ore.
   1. Anestetizzare le mosche con CO₂. Ordinare 20-45 maschi e 20-45 femmine in ogni fiala di mosca e dare loro almeno 24 ore a 48 ore per riprendersi dall'esposizione a CO₂ .
      NOTA: L'esposizione della mosca alla CO₂ dovrebbe durare per il minor tempo possibile.
   2. Per sincronizzare l'età delle larve, picchiettare le mosche in nuove fiale contenenti granuli di lievito e consentire loro 4-8 ore per deporre le uova. Rimuovere le mosche capovolgendoli in nuove fiale.
   3. Raccogliere le larve a 72 h utilizzando 10 ml di soluzione di saccarosio al 20% p/v.
2. Configurazione del microscopio e del controllo della temperatura
   1. Eseguire l'imaging su un microscopio confocale (vedere la tabella dei materiali) e uno stadio piezoelettrico sull'asse z con un inserto di palcoscenico utilizzando le seguenti impostazioni: laser, Argon; modalità di scansione, fotogramma; dimensione del fotogramma, 512 x 512; velocità, massimo; canali/profondità di bit, 1/8 bit; zoom, 1,5; z-stack, fetta = 15, Keep = fetta; dispositivi di messa a fuoco e strategia, messa a fuoco definita; messa a fuoco, Focus definitivo su.
   2. Collegare un modulo di raffreddamento Peltier a un dissipatore di calore dal composto di trasferimento del calore per costruire un dispositivo di raffreddamento termoelettrico. Il Peltier è alimentato da un alimentatore da 2 A.
   3. Collegare una microsonda a termocoppia a un dispositivo di acquisizione dati per registrare la temperatura.
3. Imaging del calcio
   1. Risciacquare le larve 3 volte in 1x soluzione salina tamponata con fosfato (PBS).
   2. Pipettare 75 μL di 1x PBS al centro di un vetrino.
   3. Metti una o due larve in 1x PBS e posiziona la microsonda della termocoppia vicino alle larve.
      NOTA: La distanza tra le larve e la microsonda deve essere ~ 5 mm. Le larve possono muoversi se la microsonda è posizionata troppo vicino a loro. Una grande distanza potrebbe comportare letture di temperatura imprecise.
   4. Coprire le larve e la microsonda della termocoppia con un vetrino. Sigillare la copertina con lo smalto.
   5. Posizionare il vetrino sul palco del microscopio, trovare la messa a fuoco utilizzando un obiettivo 25x e posizionare il dispositivo di raffreddamento termoelettrico sul vetrino.
      NOTA: Il Peltier viene posizionato direttamente sul vetrino dove le larve devono erogare gli stimoli di temperatura.
   6. Nel software confocale, concentrarsi sulle cellule fluorescenti di interesse. Regolare la potenza del laser per evitare la sovrasaturazione. Impostate la prima e l'ultima posizione della sezione nell'impostazione z-stack.
      NOTA: utilizzare la potenza laser più bassa possibile prima della registrazione per evitare lo sbiancamento fotografico.
   7. Avviare contemporaneamente la scansione z-stack e la registrazione della temperatura.
   8. Controllare l'alimentatore che alimenta il Peltier per modificare la temperatura superficiale Peltier. Accendere l'alimentatore per diminuire la temperatura e spegnerlo per aumentare la temperatura.
   9. Interrompere la scansione z-stack e la registrazione della temperatura.

2. Analisi dei dati di imaging del calcio 3D

1. Esportare i dati di imaging del calcio in file TIFF e salvarli in una cartella con lo stesso nome del nome di base dei file TIFF all'interno.
   Nota : il nome del file non deve contenere virgole.
   1. Utilizzare i seguenti parametri per esportare i dati di imaging del calcio da ZEN (edizione nera): tipo di file, TIFF; compressione, LZW; canali, 2; Posizione Z, tutti; tempo, tutto; fase, 1; regione, pieno.
2. Installazione
   1. Scarica TACI-Calcium_Imaging.jar da Github (https://github.com/niflylab/TACI_CalciumImagingPlugin/releases).
   2. Installa il plugin in FIJI facendo clic su Plugin nella barra dei menu e quindi facendo clic su Installa nel menu a discesa (Plugin | Installare). Quindi, riavviare FIJI.
      NOTA: NON utilizzare plugin | Installa plugin.
   3. Esegui il plugin facendo clic su Plugins e quindi scegliendo TACI-Calcium Imaging (Plugin | TACI-Calcio Imaging).
3. Utilizzare la funzione RENAME per convertire i nomi di file TIFF nella struttura richiesta.
   Nota : lo strumento utilizza filename_h#t#z#c#.tif come struttura predefinita (h# e c# sono facoltativi; #: un numero intero positivo). Se i nomi dei file di immagine non sono nella struttura predefinita, è necessario eseguire la funzione RENAME .
   1. Scegliere la cartella in cui è necessario rinominare le immagini TIFF facendo clic su Sfoglia cartelle.
   2. Immettere le informazioni sul parametro. Sono elencati cinque parametri, tra cui Nome file, Fase, Max T-Position, Max Z-Position e Canale. Ogni parametro ha tre valori: Testo precedente, Valore parametro e Ordine.
      Nota : le informazioni fanno distinzione tra maiuscole e minuscole. Se i nomi dei file di immagine contengono una frase prima di un parametro, inserire la frase come testo precedente del parametro corrispondente. Se i nomi dei file immagine contengono una frase dopo tutti i parametri, inserisci la frase come testo del post.
      1. Assicurarsi di immettere Nome file, Max T-Position e Max Z-Position e che i valori dei parametri per Max T-Position e Max Z-Position includano tutte le cifre.
      2. Attendere che il nome del file venga riempito automaticamente utilizzando il nome della cartella.
      3. Se i nomi dei file TIFF non includono la fase e il canale, lasciate vuoto il valore del parametro corrispondente e scegliete Na in Ordine.
   3. Fare clic su Rinomina per creare una cartella con lo stesso nome e lo stesso _r. Si noti che nella cartella, i nomi dei file TIFF sono stati ristrutturati per essere compatibili con la funzione ORGANIZZA .
      NOTA: _r è stato aggiunto ai nomi dei file delle immagini TIFF.
4. Utilizzare la funzione ORGANIZZA per salvare le immagini TIFF dalla stessa posizione z in una cartella.
   Nota : il nome della cartella deve avere lo stesso nome del nome di base dei file TIFF all'interno e NON deve avere virgole.
   1. Scegliere la cartella in cui è necessario organizzare le immagini TIFF facendo clic su Sfoglia cartelle.
   2. Se il file CSV dei parametri (param.csv) esiste, attendere che i valori dei parametri vengano compilati automaticamente.
      Nota : il file param.csv ha un formato richiesto. I parametri, inclusi nome file, fase, position_t, position_z, canale e is_gray, devono essere compilati nella riga 1 da sinistra a destra a partire dalla colonna A. I valori corrispondenti per ciascun parametro devono essere compilati nella riga 2.
   3. Se il file CSV del parametro (param.csv) non esiste, inserire manualmente i valori dei parametri. Assicurarsi che i valori dei parametri di Fase e Canale includano lettere, mentre i valori dei parametri di Posizione T e Posizione Z dovrebbero essere i numeri più grandi delle posizioni T e Z. Se i nomi dei file di immagine non includono la fase o il canale, immettete Na.
   4. Crea immagini TIFF in scala di grigi quando necessario. Lascia deselezionata la casella Le immagini sono grigie? per ridimensionare le immagini.
   5. Fare clic su Organizza per creare una cartella con lo stesso nome e _gray_stacks e per generare cartelle con lo stesso nome e _# (#: posizioni z) nella cartella. Osservare che i file TIFF sono ordinati nelle cartelle corrispondenti da z-positions e che viene generato un file denominato param.csv, in cui è possibile trovare i parametri e i loro valori.
5. Usa TrackMate nelle FIJI per estrarre le intensità di fluorescenza delle celle di interesse da ogni posizione z.
   NOTA: questo passaggio può essere eseguito anche da altri software di imaging.
   1. Aprire le immagini TIFF in una cartella z-position di FIJI.
   2. Esegui TrackMate facendo clic su Plugin | Monitoraggio | TrackMate e regolare i seguenti parametri, se necessario.
      1. Utilizzare rilevatori DoG o LoG.
      2. Modificare il diametro del BLOB, la soglia e il filtro mediano. Regolare il diametro del BLOB in modo che sia simile al diametro delle celle. Se le celle sono ovali, regolare il diametro del BLOB in modo che sia simile all'asse secondario.
         NOTA: l'aumento della soglia consente di evitare che il rumore di fondo venga rilevato come segnale senza influire sull'intensità del segnale (Figura supplementare 1). Tuttavia, un aumento della soglia può mancare di segnali reali (figura supplementare 1). Se i segnali sono forti, utilizzare il filtro mediano per ridurre il rumore sale e pepe.
      3. Impostare i filtri per rimuovere alcuni, se non tutti, i segnali irrilevanti. I filtri X e Y sono filtri spaziali. Utilizzare i filtri X e Y per rimuovere i segnali irrilevanti che sono distanti dai segnali reali.
         NOTA: quando i filtri sono impostati su un'immagine, è fondamentale controllare tutte le altre immagini per assicurarsi che i segnali reali non vengano rimossi.
      4. Impostate la distanza massima di collegamento, la distanza massima di chiusura dello spazio e la distanza massima di fotogramma di chiusura della fessura. Impostare la distanza massima di collegamento e la distanza massima di chiusura del gap su 3x-5x il diametro del blob, soprattutto quando i campioni si spostano in modo significativo nel tempo, per ridurre il numero di tracce. Impostate lo spazio massimo tra fotogrammi che chiude lo spazio sul numero di immagini nella pila.
      5. Esportare le intensità di fluorescenza delle regioni di interesse (ROI) in un file CSV. Se viene utilizzata una versione precedente di TrackMate, scegli Esporta tutte le statistiche degli spot nella finestra Seleziona un'azione . Se la versione di TrackMate è 7.6.1 o successiva, scegli Spot nella finestra Opzioni di visualizzazione . Esporta o salva come file interattivi in file CSV.
         NOTA: entrambi i file sono interattivi con la finestra immagine; evidenziando un ROI viene visualizzato il ROI corrispondente nella finestra dell'immagine. Questi file includono le intensità medie (MEAN_INTENSITY o MEAN_INTENSITY_CH1) delle celle di interesse nei corrispondenti punti temporali (POSITION_T). La stessa TRACK_IDs dovrebbe rappresentare gli stessi ROI in momenti diversi. Tuttavia, questo non è sempre vero e potrebbe essere necessario correggerlo manualmente, quando necessario. Se TrackMate non riconosce i ROI in alcuni punti temporali, tali punti temporali non vengono visualizzati.
6. Estrarre l'intensità della fluorescenza di fondo e creare il file Background_list.csv.
   NOTA: In questo studio, l'intensità di fondo per ogni posizione z è stata stimata utilizzando il valore medio di tre o cinque blob vicini della stessa dimensione che non contenevano segnali di fluorescenza e provenivano da punti temporali diversi.
   1. Il file Background_list.csv ha un formato richiesto: ogni colonna contiene le informazioni di un neurone, a partire dal neurone 0. Inserisci i numeri dei neuroni, ad esempio Neurone 0, nella riga 1. Quindi, fornire l'intensità di fondo per ogni posizione z analizzata: se vengono analizzate cinque posizioni z per il neurone 0, compilare cinque valori di intensità di sfondo sotto il neurone 0.
      Nota : il file di Background_list.csv è necessario per la funzione TACI EXTRACT . Se lo sfondo è trascurabile, deve essere fornito il Background_list.csv con l'intensità di fondo zero di ogni neurone.
7. Utilizzare la funzione EXTRACT per identificare le intensità massime di fluorescenza in ciascuna posizione t e calcolare ΔF/F₀ come mostrato nell'equazione (1).
   (1)
   1. Creare una cartella e assegnarle un nome utilizzando il numero del neurone, a partire dal neurone 0. Salvare i file CSV contenenti le informazioni sulla fluorescenza del neurone corrispondente nella cartella. Ogni file CSV contiene le informazioni di una posizione z, quindi il numero di file CSV è uguale al numero di posizioni z analizzate. Assegna ai file CSV il nome Mean_Intensity#.csv (# rappresenta la posizione z) e ogni file CSV include almeno due colonne: POSITION_T e MEAN_INTENSITY o MEAN_INTENSITY_CH1.
      NOTA: creare una cartella per ogni cella di interesse.
   2. Salvare il file Background_list.csv e le cartelle create nel passaggio 2.7.1 in un'unica cartella. Scegli questa cartella facendo clic su Sfoglia file.
      Nota : il numero di valori di sfondo nel file Background_list.csv deve corrispondere al numero dei file Mean_Intensity#.csv per ogni neurone.
   3. Il file di sfondo viene compilato automaticamente. Compila il maggior numero di posizioni T per il numero di posizioni T.
   4. Fare clic su Estrai per creare una cartella dei risultati, inclusi i file CSV e i grafici per ciascun neurone. I file CSV includono informazioni sulla massima intensità di fluorescenza e ΔF/F₀ in ogni posizione t. I grafici sono grafici a linee di ΔF/F₀ su posizioni t.
      NOTA: In questo studio, ΔF/F₀ è stato calcolato utilizzando l'equazione (1). Il primo valore di ogni posizione z è stato utilizzato come F₀. Se questo F₀ non è appropriato²⁰, il plugin fornisce file che includono dati grezzi per ciascun neurone nella cartella python_files.
8. Utilizzare la funzione MERGE per calcolare la media del ΔF/F₀ di ciascun neurone, calcolare il SEM e tracciare il ΔF/F₀ medio sulle posizioni t.
   1. Scegliere la cartella dei risultati creata dalla funzione EXTRACT facendo clic su Sfoglia file.
   2. Compila il numero di posizioni T con il maggior numero di posizioni T .
   3. Fare clic su Unisci per creare una cartella merged_data, inclusi un file di merged_data.csv e un grafico Average_dF_F0.png. Il file CSV include le informazioni sulla media e SEM ΔF/F₀ in ogni posizione t. Il grafico è un grafico a linee della media ΔF/F₀ sulle posizioni t.

Risultati

Flusso di lavoro di analisi 3D di imaging del calcio
In questo studio, abbiamo sviluppato un nuovo plug-in ImageJ, TACI, e descritto un flusso di lavoro per tracciare la deriva z e analizzare l'imaging 3D del calcio che individua le risposte delle singole cellule che appaiono in più posizioni z (Figura 1). Questo strumento ha quattro funzioni: RENAME, ORGANIZE, EXTRACT e MERGE. Innanzitutto, se i nomi de...

Discussione

Questo studio ha sviluppato un nuovo plug-in ImageJ, TACI, e ha descritto un flusso di lavoro che analizza l'imaging 3D del calcio. Molti strumenti attualmente disponibili si concentrano sulla correzione del movimento x/y, sebbene anche il movimento sull'asse z debba essere esplicitamente diagnosticato o corretto⁶. Durante l'acquisizione di immagini in un organismo vivo, il movimento sull'asse z è inevitabile anche quando l'organismo è immobilizzato e alcuni stimoli, come il cambiamento di tempe...

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
Blunt Fill Needel	BD	303129
Calcium chloride dihydrate	Fisher Scientific	10035-04-8	Fly food ingredient
Carbon dioxide	Airgas	UN1013	Size 200 High Pressure Steel Cylinder
CO2 bubbler kit	Genesee	59-180
Confocal microscope LSM880	Zeiss	4109002107876000	An inverted Axio Observer Z1, equipped with 5 lasers, 2 standard PMT detectors, 32-channel GaAsP dectectors, an Airyscan detector, and Definite Focus.2.
DAQami software	Measurement Computing
Dextrose	Genesee	62-113	Fly food ingredient
Drosophila Agar	Genesee	66-111	Fly food ingredient
Ethanol	Decon Labs, Inc.	64-17-5	Fly food ingredient
Fly line: Ir21a-Gal4	Dr. Paul Garrity lab		A kind gift
Fly line: Ir21a-Gal80	Dr. Lina Ni lab
Fly line: Ir68a-Gal4	Dr. Aravinthan DT Samuel lab		A kind gift
Fly line: Ir93a-Gal4	Dr. Paul Garrity lab		A kind gift
Fly line: UAS-GCaMP6	Bloomington Drosophila Stock Center	42750
Flypad	Genesee	59-114
General purpose forged brass regulator	Gentec	G152
Gibco PBS pH 7.4 (1x)	Thermo Fisher Scientific	10010-031
Green Drosophila tubing	Genesee	59-124
Heat transfer compound	MG Chemicals	860-60G
Heatsink	Digi-Key Electronics	ATS2193-ND	Resize to 12.9 x 5.5 cm
Illuminator	AmScope	LED-6W
Inactive Dry Yeast	Genesee	62-108	Fly food ingredient
Incubator	Pervical	DR-41VL	Light: dark cycle: 12h:12h; temperature: 25 °C; humidity: 40-50% RH.
Methyl-4-hydroxybenzoate	Thermo Scientific	126965000	Fly food ingrediete
Micro cover glass	VWR	48382-126	22 x 40 mm
Microscope slides	Fisher Scientific	12-544-2	25 x 75 x 1.0 mm
Nail polish	Kleancolor
Narrow Drosophila vials	Genesee	32-113RL
Objective	Zeiss	420852-9871-000	LD LCI Plan-Apochromat 25x/0.8 Imm Corr DIC M27
Peltier cooling module	TE Technology	TE-127-1.0-0.8	30 x 30 mm
Plugs	Genesee	49-102
Power Supply	Circuit Specialists	CSI1802X	10 volt DC 2.0 amp linear bench power supply
Princeton Artist Brush Nepture	Princeton Artist Brush Co.		Series 4750, size 2
Sodium potassium L-tartrate tetrahydrate	Thermo Scientific	033241-36	Fly food ingredient
Stage insert	Wienecke and Sinske	432339-9030-000
Stereo Microscope	Olympus	SZ61	Any stereo microscope works
T-Fitting	Genesee	59-123
Thermocouple data acquisition device	Measurement Computing	USB-2001-TC	Single channel
Thermocouple microprobe	Physitemp	IT-24P
Yellow Cornmeal	Genesee	62-101	Fly food ingredient
Z-axis piezo stage	Wienecke and Sinske	432339-9000-000