Isolement de vecteurs viraux adéno-associés au moyen d’un protocole de chromatographie d’affinité d’héparine en une seule étape et semi-automatisé

Résumé

Ce manuscrit décrit un protocole détaillé pour la génération et la purification de vecteurs viraux adéno-associés à l’aide d’une méthode de chromatographie d’affinité optimisée basée sur l’héparine. Il s’agit d’une approche simple, évolutive et rentable, qui élimine le besoin d’ultracentrifugation. Les vecteurs résultants présentent une pureté et une activité biologique élevées, ce qui prouve leur valeur dans les études précliniques.

Résumé

Le virus adéno-associé (AAV) est devenu un vecteur de plus en plus précieux pour l’administration de gènes in vivo et fait actuellement l’objet d’essais cliniques sur l’homme. Cependant, les méthodes couramment utilisées pour purifier les AAV utilisent l’ultracentrifugation par gradient de densité au chlorure de césium ou à l’iodixanol. Malgré leurs avantages, ces méthodes prennent du temps, ont une évolutivité limitée et aboutissent souvent à des vecteurs de faible pureté. Pour pallier ces contraintes, les chercheurs s’intéressent aux techniques de chromatographie. Nous présentons ici un protocole de chromatographie d’affinité optimisé basé sur l’héparine qui sert d’étape de capture universelle pour la purification des AAV.

Cette méthode repose sur l’affinité intrinsèque du sérotype 2 de l’AAV (AAV2) pour les protéoglycanes de sulfate d’héparane. Plus précisément, le protocole implique la co-transfection de plasmides codant pour les protéines de capside AAV souhaitées avec celles d’AAV2, produisant des vecteurs AAV mosaïques qui combinent les propriétés des deux sérotypes parentaux. En bref, après la lyse des cellules productrices, un mélange contenant des particules d’AAV est directement purifié selon un protocole de chromatographie d’affinité d’héparine optimisé en une seule étape à l’aide d’un système standard de chromatographie liquide à protéines rapides (FPLC). Les particules d’AAV purifiées sont ensuite concentrées et soumises à une caractérisation complète en termes de pureté et d’activité biologique. Ce protocole offre une approche simplifiée et évolutive qui peut être réalisée sans avoir besoin d’ultracentrifugation et de gradients, ce qui permet d’obtenir des titres viraux nets et élevés.

Introduction

Le vecteur viral adéno-associé (AAV) est en train de se frayer un chemin comme l’un des systèmes d’administration les plus prometteurs dans les études actuelles sur la thérapie génique. Initialement identifié en 1965¹, l’AAV est un petit virus non enveloppé, avec une capside protéique icosaédrique d’environ 25 nm de diamètre, hébergeant un génome d’ADN simple brin. Les AAV appartiennent à la famille des Parvoviridae et au genre Dependoparvovirus en raison de leur dépendance unique à la co-infection avec un virus auxiliaire, tel que le virus de l’herpès simplex ou, plus fréquemment, l’adénovirus, pour compléter leur cycle lytique ^2,3.

Le génome de 4,7 kilobases des AAV se compose de deux cadres de lecture ouverts (ORF) flanqués de deux répétitions terminales inversées (ITR) qui forment des extrémités en épingle à cheveux caractéristiques en forme de T⁴. Les ITR sont les seuls éléments cis essentiels pour l’emballage, la réplication et l’intégration des AAV, étant donc les seules séquences AAV conservées dans les vecteurs AAV recombinants (rAAV). Dans ce système, les gènes nécessaires à la production du vecteur sont fournis séparément, en trans, ce qui permet au gène d’intérêt d’être emballé à l’intérieur de la capside virale ^5,6.

Chaque gène viral codifie différentes protéines par le biais d’épissages alternatifs et de codons de départ. Au sein de l’ORF Rep, quatre protéines non structurales (Rep40, Rep52, Rep68 et Rep78) sont codées, jouant un rôle crucial dans la réplication, l’intégration spécifique au site et l’encapsulation de l’ADN viral ^7,8. Le Cap ORF sert de modèle pour l’expression de trois protéines structurelles différentes les unes des autres à leur N-terminale (VP1, VP2 et VP3), qui s’assemblent pour former une capside virale de 60 mères dans un rapport de 1:1:10 ^4,9. De plus, un ORF alternatif imbriqué dans le gène Cap avec un codon de départ CUG non conventionnel code pour une protéine d’activation de l’assemblage (AAP). Il a été démontré que cette protéine nucléaire interagit avec les protéines de capside VP1-3 nouvellement synthétisées et favorise l’assemblage de la capside^10,11.

Les différences dans la séquence d’acides aminés de la capside expliquent les 11 sérotypes AAV naturels et plus de 100 variantes isolées dans les tissus humains et non humains ^7,12,13. Les variations de conformation des régions structurellement variables régissent les propriétés antigéniques distinctes et les spécificités de liaison aux récepteurs des capsides de différentes souches. Il en résulte des tropismes tissulaires distincts et des efficacités de transduction entre différents organes de mammifères¹⁴.

Les premières méthodes de production des rAAV reposaient sur l’infection à adénovirus^à des fins d’aide 15,16,17,18,19. Bien qu’elle soit efficace et généralement facile à produire à grande échelle, plusieurs problèmes découlent de cette infection. Même après la purification et une étape de dénaturation thermique pour l’inactivation, des particules adénovirales peuvent toujours être présentes dans les préparations AAV, ce qui constitue un problème de sécurité indésirable²⁰. De plus, la présence de protéines adénovirales dénaturées est inacceptable pour un usage clinique. D’autres stratégies de production tirent parti des souches recombinantes du virus de l’herpès simplex conçues pour apporter le Rep/Cap et le transgène dans les cellules cibles²¹ ou du système cellulaire baculovirus-insecte²². Bien que ces systèmes offrent des avantages en termes d’évolutivité et de compatibilité GMP, ils sont toujours confrontés à des problèmes similaires.

La méthode de triple transfection pour la production de rAAV a été couramment adoptée pour surmonter facilement ces problèmes. En bref, l’assemblage du rAAV repose sur la transfection transitoire de cellules avec trois plasmides codant pour : 1) la cassette d’expression du transgène emballée entre les ITR du génome AAV2 de type sauvage (pITR) ; 2) les séquences Rep/Cap nécessaires à la réplication et à l’assemblage des virions (pAAV-RC) ; et 3) les protéines adénovirales minimales (E1A, E1B, E4 et E2A) ainsi que les ARN associés au virus adénoviral nécessaires à l’effet auxiliaire (pHelper)^6,20,23. Bien que les méthodes de transfection plasmidique offrent simplicité et flexibilité pour la production de rAAV dans les études précliniques, ces procédures présentent des limites en termes d’évolutivité et de reproductibilité lorsqu’elles sont appliquées à une production à grande échelle. En tant qu’approche alternative, la production de rAAV peut être réalisée par l’utilisation de lignées cellulaires productrices d’AAV (à croissance adhérente et en suspension), exprimant de manière stable soit les gènes AAV Rep/Cap, soit Rep/Cap en combinaison avec des constructions vectorielles. Dans ces systèmes, les gènes adénoviraux auxiliaires sont introduits par transfection plasmidique. Même si cette stratégie améliore l’évolutivité du processus de culture cellulaire, elle est techniquement complexe et prend du temps 21,24,25.

Dans les deux cas, les cellules productrices sont ensuite lysées et soumises à une ou plusieurs étapes de purification. À l’heure actuelle, les principales méthodes de purification des rAAV comprennent l’utilisation de la centrifugation à gradient de densité à ultra-haute vitesse au chlorure de césium (CsCl) ou à l’iodixanol suivie ou non de techniques de chromatographie²⁶. Le schéma de purification original pour la précipitation virale utilisait du sulfate d’ammonium, suivi de deux ou trois cycles d’ultracentrifugation à travers un gradient de CsCl. Les principaux avantages de ce processus comprennent la possibilité de purifier tous les sérotypes et la possibilité de séparer physiquement les particules pleines des capsides vides en fonction de leurs différentes densités. Cependant, cette méthode est élaborée, prend du temps et a une évolutivité limitée, ce qui entraîne souvent un faible rendement et une faible qualité d’échantillon 27,28,29,30. De plus, la dialyse contre un tampon physiologique est souvent nécessaire avant les études in vivo en raison des effets toxiques que le CsCl peut exercer sur les mammifères.

L’iodixanol a également été utilisé comme milieu alternatif à gradient iso-osmotique pour purifier les vecteurs rAAV, avec des avantages par rapport au CsCl du point de vue de la sécurité et de la puissance du vecteur. Cependant, comme CsCl, la méthode iodixanol présente quelques inconvénients liés à la capacité de charge du lysat de culture cellulaire (et donc à l’évolutivité de la purification rAAV) et elle reste une méthode longue et coûteuse^30,31.

Pour pallier ces contraintes, les chercheurs se sont tournés vers les techniques de chromatographie. À cet égard, plusieurs approches de purification ont été développées qui intègrent des méthodes de chromatographie d’affinité, hydrophobes ou d’échange d’ions. Ces méthodes reposent sur les propriétés biochimiques d’un sérotype particulier, y compris leurs récepteurs naturels, ou sur les caractéristiques de charge de la particule virale³². Par exemple, la découverte que AAV2, AAV3, AAV6 et AAV13 se lient de préférence aux protéoglycanes de sulfate d’héparane (HSPG), a ouvert la possibilité d’utiliser l’héparine étroitement apparentée dans la purification par chromatographie d’affinité. Cependant, les sites de liaison à la HSPG peuvent différer selon les sérotypes, médiant la fixation de l’AAV et l’infection des cellules cibles de différentes manières 2,33,34,35,36. D’autre part, AAV1, AAV5 et AAV6 se lient à l’acide sialique (SA) lié à l’azote, tandis que l’AAV4 utilise le SA ^2,14,34 lié à l’O. Suivant le même raisonnement, un protocole de chromatographie d’affinité en une seule étape pour la purification de rAAV5 a également été développé basé sur l’utilisation de mucine, une protéine de mammifère fortement enrichie en SA³⁷. Comme les techniques à base d’héparine, cette purification dépend également du sérotype spécifique généré. Outre l’héparine et la mucine, d’autres ligands ont été explorés pour la chromatographie d’affinité, tels que l’anticorps monoclonal A20 et les anticorps à domaine unique des camélidés (AVB Sepharose et POROS CaptureSelect)22,23,38,39,40,41. D’autres stratégies innovantes pour améliorer les méthodes de purification existantes impliquent l’introduction de petites modifications dans la capside du rAAV pour présenter des épitopes de liaison spécifiques. Par exemple, les rAAV marqués à l’hexa-histidine ou biotinylés peuvent être purifiés à l’aide de ligands qui ciblent ces épitopes (résines de nickel nitrilotriacétique et d’avidine, respectivement)42,43,44.

Dans le but d’élargir les caractéristiques souhaitées des rAAV, les chercheurs ont travesti les virions en mélangeant leurs capsides. Ceci est accompli en fournissant le gène de la capside à partir de deux sérotypes AAV distincts dans des rapports équimolaires ou différents au cours de la production, donnant naissance à une structure de capside composée d’un mélange de sous-unités de capside de différents sérotypes 34,45,46,47,48,49,50 . Des études antérieures fournissent des preuves physiques que la co-expression des protéines de capside d’AAV2 avec AAV1 (rapport 1:1) et d’AAV2 avec AAV9 (rapport 1:1) entraîne la génération de vecteurs mosaïques rAAV1/2 et rAAV2/9, respectivement^{45, 46, 48}. L’un des principaux avantages de la génération de rAAV en mosaïque est la capacité d’intégrer des traits avantageux de différents sérotypes d’AAV, ce qui entraîne des améliorations synergiques de l’expression des transgènes et du tropisme, tout en conservant d’autres propriétés utiles lors de la production de rAAV. Il est intéressant de noter que certaines variantes de la mosaïque présentent même de nouvelles propriétés différentes de celles des virus parentaux 46,47,49. En tirant parti de la capacité de liaison à l’héparine de l’AAV2, les vecteurs rAAV en mosaïque pourraient potentiellement être générés et purifiés en mélangeant AAV2 avec d’autres capsides AAV naturelles ou nouvelles générées par l’évolution dirigée et/ou la conception rationnelle. Néanmoins, des études antérieures ont souligné l’importance de la compatibilité des sous-unités de la capside lors de l’assemblage de vecteurs mosaïques. Par exemple, Rabinowitz et ses collègues ont démontré que bien que la transcapsidation d’AAV1, d’AAV2 et d’AAV3 conduise à un co-assemblage efficace des capsides en mosaïque, le travestissement de ces sérotypes avec AAV4 entrave la génération de virions stables 34,45,47. De plus, AAV1, AAV2 et AAV3 ont montré une faible compatibilité avec AAV5, compte tenu de la réduction des titres viraux obtenus lors du mélange de ces capsides à des ratios différents. Fait intéressant, la mosaïque rAAV2/5 a montré une diminution des propriétés de liaison à l’héparine, tout en maintenant la capacité de liaison à la mucine comme l’AAV5 parental. Cependant, rAAV3/5 à un rapport de 3:1 a préservé la double liaison à l’héparine et à la mucine. Dans l’ensemble, la génération de nouveaux rAAV en mosaïque avec une transduction améliorée, un tropisme spécifique ou une faible immunogénicité pourrait grandement bénéficier de notre compréhension de l’assemblage de la capside et des interactions récepteurs, les combinaisons spécifiques nécessitant encore une étude et une optimisation approfondies.

Dans ce travail, nous décrivons un protocole étape par étape pour la production et la purification des rAAV à l’aide d’une méthode de chromatographie d’affinité d’héparine optimisée. Les rAAV sont produits par transfection transitoire et sont purifiés à l’aide d’un système de chromatographie liquide rapide en protéines (FPLC). Après la concentration de fractions purifiées sélectionnées, les stocks viraux résultants sont caractérisés en termes de titre, de pureté, de propriétés physiques intrinsèques et d’activité biologique in vitro et in vivo. En tant que preuve de concept, nous démontrons les améliorations et l’applicabilité de ce protocole pour la génération de vecteurs mosaïques rAAV1/2 et rAAV2/9. Le choix de chaque sérotype a été basé sur leurs tropismes étonnamment différents, conférant potentiellement leurs caractéristiques uniques aux versions mosaïques. Le sérotype AAV 1, avec un tropisme global modéré pour le système nerveux central (SNC), a la capacité de transduire les neurones et la glie (dans une moindre mesure) et subit un transport axonal dans les directions antérogrades et rétrogrades in vivo ^2,7,8. De plus, le sérotype 9 de l’AAV a été choisi pour sa capacité naturelle à traverser la barrière hémato-encéphalique et à cibler le SNC chez les souris néonatales et adultes^51,52. Enfin, le sérotype 2 de l’AAV a été sélectionné en raison de sa capacité à se lier à l’héparine, ce qui permet une chromatographie d’affinité³³. Les particules purifiées rAAV1/2 et rAAV2/9 combinent les propriétés des deux sérotypes parentaux AAV et, par conséquent, constituent des vecteurs appropriés pour la transduction du SNC 45,46,48,49.

Protocole

REMARQUE : Voir la figure 1 pour une illustration résumant le protocole. Voir le tableau des matériaux pour plus de détails sur tous les matériaux, instruments et réactifs utilisés dans ce protocole. Tous les travaux impliquant des cellules et des virus doivent être effectués dans des enceintes et des incubateurs de biosécurité dédiés, séparés de ceux régulièrement utilisés pour la maintenance des lignées cellulaires. L’équipement et les réactifs entrant en contact avec les cellules cultivées et les virus doivent être stériles. Il est essentiel que l’élimination des réactifs dangereux et des matières contaminées par des virus soit effectuée conformément aux fiches de données de sécurité et aux lois et directives nationales fournies par le bureau de l’environnement, de la santé et de la sécurité de chaque établissement. En avril 2019, les lignes directrices des NIH pour la recherche impliquant des molécules d’acide nucléique recombinantes ou synthétiques classent comme agents du groupe de risque 1 (non associés à la maladie chez les humains adultes en bonne santé) tous les sérotypes d’AAV, ainsi que les constructions d’AAV recombinantes ou synthétiques. Cette classification s’applique lorsque le transgène ne code pas pour un produit génique potentiellement tumorigène ou une toxine, et que les constructions sont produites sans virus auxiliaire.

Toutes les expériences sur des animaux ont été réalisées dans le respect de la directive de la Communauté européenne (2010/63/UE) sur le soin et l’utilisation des animaux de laboratoire, transposée dans la loi portugaise en 2013 (décret-loi 113/2013). De plus, les procédures animales ont été approuvées par l’Organisation responsable pour le bien-être animal de la Faculté de médecine et le Centre de neurosciences et de biologie cellulaire de l’animalerie agréée de l’Université de Coimbra. Les chercheurs ont reçu une formation adéquate (cours certifié par la FELASA) et une certification des autorités portugaises (Direcção Geral de Alimentação e Veterinária, Lisbonne, Portugal) pour réaliser les expériences.

1. Constructions plasmidiques

1. Suivez les instructions du fabricant d’une trousse sans endotoxines maxiprep pour isoler et purifier des quantités substantielles d’ADN des plasmides suivants : i) pITR : le vecteur de transfert d’intérêt ; ii) plasmide pAAV-RC : pRV1, contenant les séquences AAV2 Rep et Cap ³⁶ ; iii) plasmide pAAV-RC : pH21, contenant les séquences AAV1 Rep et Cap ³⁶ ; iv) plasmide pAAV-RC : pAAV2/9n, contenant les séquences AAV2 Rep et AAV9 Cap ; v) pHelper : pFdelta6, plasmide³⁶ auxiliaire de l’adénovirus.
2. Examinez l’intégrité des plasmides générés en appliquant les restrictions enzymatiques recommandées³⁶. Surveiller l’intégrité des plasmides pITR par digestion avec SmaI, une endonucléase de restriction, qui coupe deux fois dans une portion instable des RTI ^53,54.
   REMARQUE : Étant donné que les ITR sont très instables et sensibles aux délétions, l’utilisation de cellules supercompétentes SURE 2 est recommandée pour minimiser la recombinaison dans ces sites.

2. Culture cellulaire

1. Cultiver un rein embryonnaire humain 293, exprimant de manière stable la lignée cellulaire du grand antigène T (HEK293T) SV40 dans le milieu modifié Eagle Medium (DMEM) de Dulbecco, avec un taux de glucose élevé de 10 % de fœtus de bovin et 1 % de pénicilline-streptomycine, à 37 °C, sous une atmosphère humidifiée contenant 5 % de CO₂, comme point de départ pour les étapes suivantes.
2. Sous-cultivez les cellules à l’aide d’une solution saline tamponnée au phosphate (PBS) stérile, pH 7,4, pour laver les cellules avant d’ajouter 0,05 % d’acide trypsine-éthylènediaminetétraacétique (EDTA).
   REMARQUE : Évitez d’utiliser des cellules qui ont subi un nombre excessif de passages (maximum 20). Testez régulièrement les cultures cellulaires pour détecter la contamination par les mycoplasmes.

3. Production de rAAV par transfection transitoire

1. Jour 1 : Placage cellulaire
   1. Pour chaque production virale, déposer HEK293T les cellules dans 10 boîtes de culture traitées (15 cm de diamètre) la veille de la transfection, à une densité de 10,5 × 10⁶ cellules par boîte dans 22 mL de milieu de culture supplémenté et incuber pendant 24 h jusqu’à ce que les cellules soient confluentes à 70 % à 80 % et prêtes pour la transfection.
2. Jour 2 : Transfection cellulaire à l’aide de polyéthylénimine (PEI)
   1. Pour chaque production virale (équivalant à 10,5 boîtes), mettre en place le mélange de transfection suivant dans un tube de microcentrifugation : 54,6 μg de pITR ; 45,675 μg de pRV1 ; 45,675 μg de pH21 ou pAAV2/9n ; 109,2 μg de pFdelta6. Mélanger en tapotant
   2. Ajouter le mélange à 4,557 mL de DMEM non supplémenté dans un tube à centrifuger de 50 mL. Mélanger en tapotant
   3. Ajouter 1,365 mL de solution stérile d’IPE à 1 mg/mL (pH 7,4), goutte à goutte. Mélanger en tapotant Incuber pendant 10 min à température ambiante pour permettre la formation de complexes ADN-PEI.
   4. Ajouter ce mélange à 231 ml de DMEM supplémenté préchauffé. Remplacer tout le milieu de culture de chaque plat par 22 mL de ce mélange de transfection. Incuber les cellules pendant 48 h.
      REMARQUE : Cette étape doit être effectuée avec soin pour éviter le détachement des cellules.
3. Jour 4 : Récolte de cellules
   1. Lorsque le pITR code un rapporteur fluorescent, visualisez les cellules transfectées au microscope à fluorescence.
   2. Recueillir le milieu de chaque plat dans des tubes à centrifuger de 50 mL et les centrifuger à 800 × g pendant 10 min. Jetez le surnageant.
      REMARQUE : Cette étape est facultative et vise à récupérer les cellules transfectées qui peuvent s’être détachées en raison d’une très forte confluence.
   3. Ajouter 10 ml de PBS préchauffé dans chaque assiette. Retirez délicatement les cellules à l’aide d’un grattoir à cellules et recueillez la suspension dans les tubes à centrifuger de 50 ml à partir de l’étape 3.3.2.
   4. Lavez 5 plats à la fois avec 10 ml de PBS supplémentaires et transférez la suspension dans les tubes à centrifuger de 50 ml à partir de l’étape 3.3.3. Granulez les cellules à 800 × g pendant 10 min et jetez le surnageant.
   5. Congelez les granulés de cellule à -80 °C.
      REMARQUE : Les granulés de cellules peuvent être conservés pendant plusieurs mois (point de pause).

4. Extraction rAAV et purification FPLC

1. Jour 5 : Préparation du lysat cellulaire
   1. Décongelez les granulés de cellules à température ambiante. Remettre en suspension les cellules prélevées dans les 10 boîtes dans 100 mL d’un tampon stérile contenant 150 mM de chlorure de sodium (NaCl) et 20 mM de Tris, pH 8,0, dans de l’eau ultrapure (type I). Mélanger la suspension par pipetage de haut en bas, pour assurer une suspension homogène.
   2. Ajouter 12,5 mL d’une solution stérile fraîchement préparée de désoxycholate de sodium à 10 % dans de l’eau ultrapure pour induire la lyse cellulaire. Mélanger par pipetage de haut en bas.
      REMARQUE : Éliminer le désoxycholate de sodium, ainsi que les matières qui y sont en contact, conformément à la fiche signalétique et aux lignes directrices fournies par le bureau de l’hygiène et de la sécurité environnementales de l’établissement. Il est également recommandé de porter un masque facial lors de la manipulation de cette poudre. Après mélange, la solution devient très visqueuse.
   3. Ajouter 27 μL de nucléase de benzonase au mélange précédent. Mélangez soigneusement en pipetant de haut en bas jusqu’à ce que l’échantillon ne soit plus visqueux. Incuber à 37 °C pendant 1 h, en effectuant un vortex toutes les 10 min.
      REMARQUE : Cette endonucléase est capable de dégrader efficacement toutes les formes d’ADN et d’ARN sans présenter d’activité protéolytique.
   4. Éliminer les débris cellulaires en centrifugeant le mélange à 3 000 × g pendant 60 min à 25 °C. Filtrez le surnageant à l’aide d’un filtre à seringue stérile en polyfluorure de vinylidène (PVDF) de 0,45 μm et transférez-le dans un nouveau récipient stérile.
      REMARQUE : Cette étape importante garantit que la plupart des débris cellulaires sont éliminés, empêchant ainsi le colmatage des colonnes de chromatographie. Conservez une petite partie aliquote de ce mélange pour l’analyse (étape facultative).
2. Jour 5 (suite) : Purification de la colonne d’héparine des rAAV
   REMARQUE : L’application de l’échantillon peut être effectuée à l’aide d’une pompe d’échantillonnage ou d’un superloop de 50 ml ou 150 ml dans le cadre du système. Étant donné qu’une plus grande quantité d’air est dissoute à des températures plus basses, il est important de laisser suffisamment de temps aux tampons et aux solutions (généralement stockés à 4 °C) pour s’acclimater à la température ambiante avant de les utiliser dans le système FPLC.
   1. Facultatif : Si le système a été stocké pendant de longues périodes, remplissez le système et toutes les entrées avec une solution de stockage fraîchement préparée (éthanol à 20 %) en suivant des instructions manuelles ou une méthode de nettoyage en place prédéfinie du système (NEP du système).
   2. Lavez complètement le chemin d’écoulement du liquide avec de l’eau ultrapure stérile à l’aide d’instructions manuelles ou d’une méthode CIP prédéfinie du système.
   3. Connectez une colonne d’héparine préemballée de 1 ml, réglez l’alarme de pression et lavez avec cinq volumes de colonne (CV) d’eau ultrapure à un débit de 1 mL/min.
   4. Basculez les solutions dans le bac tampon de l’eau ultrapure au tampon A (solution stérile de 100 mM de NaCl et 20 mM de Tris, pH 8, dans de l’eau ultrapure) pour l’entrée A (pompe du système A) et du tampon B (solution stérile de 500 mM de NaCl et 20 mM de Tris, pH 8, dans de l’eau ultrapure) pour l’entrée B (pompe du système B). Si le système est équipé d’une pompe d’échantillonnage, placez l’entrée du tampon de la vanne d’entrée d’échantillon dans le tampon A.
   5. Lavez la pompe du système B avec le tampon B et remplissez le reste du chemin d’écoulement du liquide avec le tampon A.
      REMARQUE : Si nécessaire, déconnectez la colonne du chemin d’écoulement et reconnectez-la par la suite.
   6. Insérez un tube d’entrée d’échantillon à partir de la vanne d’entrée d’échantillon, par exemple S1, dans le récipient contenant la préparation virale obtenue à l’étape 4.1.4. (à partir de la préparation de lysat cellulaire). Amorcez le chemin d’écoulement de l’entrée de l’échantillon S1 à la vanne d’injection avec la solution de l’échantillon. Vous pouvez également remplir une superloop de 50 mL ou 150 mL avec l’échantillon contenant des rAAV à l’aide d’une seringue de 50 mL.
   7. Équilibrer la colonne avec un volume total de cinq CV en utilisant 12,5 % de tampon B à un débit de 1 mL/min.
   8. Appliquez le volume total de l’échantillon dans la colonne à l’aide de la pompe d’échantillonnage (sélectionnez injecter tout l’échantillon à l’aide du capteur d’air) ou du superloop à 0,5 mL/min et recueillez l’écoulement à l’aide de l’orifice de sortie dans un nouveau récipient stérile.
      REMARQUE : Lorsque la fonction de contrôle de débit pour éviter la surpression est activée, le débit diminuera automatiquement en cas de colmatage de la colonne. Si le débit descend considérablement en dessous de 0,5 mL/min, arrêtez l’application de l’échantillon, effectuez un lavage avec 2 à 5 CV de tampon A, puis reprenez l’application de l’échantillon.
   9. Laver la colonne à 1 mL/min avec 20 CV de tampon A, en recueillant le flux à l’aide de l’orifice de sortie.
   10. Éluer l’échantillon à 1 mL/min avec le schéma suivant : i) gradient linéaire avec une cible de 50 % du tampon B pour cinq CV ; ii) étape avec un objectif de 90 % de la zone tampon B pendant cinq CV ; iii) étape avec un objectif de 100 % de la zone tampon B pendant cinq CV.
   11. Prélever l’échantillon élué en fractions de 1 mL à l’aide d’un collecteur de fractions et de tubes de microcentrifugation à faible rétention (2 mL) et les stocker à -20 °C.
       REMARQUE : Les fractions rAAV peuvent être conservées pendant plusieurs semaines (point de pause).
   12. Rééquilibrer la colonne à 1 mL/min avec 12,5 % de tampon B pour cinq CV.
   13. Remplacez les entrées des solutions tampons par de l’eau ultrapure et lavez la colonne à 1 mL/min pendant cinq CV.
   14. Passez de l’eau ultra-pure à l’éthanol à 20 % et lavez la colonne à 1 mL/min pendant cinq CV. Débranchez la colonne et stockez-la à 4 °C.
       REMARQUE : Les colonnes peuvent être réutilisées plusieurs fois sans aucune autre procédure de nettoyage et d’assainissement majeure si le même sérotype et le même transgène rAAV sont utilisés.
   15. Lavez complètement le chemin d’écoulement du liquide avec de l’éthanol à 20 % en suivant les instructions manuelles ou une méthode CIP prédéfinie du système.

5. Concentration des rAAV purifiés

1. Jour 6 : Étape de concentration 1
   1. Concentrez les rAAV à l’aide d’une unité de filtration centrifuge de 15 mL avec une coupure de poids moléculaire de 100 kDa. Chargez les fractions souhaitées contenant des rAAV (fractions FPLC 7 à 16) dans l’unité de filtration centrifuge de 15 mL et centrifugez-la à 2 000 × g pendant 2 min à température ambiante. Assurez-vous que le volume concentré dans l’unité de filtration est d’environ 500 μL. Si le volume concentré dépasse largement 500 μL, répétez les étapes de centrifugation à intervalles de 1 minute jusqu’à ce qu’il atteigne le volume souhaité.
2. Jour 6 (suite) : Échange de tampons
   1. Ajouter 1 mL de PBS stérile dans l’unité de filtration centrifuge contenant les rAAV. Pipetez soigneusement de haut en bas pour laver le filtre. Centrifuger à 2 000 × g par intervalles de 1 min jusqu’à ce que le volume final de 500 μL soit atteint.
3. Jour 6 (suite) : Étape de concentration 2
   1. Transvaser les 500 μL de rAAV concentrés obtenus à l’étape précédente dans une unité de filtration centrifuge de 0,5 mL avec une coupure de poids moléculaire de 100 kDa et centrifuger à 6 000 × g pendant 1 min. Si nécessaire, répétez l’étape de centrifugation jusqu’à ce qu’un volume final inférieur à 100 μL soit atteint.
4. Jour 6 (suite) : Récupération
   1. Pour récupérer le rAAV concentré, placez le dispositif de filtration à l’envers dans un nouveau tube de prélèvement de microcentrifugeuse. Placez le tube dans une microcentrifugeuse avec le capuchon vers le centre et effectuez une rotation prolongée à l’intérieur de la chambre d’écoulement pour transférer les rAAV concentrés de l’appareil vers le tube de la microcentrifugeuse. Vous pouvez également centrifuger à 1 000 × g pendant 2 min.
   2. Supplément avec du Pluronic F-68 stérile 0,001% (facultatif).
      REMARQUE : Pluronic F-68 est un tensioactif non ionique approuvé pour un usage humain par la Food and Drug Administration qui est capable d’atténuer les pertes de rAAV en empêchant leurs interactions avec les surfaces des matériaux (plastiques) utilisés lors de la préparation de la dilution, du chargement de la seringue et de l’équipement d’administration^55,56.
   3. Aliquote des rAAV dans des tubes de microcentrifugation à faible rétention et stockez-les à -80 °C (point de pause).

6. Quantification des rAAV purifiés

1. Jour 6 (suite) : Déterminer le titre des préparations de rAAV, exprimé en génomes viraux/μL (vg/μL), par réaction en chaîne par polymérase quantitative en temps réel (RT-qPCR) à l’aide d’un kit commercial et en suivant les instructions du fabricant.
   1. Incuber la solution de particules rAAV avec la DNase I à 37 °C pendant 20 min.
      REMARQUE : Cette procédure favorise la digestion de l’ADN génomique libre et de l’ADN plasmidique dérivé des cellules hôtes, garantissant ainsi que seule la séquence d’acide nucléique à l’intérieur des particules intactes de rAAV est préservée.
   2. Inactiver thermiquement la DNase I à 95 °C pendant 10 min.
   3. Ajouter le tampon de lyse et incuber pendant 10 min à 70 °C pour favoriser la dénaturation thermique des protéines des particules rAAV.
   4. Diluer la solution du génome rAAV obtenue dans un tampon de dilution avant de passer à la RT-qPCR. Préparer un ensemble d’étalons dilués en série du témoin positif (de 2 × 10⁷ vg/μL à 2 ×^{10 2} vg/μL) fournis avec le kit.
   5. Effectuer un mélange réactionnel contenant 12,5 μL de mélange Taq II, 0,5 μL de mélange d’amorces diluées, 7 μL d’eau et 5 μL d’ADN rAAV dilué (échantillon et étalons AAV inconnus de l’étape 6.1.4.).
   6. Effectuez la RT-qPCR dans un système de détection PCR en temps réel, en utilisant le protocole suivant : 1 cycle à 95 °C pendant 2 min (dénaturation initiale) et 40 cycles à 95 °C pendant 5 s (dénaturation) et 60 °C pendant 30 s (recuit, extension et lecture de plaque), suivi d’une analyse de la courbe de fusion.
   7. Calculer la concentration absolue de l’échantillon à partir de la courbe standard (droite de régression linéaire), en tenant compte du facteur de dilution résultant de la préparation de l’échantillon rAAV.
      REMARQUE : La quantification du nombre de génomes viraux est réalisée par l’amplification de la séquence ITR d’AAV2 (séquence cible des amorces fournies par le kit).

7. SDS-PAGE, coloration au bleu Coomassie et western blot

1. Dénaturer 40 μL de chaque échantillon (chaque fraction de FPLC ; le flux continu ; les échantillons de précolonne et un total de 2,3 × 10¹⁰ vg du produit concentré final) en ajoutant 6 tampons d’échantillon (0,5 M de Tris-HCl/0,4 % de dodécylsulfate de sodium (SDS) pH 6,8, 30 % de glycérol, 10 % de SDS, 0,6 M de dithiothréitol (DTT), 0,012 % de bleu de bromophénol) et en incubant les échantillons pendant 5 min à 95 °C.
2. Charger les échantillons dénaturés (48 μL) dans un gel de polyacrylamide SDS (gel d’empilement à 4 % et gel de résolution à 10 %) et effectuer la séparation électrophorétique à 100 V pendant 70 min, à côté d’une échelle protéique.
3. Analyse des protéines
   REMARQUE : Une coloration au bleu de Coomassie ou un western blot peut être effectué.
   1. Coloration au bleu de Coomassie
      1. Pour visualiser les bandes de protéines, colorez le gel pendant 10 minutes avec une solution de bleu de Coomassie G250 à 0,25 % dissoute dans du méthanol à 50 % et de l’acide acétique glacial à 10 %.
      2. Effectuez la décoloration du gel en le lavant plusieurs fois avec une solution contenant 25% de méthanol et 5% d’acide acétique glacial jusqu’à ce que des bandes claires avec un faible bruit de fond deviennent visibles.
      3. Capturez des images à l’aide d’un système d’imagerie approprié.
   2. Transfert Western
      1. Transférez les protéines sur une membrane PVDF selon les protocoles standard.
      2. Bloquer la membrane par incubation dans du lait écrémé à 5 % dilué dans du TBS-T (0,1 % de Tween 20 dans une solution saline tamponnée au Tris) pendant 1 h à température ambiante.
      3. Utiliser les anticorps primaires suivants (dilués dans une solution bloquante) pour l’incubation nocturne à 4 °C : anticorps monoclonaux anti-AAV de souris, anticorps anti-AAV monoclonaux de souris, anticorps anti-AAV VP1, VP2 (B1, 1:1 000) ou anticorps monoclonaux anti-AAV de souris, VP1, anticorps anti-VP2 (A69, 1:1 000).
      4. Laver les membranes pendant 3 x 15 min dans du TBS-T et incuber avec un anticorps secondaire de chèvre anti-souris lié à la phosphatase alcaline (1:10 000), pendant 2 h à température ambiante.
      5. Laver les membranes pendant 3 x 15 min dans du TBS-T. Ajoutez un substrat de chimifluorescence amélioré (ECF) et visualisez les bandes de protéines par imagerie par chimifluorescence.

8. Microscopie électronique à transmission (MET)

1. Placez une grille de 200 mailles recouverte de carbone Formvar à l’envers sur une goutte d’échantillon rAAV et laissez-la reposer pendant 1 min.
2. Lavez les grilles dans une goutte d’eau et séchez l’excès de liquide avec du papier filtre.
3. Colorez négativement les grilles avec une solution d’acétate d’uranyle à 1 % (pH 7) pendant 1 min pour fixer et contraster les particules virales.
4. Lavez les grilles dans une goutte d’eau et séchez l’excès de liquide avec du papier filtre.
5. Examinez les échantillons au microscope électronique à transmission.
   REMARQUE : Des concentrations élevées de sel peuvent avoir un impact direct sur la liaison des rAAV à la grille et conduire à la visualisation de structures cristallines.

9. Analyse consécutive de l’absorption de la lumière ultraviolette-visible, de la diffusion statique de la lumière et de la diffusion dynamique de la lumière

1. Sur une plaque de quantification à 96 puits, chargez 2 μL d’un échantillon rAAV et 2 μL de PBS à utiliser comme blanc tampon (effectuez cette opération en doubles).
2. Utilisez l’application AAV Quant dans le logiciel d’analyse du client, placez les noms des échantillons au bon endroit de la plaque, sélectionnez le sérotype AAV et cliquez sur Suivant.
3. Chargez la plaque de quantification à 96 puits dans l’équipement dédié et procédez à la lecture de la plaque pour l’acquisition des données.

10. Essais de transduction in vitro

1. Différentes lignées cellulaires peuvent être utilisées pour analyser rapidement l’efficacité de transduction des rAAV.
   1. Ensemencer uniformément HEK293T cellules dans des plaques à 24 puits (à une densité de 137 500 cellules/puits) et une lignée cellulaire de neuroblastome-2A de souris (Neuro2a) dans des plaques à 24 puits (50 000 cellules/puits) ou dans une lame à 8 puits (27 000 cellules/puits), en utilisant du DMEM à haute teneur en glucose, complété par 10 % de sérum de veau fœtal et 1 % de pénicilline-streptomycine, comme décrit ci-dessus. Laisser les cellules adhérer toute la nuit à 37 °C dans une atmosphère humidifiée contenant 5 % de CO₂.
   2. Prélever le milieu conditionné de chaque puits (250 μL des plaques à 24 puits et 50 μL de la lame de chambre à 8 puits) et le stocker à 4 °C pour une utilisation ultérieure.
   3. Ajouter les préparations rAAV suivantes dans chaque puits et incuber les cellules pendant 24 h à 37 °C dans une atmosphère à 5 % de CO₂ .
      1. Ajouter 50 μL des fractions F2-F16 recueillies par le FPLC et les faire circuler dans HEK293T cellules plaquées dans des plaques à 24 puits.
      2. Ajouter un total de 5,5 × 10⁹ vg des rAAV concentrés dilués dans 50 μL de PBS aux cellules Neuro2a plaquées dans des plaques à 24 puits (inclure un puits de contrôle négatif, en ajoutant 50 μL de PBS aux cellules).
      3. Ajouter un total de 2,75 × 10⁹ vg des rAAV concentrés dilués dans 25 μL de PBS aux cellules Neuro2a plaquées dans une lame de chambre à 8 puits (inclure la condition de contrôle négatif, en ajoutant 50 μL de PBS aux cellules).
   4. Ajouter le milieu conditionné préalablement stocké (étape 10.1.2) dans chaque puits et incuber pendant 24 h.
   5. Jetez le milieu et lavez les cellules 2 fois avec du PBS.
   6. Ajouter une solution de paraformaldéhyde (PFA) à 4 %, complétée par du saccharose à 4 % dans du PBS, préchauffé à 37 °C, dans chaque puits et incuber à température ambiante pendant 20 min.
   7. Laver 2 fois avec du PBS et conserver à 4 °C jusqu’à ce que l’imagerie soit effectuée (point de pause).
   8. Acquérez des images sur un microscope à fluorescence inversée équipé d’un objectif 10x/0,30, ou un microscope confocal inversé équipé d’un objectif 40x/1,4 Oil DIC.
2. Pour avoir un modèle plus pertinent et plus représentatif de l’environnement in vivo , utilisez les cultures neuronales primaires comme suit :
   1. Préparer des cultures primaires de neurones corticaux comme décrit précédemment par Santos et al.⁵⁷. En bref, ensemencer 200 000 cellules/mL dans des plaques à 12 puits et les maintenir en culture jusqu’au jour in vitro 16.
   2. Prélever le milieu conditionné de chaque puits (100 μL) et le stocker à 4 °C pour une utilisation ultérieure.
   3. Ajouter les rAAV à tester dans chaque puits : un total de 2,75 × 10⁹ vg de rAAV concentrés dilués dans 25 μL de PBS (inclure le témoin négatif : 25 μL de PBS). Incuber pendant 24 h à 37 °C dans une atmosphère à 5% de CO₂ .
   4. Ajouter le milieu conditionné préalablement stocké et incuber pendant 24 h.
   5. Jetez le milieu dans chaque puits et lavez-le 2 fois avec du PBS.
   6. Fixer les cellules avec 4 % de PFA/4 % de saccharose dans du PBS, comme décrit à l’étape 10.1.6. Laver 2 fois avec du PBS.
   7. Incuber chaque puits avec 5 μg/mL d’agglutinine de germe de blé (WGA) conjuguée à Alexa Fluor 633 pendant 10 min à température ambiante (étape facultative : effectuer plutôt une immunocytochimie). Laver 2 fois avec du PBS.
   8. Incuber dans 0,25% de Triton X-100 dans du PBS pendant 5 min à température ambiante. Laver avec du PBS.
   9. Incuber avec du 4',6-diamidino-2-phénylindole (DAPI) pendant 5 min à température ambiante. Laver 2 fois avec du PBS.
   10. Acquérez des images à l’aide d’un microscope à fluorescence inversée équipé d’un objectif 40x/0,95 ou d’un microscope confocal inversé équipé d’un objectif 40x/1,4 Oil DIC.

11. Expériences in vivo

REMARQUE : Les animaux ont été logés dans une pièce à température contrôlée, maintenue selon un cycle lumière/obscurité de 12 heures. De la nourriture et de l’eau ont été fournies ad libitum. Tous les efforts ont été faits pour minimiser la souffrance animale.

1. Injection stéréotaxique dans le cervelet
   1. Anesthésier des animaux C57BL/6 âgés de 9 semaines par inhalation d’isoflurane à 2 % en présence d’oxygène (0,8 L/min) dans une chambre reliée à un vaporisateur.
   2. Placez l’animal anesthésié dans l’appareil stéréotaxique (sur un tampon chauffé à 35 °C) et placez le masque à l’isoflurane dans le nez de l’animal. Baissez le niveau d’isoflurane à 1,3-1,7 %.
      REMARQUE : S’assurer que l’animal est correctement anesthésié avant de procéder (perte du réflexe de flexion dans les deux membres postérieurs).
   3. Appliquez une pommade oculaire lubrifiante pour éviter le dessèchement des cornées et injectez à l’animal un analgésique approuvé.
      REMARQUE : Toutes les étapes suivantes doivent être effectuées dans des conditions stériles.
   4. Après avoir rasé la fourrure de la tête de l’animal et désinfecté la zone chirurgicale, exposez le crâne et placez l’extrémité d’une aiguille d’injection à bout émoussé de 30 G, reliée à une seringue Hamilton de 10 μL, directement sur bregma (utilisez bregma comme zéro pour le calcul des coordonnées stéréotaxiques).
   5. Déplacez l’aiguille à la coordonnée prévue et percez un trou dans le crâne où l’aiguille entrera.
      REMARQUE : Dans le cadre de cette étude, une seule injection a été réalisée au centre du cervelet.
   6. Injecter 4 μL d’une solution de rAAV contenant un total de 8 × 10⁹ vg, diluée dans du PBS, à un débit de perfusion de 0,5 μL/min à l’aide d’un injecteur automatique. Utilisez les coordonnées suivantes, calculées à partir de bregma, pour effectuer une injection unique au centre du cervelet d’une souris C57BL/6 adulte : antéro-postérieure : -6,5 mm ; latéral : 0 mm ; ventrale : -2,9 mm.
      REMARQUE : Ces coordonnées peuvent varier en fonction de la souche de souris, du sexe et de l’âge des animaux utilisés.
   7. Pour minimiser le reflux et permettre la diffusion du vecteur viral, une fois la perfusion terminée, laissez l’aiguille de la seringue à ces coordonnées pendant 3 min, puis rétractez-la lentement de 0,3 mm et laissez-la rester en place pendant 2 minutes supplémentaires avant de le retirer complètement du cerveau de la souris.
   8. Fermez l’incision et nettoyez-la avec un agent désinfectant (par ex. 10 % de povidone iodée).
   9. Laissez les animaux se remettre de l’anesthésie avant de les ramener dans leurs cages d’origine.
2. Prélèvement et préparation de tissus
   REMARQUE : Dans cette expérience, les niveaux de transduction ont été observés 12 semaines après l’injection, mais la même procédure a pu être évaluée dès 4 semaines après l’injection.
   1. Anesthésier les animaux en phase terminale par l’administration intrapéritonéale d’une surdose de xylazine/kétamine (8/160 mg/kg de poids corporel).
   2. Perfuser les animaux par voie transcardique avec du PBS glacé pendant 6 minutes à un débit de 2,5 mL/min, suivi de la perfusion avec une solution glacée de PFA à 4 % fraîchement préparée pendant 10 minutes au même rythme.
   3. Postfixez les cerveaux excisés dans 4% de PFA pendant la nuit à température ambiante, puis transférez-les dans une solution de saccharose/PBS à 25% pour la cryoprotection. Une fois que la cervelle coule (environ 48 h plus tard), stockez-la à -80 °C.
   4. Découpez en série des coupes sagittales d’une épaisseur de 30 μm à l’aide d’un cryostat à -21 °C. Pour chaque animal, prélever 96 sections sagittales d’un hémisphère cérébral dans des séries anatomiques sous forme de sections flottantes dans du PBS complété par 0,05% d’azoture de sodium. Conserver à 4 °C jusqu’à nouvel ordre.
3. Immunohistochimie par fluorescence standard
   1. Sélectionnez huit sections sagittales par animal, à une distance de 240 μm les unes des autres.
   2. Incuber les sections flottantes dans une solution de blocage/perméabilisation (0,1 % de Triton X-100 contenant 10 % de sérum de chèvre normal (NGS) dans du PBS) pendant 1 h à température ambiante.
   3. Incuber les sections pendant la nuit à 4 °C avec l’anticorps primaire polyclonal anti-GFP de poulet (1:1 000).
   4. Laver 3 x 15 min dans du PBS et incuber les sections pendant 2 h à température ambiante avec l’anticorps secondaire de chèvre polyclonal anti-poulet conjugué au fluorophore Alexa Fluor 488 (1:200).
   5. Laver pendant 3 x 15 min dans PBS. Incuber avec du DAPI pendant 5 min à température ambiante.
   6. Laver pendant 3 x 15 min dans PBS. Placez les sections dans des lames recouvertes de gélatine et une lamelle avec un milieu de montage par fluorescence.
   7. Acquérez des images sur un microscope à fluorescence à balayage de lames équipé d’un objectif 20x/0,8.

Discussion

La boîte à outils de vecteurs AAV, en expansion rapide, est devenue l’un des systèmes d’administration de gènes les plus prometteurs pour un large éventail de types de cellules par différentes voies d’administration. Dans ce travail, nous avons cherché à développer un protocole amélioré pour la production, la purification et la caractérisation des vecteurs rAAV en mosaïque qui pourrait faire leurs preuves dans les études précliniques. À cette fin, la génération de vecteurs mosaïques rAAV1/2 et rAAV2/9 est décrite ici, mais la procédure peut également être appliquée pour purifier les vecteurs rAAV2 standard (données non présentées).

Des rAAV en mosaïque ont été produits selon une méthode de transfection optimisée en utilisant l’IEP comme réactif de transfection. Une méthode de transfection transitoire a été choisie en raison de sa flexibilité et de sa rapidité accrues, des avantages considérables dans les études précliniques précoces. Une fois qu’un transgène et un sérotype particuliers ont été validés, le système de production peut être affiné pour obtenir une meilleure évolutivité et une meilleure rentabilité en établissant une lignée cellulaire transfectée stable qui exprime un sous-ensemble des gènes spécifiques Rep/Cap , avec des gènes supplémentaires fournis par un processus d’infection²⁴. Par rapport à la transfection calcium-phosphate, l’IPE présente plusieurs avantages. Il s’agit d’un réactif de transfection stable et rentable qui fonctionne efficacement dans une plage de pH plus large. De plus, il n’est pas nécessaire de changer le support cellulaire après la transfection, ce qui entraîne une réduction significative des coûts et de la charge de travail⁶⁹.

Dans le but de contourner certaines des limitations imposées par les gradients de CsCl ou d’iodixanol, les rAAV produits ont été récoltés et purifiés par chromatographie d’affinité. Cette stratégie offre une approche simplifiée et évolutive qui peut être réalisée sans avoir besoin d’ultracentrifugation et de gradients, ce qui permet d’obtenir des titres viraux propres et élevés. En effet, les techniques de chromatographie utilisant un système FPLC peuvent être automatisées et mises à l’échelle en emballant plus de volume de résine dans une colonne avec une hauteur de lit plus élevée. Le protocole décrit dans le présent document peut être facilement adapté pour incorporer des colonnes d’héparine HiTrap HP de 5 mL (données non présentées). De plus, les colonnes d’héparine peuvent être réutilisées plusieurs fois, ce qui contribue à la rentabilité de cette méthode.

Les rAAV purifiés ont ensuite été caractérisés en termes de titre, de pureté, de caractéristiques morphologiques et d’activité biologique. Il est intéressant de noter que dans la coloration au bleu de Coomassie, une bande d’environ 17 kDa a été détectée dans les fractions F8-F16 en plus des trois protéines typiques de la capside virale. Cependant, cette bande n’est plus présente après l’étape de concentration des rAAV. De plus, certaines bandes faibles avec des poids moléculaires inférieurs à VP3 (<62 kDa) peuvent également être détectées lors du marquage B1 et A69, suggérant qu’il pourrait s’agir de fragments des protéines de capside VP1, VP2 et VP3⁷⁰. Une autre possibilité est qu’il s’agit en fait d’autres protéines co-purifiantes telles que la ferritine ou d’autres protéines cellulaires avec des polypeptides qui partagent des empreintes protéiques similaires à celles des protéines de capside de l’AAV et pourraient être impliquées dans la biologie de l’AAV, comme suggéré précédemment 26,71,72.

L’analyse TEM et l’analyse des étourdissements ont également révélé la présence de particules vides à des niveaux variables entre différentes productions. De même, d’autres études antérieures ont rapporté la génération de niveaux variables et élevés (>65%) de capsides vides pour les rAAV préparés par des méthodes de transfection ou d’infection^24,73. Le mécanisme à l’origine de la génération du rAAV commence par la formation rapide de capsides vides à partir de protéines VP nouvellement synthétisées, suivie d’une étape lente de limitation du taux d’empaquetage du génome dans les capsides préformées médiées par les protéines Rep^74,75. Par conséquent, des capsides vides sont générées dans les productions de rAAV, bien que la proportion de capsides vides et pleines puisse varier en fonction de la taille et de la séquence du transgène d’intérêt et des conditions de culture cellulaire^58,73. Les capsides vides soulèvent quelques inquiétudes car, en l’absence du génome d’intérêt, elles sont incapables de fournir un effet thérapeutique et peuvent également potentiellement augmenter une réponse immunitaire innée ou adaptative. Cependant, certains rapports ont également montré qu’en ajustant leur rapport, les capsides vides d’AAV peuvent servir de leurres très efficaces pour les anticorps neutralisants spécifiques aux AAV et, par conséquent, augmenter l’efficacité de la transduction 60,76,77. Si la présence de capsides vides est gravement préjudiciable et compte tenu du caractère légèrement moins anionique des particules vides par rapport aux vecteurs pleins, une solution potentielle pourrait impliquer la réalisation d’une deuxième étape de purification par polissage à l’aide de techniques de chromatographie par échange d’anions⁶⁴.

Cette étude fournit également des preuves convaincantes que les rAAV en mosaïque générés sont capables de transduire efficacement non seulement les cultures neuronales in vitro , mais aussi le SNC lors de l’injection intracrânienne de rAAV1/2. Dans l’ensemble, ces résultats suggèrent que le protocole de production et de purification décrit permet d’obtenir des rAAV hautement purs et biologiquement actifs prêts à l’emploi en 6 jours, se présentant comme une méthode polyvalente et rentable pour la génération de rAAV dans les études précliniques.

matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
10% povidone-iodine	Medline	MDS093943
12-well plates	Thermo Scientific	11889684
24-well plates	VWR	734-2325
4’,6-diamidino-2-phenylindole (DAPI)	Invitrogen	D1306
96-well Stunner plate	Unchained Labs	701-2025	96-well quantification plate for the consecutive ultraviolet-visible light absorption, static light scattering, and dynamic light scattering analysis of rAAV samples
AAVpro Titration Kit (for Real-Time PCR) Ver.2	Takara	6233	For determining the titer of AAV using RT-qPCR. This kit contains DNase I, Lysis Buffer, Dilution Buffer, positive control, Taq II mix, primer forward, primer reverse, water
Acetic acid glacial	Fisher Chemical	A/0360/PB17
ÄKTA pure 25	Cytiva	29018224	FPLC system controlled by UNICORN software, version 6.3
Alkaline phosphatase-linked goat anti-mouse	Invitrogen	31328
Amicon ultra-0.5 centrifugal filter unit	Merck Millipore	UFC5100
Amicon ultra-15 centrifugal filter unit	Merck Millipore	UFC9100
Benzonase Nuclease	Merck Millipore	E1014
Bromophenol blue	Sigma-Aldrich	B0126
CFX96 Real-Time PCR detection system	Biorad	184-5096
ChemiDoc Touch Imaging System	Bio-Rad Laboratories	1708370
Chicken polyclonal anti-GFP primary antibody	Abcam	ab13970
Coomassie Blue G250	Fisher Chemical	C/P541/46
Dithiothreitol (DTT)	Fisher Bioreagents	BP17225
DMEM	Sigma-Aldrich	D5796
ECF Substrate for Western Blotting	Cytiva	RPN5785
FastDigest SmaI	Thermo Scientific	FD0663
FEI-Tecnai G2 Spirit Biotwin	FEI	Biotwin	Transmission electron microscope
Fetal bovine serum	Biowest	S1810
Fluorescence mounting medium	Dako	S3023
Formvar-carbon coated 200 mesh grid	TAAB Laboratories Equipment	F077/025
Gas evacuation apparatus	RWD	R546W
Glycerol	Fisher BioReagents	10021083
Goat polyclonal anti-chicken antibody, Alexa Fluor 488	Invitrogen	A-11039
Hamilton needle 30G, Small Hub RN Needle, 25 mm, PST3	Hamilton	7803-07
Hamilton syringe (10 µL)	Hamilton	7653-01
HEK293T	American Type Culture Collection	CRL-11268
HiTrap Heparin HP 1 x 5 mL	Cytiva	17040701	Pre-packed heparin column
HiTrap Heparin HP 5 x 1 mL	Cytiva	17040601	Pre-packed heparin column
Immobilon-P PVDF Membrane	Merck Millipore	IPVH00010
Isoflurane	Braun	469860
Ketamine	Dechra Pharmaceuticals	N/A	Nimatek
Low-retention microcentrifuge tubes (2 mL)	Fisher Scientific	11906965
Lunatic & Stunner Client software	Unchained Labs	N/A	Client analysis software version 8.0.1.235. Software for the consecutive ultraviolet-visible light absorption, static light scattering, and dynamic light scattering analysis of rAAV samples
Methanol	Fisher Chemical	M/4000/FP21
Mouse monoclonal anti-AAV, VP1, VP2 antibody (A69)	American Research Products	03-61057
Mouse monoclonal anti-AAV, VP1, VP2, VP3 antibody (B1)	American Research Products	03-61058
Neuro2a	American Type Culture Collection	CCL-131
Normal goat serum	Gibco	16210064
NucleoBond Xtra Maxi EF	Macherey-Nagel	12738422
NZYColour Protein Marker II	NZYtech	MB09002
pAAV-CMV-scGFP	Addgene	32396	Addgene plasmid # 32396; http://n2t.net/addgene:32396; RRID:Addgene_32396
pAAV-CMV-ssGFP	Addgene	105530	Addgene plasmid # 105530; http://n2t.net/addgene:105530; RRID:Addgene_105530
pAAV2/9n	Addgene	112865	Addgene plasmid # 112865; http://n2t.net/addgene:112865; RRID:Addgene_112865
Paraformaldehyde	Acros Organics	10342243
PBS	Fisher BioReagents	BP2438
Penicillin-streptomycin	Gibco	15140-122
Pluronic F-68 Non-ionic Surfactant (100x)	Gibco	24040032
Polyethylenimine MAX, MW 40,000	Polysciences Europe	24765
R500 Series Compact Small Animal Anesthesia Machine - Isoflurane	RWD	N/A
Sample Inlet Valve V9-IS	Cytiva	29027746
Sample pump P9-S	Cytiva	29027745
Sodium azide	Sigma-Aldrich	S2002
Sodium chloride	Fisher Scientific	10428420
Sodium deoxycholate	Sigma-Aldrich	D6750
Sodium dodecyl sulfate (SDS)	Fisher Bioreagents	BP166
Sterile PVDF syringe filter	Fisher Scientific	15191499
Stunner Platform	Unchained Labs	700-2002	Equipment for the consecutive ultraviolet-visible light absorption, static light scattering, and dynamic light scattering analysis of rAAV samples
Superloop 150 mL	Cytiva	18-1023-85
Superloop 50 mL	Cytiva	18-1113-82
SURE 2 supercompetent cells	Stratagene, Agilent Technologies	HPA200152
Treated culture dishes	Corning	734-1711
Tris base	Fisher BioReagents	BP152
Tris hydrochloride	Fisher BioReagents	BP153
Triton X-100	Sigma-Aldrich	T8787
Trypsin-EDTA	Gibco	25200-072
Wheat Germ Agglutinin (WGA) conjugated with Alexa Fluor 633	Invitrogen	W21404
Xylazine	Dechra Pharmaceuticals	N/A	Sedaxylan
Zeiss Axio Observer Z1	Carl Zeiss Microscopy GmbH	N/A	Inverted fluorescence microscope equiped with an EC Plan-Neofluar 10x/0.30 objective and a Plan-Apochromat 40x/0.95 objective
Zeiss Axio Scan.Z1	Carl Zeiss Microscopy GmbH	N/A	Slide scanner fluorescence microscope equipped with a Plan-Apochromat 20x/0.8 objective
Zeiss LSM 710	Carl Zeiss Microscopy GmbH	N/A	Inverted confocal microscope equipped with a Plan-Apochromat 40x/1.4 Oil DIC objective
µ-Slide 8 well Ibidi	Ibidi	80826	8-well chamber slide