* Эти авторы внесли равный вклад
В данной рукописи описан подробный протокол генерации и очистки аденоассоциированных вирусных векторов с использованием оптимизированного метода аффинной хроматографии на основе гепарина. Он представляет собой простой, масштабируемый и экономичный подход, устраняющий необходимость в ультрацентрифугировании. Полученные векторы проявляют высокую чистоту и биологическую активность, доказывая свою ценность в доклинических исследованиях.
Аденоассоциированный вирус (AAV) становится все более ценным вектором для доставки генов in vivo и в настоящее время проходит клинические испытания на людях. Однако обычно используемые методы очистки AAV используют ультрацентрифугирование с градиентом плотности хлорида цезия или йодиксанола. Несмотря на свои преимущества, эти методы требуют много времени, имеют ограниченную масштабируемость и часто приводят к созданию векторов с низкой чистотой. Чтобы преодолеть эти ограничения, исследователи обращают свое внимание на методы хроматографии. Здесь мы представляем оптимизированный протокол аффинной хроматографии на основе гепарина, который служит универсальным этапом захвата для очистки AAV.
Этот метод основан на внутреннем сродстве AAV серотипа 2 (AAV2) к гепарансульфатным протеогликанам. В частности, протокол влечет за собой котрансфекцию плазмид, кодирующих желаемые капсидные белки AAV, с плазмидами AAV2, в результате чего получаются мозаичные AAV-векторы, которые сочетают в себе свойства обоих родительских серотипов. Вкратце, после лизиса клеток-продуцентов смесь, содержащую частицы AAV, непосредственно очищают в соответствии с оптимизированным одноэтапным протоколом гепариновой аффинной хроматографии с использованием стандартной системы быстрой белковой жидкостной хроматографии (FPLC). Очищенные частицы AAV впоследствии концентрируются и подвергаются всесторонней характеристике с точки зрения чистоты и биологической активности. Этот протокол предлагает упрощенный и масштабируемый подход, который может быть выполнен без необходимости ультрацентрифугирования и градиентов, что дает чистые и высокие титры вируса.
Вектор аденоассоциированного вируса (AAV) завоевывает свой путь в качестве одной из самых перспективных систем доставки в текущих исследованиях генной терапии. Первоначально идентифицированный в 1965году1, AAV представляет собой небольшой вирус без оболочки с икосаэдрическим белковым капсидом около 25 нм в диаметре, содержащим одноцепочечный геном ДНК. AAV принадлежат к семейству Parvoviridae и роду Dependoparvovirus из-за их уникальной зависимости от коинфекции с вирусом-помощником, таким как вирус простого герпеса или, чаще, аденовирус, для завершения своего литического цикла 2,3.
Геном AAV размером 4,7 килооснования состоит из двух открытых рамок считывания (ORF), фланкированных двумя инвертированными концевыми повторами (ITR), которые образуют характерные Т-образные концы шпилек4. ITR являются единственными цис-действующими элементами, критически важными для упаковки, репликации и интеграции AAV, поэтому являются единственными последовательностями AAV, сохраняющимися в рекомбинантных векторах AAV (rAAV). В этой системе гены, необходимые для производства векторов, поставляются отдельно, in trans, что позволяет упаковывать интересующий ген внутри вирусного капсида 5,6.
Каждый вирусный ген кодифицирует различные белки посредством альтернативного сплайсинга и стартовых кодонов. В ORF Rep кодируются четыре неструктурных белка (Rep40, Rep52, Rep68 и Rep78), играющие решающую роль в репликации, сайт-специфической интеграции и инкапсуляции вирусной ДНК 7,8. Cap ORF служит матрицей для экспрессии трех структурных белков, отличающихся друг от друга на их N-конце (VP1, VP2 и VP3), которые собираются в 60-мерный вирусный капсид в соотношении 1:1:10 4,9. Кроме того, альтернативный ORF, вложенный в ген Cap с нетрадиционным стартовым кодоном CUG, кодирует белок, активирующий сборку (AAP). Было показано, что этот ядерный белок взаимодействует с вновь синтезированными капсидными белками VP1-3 и способствует сборке капсида10,11.
Различия в аминокислотной последовательности капсида объясняют 11 встречающихся в природе серотипов AAV и более 100 вариантов, выделенных из тканей человека и приматов 7,12,13. Вариации в конформации структурно изменчивых областей определяют различные антигенные свойства и рецептор-связывающую специфичность капсидов из разных штаммов. Это приводит к различным тканевым тропизмам и эффективности трансдукции между различными органами млекопитающих14.
Ранние методы производства rAAV полагались на аденовирусную инфекцию в качестве вспомогательного средства 15,16,17,18,19. Несмотря на то, что эта инфекция эффективна и обычно проста в производстве в больших масштабах, возникает несколько проблем. Даже после очистки и этапа термоденатурации для инактивации аденовирусные частицы могут по-прежнему присутствовать в препаратах AAV, что представляет собой нежелательную проблему безопасности20. Более того, наличие денатурированных аденовирусных белков недопустимо для клинического применения. В других стратегиях производства используются рекомбинантные штаммы вируса простого герпеса, сконструированные для введения Rep/Cap и трансгена в клетки-мишени21 или в клеточную систему22 бакуловирус-насекомое. Хотя эти системы предлагают преимущества с точки зрения масштабируемости и совместимости с GMP, они все еще сталкиваются с аналогичными проблемами.
Метод тройной трансфекции для производства rAAV обычно используется для легкого преодоления этих проблем. Вкратце, сборка rAAV основана на транзиторной трансфекции клеток тремя плазмидами, кодирующими для: 1) кассеты экспрессии трансгенов, упакованной между ITR из генома AAV2 дикого типа (pITR); 2) последовательности Rep/Cap, необходимые для репликации и сборки вирионов (pAAV-RC); и 3) минимальное количество аденовирусных белков (E1A, E1B, E4 и E2A) вместе с аденовирус-ассоциированными РНК, необходимыми для хелпер-эффекта (pHelper)6,20,23. В то время как методы трансфекции плазмид обеспечивают простоту и гибкость производства rAAV в доклинических исследованиях, эти процедуры имеют ограничения с точки зрения масштабируемости и воспроизводимости при применении к крупномасштабному производству. В качестве альтернативного подхода продукция rAAV может быть достигнута за счет использования клеточных линий-продуцентов AAV (как адгезивного, так и суспензионного роста), стабильно экспрессирующих либо гены AAV Rep/Cap, либо Rep/Cap в сочетании с векторными конструкциями. В этих системах аденовирусные гены-хелперы вводятся путем трансфекции плазмид. Несмотря на то, что эта стратегия улучшает масштабируемость процесса культивирования клеток, она технически сложна и трудоемка 21,24,25.
В любом случае клетки-продуценты затем лизируют и подвергают одной или нескольким стадиям очистки. В настоящее время основные методы очистки rAAV включают использование центрифугирования со сверхскоростным градиентом плотности хлорида цезия (CsCl) или йодиксанола с последующими методами хроматографии26. Первоначальная схема очистки для вирусного осаждения использовала сульфат аммония с последующим двумя или тремя раундами ультрацентрифугирования через градиент CsCl. К основным преимуществам этого процесса можно отнести возможность очистки всех серотипов и возможность физически отделять полные частицы от пустых капсидов на основе их различной плотности. Однако этот метод сложен, занимает много времени и имеет ограниченную масштабируемость, что часто приводит к низкому выходу и низкому качеству образцов 27,28,29,30. Более того, диализ против физиологического буфера часто необходим до исследований in vivo из-за токсического воздействия, которое CsCl может оказывать на млекопитающих.
Йодиксанол также используется в качестве альтернативной изоосмотической градиентной среды для очистки векторов rAAV, имея преимущества перед CsCl как с точки зрения безопасности, так и с точки зрения векторной активности. Однако, как и CsCl, метод йодиксанола имеет некоторые недостатки, связанные с загрузочной способностью лизата клеточной культуры (и, следовательно, масштабируемостью очистки rAAV), и он остается трудоемким и дорогостоящим методом30,31.
Чтобы преодолеть эти ограничения, исследователи обратили свое внимание на методы хроматографии. В связи с этим было разработано несколько подходов к очистке, которые включают в себя либо аффинные, гидрофобные, либо ионообменные методы хроматографии. Эти методы основаны на биохимических свойствах конкретного серотипа, включая их естественные рецепторы, или на зарядовых характеристиках вирусной частицы32. Например, открытие того, что AAV2, AAV3, AAV6 и AAV13 предпочтительно связываются с гепарансульфатными протеогликанами (HSPG), открыло возможность использования близкородственного гепарина в аффинной хроматографической очистке. Однако сайты связывания с HSPG могут различаться в зависимости от серотипов, опосредуя прикрепление AAV и инфекцию клеток-мишеней различными способами 2,33,34,35,36. С другой стороны, AAV1, AAV5 и AAV6 связываются с N-связанной сиаловой кислотой (SA), в то время как AAV4 использует O-связанную SA 2,14,34. Следуя тому же обоснованию, был также разработан одноступенчатый протокол аффинной хроматографии для очистки rAAV5, основанный на использовании муцина, белка млекопитающих, высокообогащенного SA37. Как и методы на основе гепарина, это очищение также зависит от конкретного генерируемого серотипа. Помимо гепарина и муцина, для аффинной хроматографии были исследованы и другие лиганды, такие как моноклональное антитело A20 и однодоменные антитела верблюдов (AVB Sepharose и POROS CaptureSelect)22,23,38,39,40,41. Другие инновационные стратегии для улучшения ранее существовавших методов очистки включают введение небольших модификаций в капсид rAAV для представления специфических связывающих эпитопов. Например, меченные гекса-гистидином или биотинилированные rAAV могут быть очищены с помощью лигандов, нацеленных на эти эпитопы (никель-нитрилотриуксусная кислота и авидиновые смолы, соответственно)42,43,44.
В попытке расширить желаемые характеристики rAAV, исследователи пересекли вирионы, смешав их капсиды. Это достигается путем поставки гена капсида из двух различных серотипов AAV в эквимолярных или различных соотношениях во время производства, что приводит к образованию структуры капсида, состоящей из смеси субъединиц капсида из разных серотипов 34,45,46,47,48,49,50 . Предыдущие исследования предоставляют физические доказательства того, что коэкспрессия капсидных белков из AAV2 с AAV1 (соотношение 1:1) и AAV2 с AAV9 (соотношение 1:1) приводит к генерации мозаичных векторов rAAV1/2 и rAAV2/9 соответственно 45,46,48. Основным преимуществом создания мозаичных rAAV является способность интегрировать выгодные черты из различных серотипов AAV, что приводит к синергетическому улучшению экспрессии трансгенов и тропизма, сохраняя при этом другие свойства, полезные при производстве rAAV. Интересно, что некоторые мозаичные варианты даже демонстрируют новые свойства, отличные от любого родительского вируса 46,47,49. Используя гепарин-связывающую способность AAV2, мозаичные векторы rAAV потенциально могут быть сгенерированы и очищены путем смешивания AAV2 с другими естественными или новыми капсидами AAV, полученными в результате направленной эволюции и/или рационального дизайна. Тем не менее, предыдущие исследования подчеркнули важность совместимости субъединиц капсида при попытке собрать мозаичные векторы. Например, Рабинович и его коллеги продемонстрировали, что, хотя транскапсидация AAV1, AAV2 и AAV3 привела к эффективной совместной сборке мозаичных капсидов, скрещивание этих серотипов с AAV4 препятствовало генерации стабильных вирионов 34,45,47. Кроме того, AAV1, AAV2 и AAV3 показали низкую совместимость с AAV5, учитывая сниженные титры вируса, полученные при смешивании этих капсидов в разных соотношениях. Интересно, что мозаичный rAAV2/5 показал снижение гепарин-связывающих свойств, сохраняя при этом муцин-связывающую способность, как у родительского AAV5. Однако rAAV3/5 в соотношении 3:1 сохранял двойное связывание с гепарином и муцином. В целом, создание новых мозаичных rAAV с улучшенной трансдукцией, специфическим тропизмом или низкой иммуногенностью может значительно выиграть от нашего понимания сборки капсида и взаимодействия рецепторов, при этом конкретные комбинации все еще требуют тщательного исследования и оптимизации.
В настоящей работе мы описываем пошаговый протокол получения и очистки rAAV с использованием оптимизированного метода гепариновой аффинной хроматографии. rAAV производятся путем транзиторной трансфекции и очищаются с помощью системы быстрой белковой жидкостной хроматографии (FPLC). После концентрирования выбранных очищенных фракций полученные вирусные запасы характеризуются титром, чистотой, внутренними физическими свойствами и биологической активностью in vitro и in vivo. В качестве доказательства концепции мы демонстрируем улучшения и применимость этого протокола для генерации мозаичных векторов rAAV1/2 и rAAV2/9. Выбор каждого серотипа был основан на их поразительно разных тропизмах, потенциально придающих свои уникальные характеристики и мозаичным версиям. AAV серотипа 1 с общим умеренным тропизмом центральной нервной системы (ЦНС) обладает способностью трансдуцировать нейроны и глию (в меньшей степени) и подвергается аксональному транспорту в антероградном и ретроградном направлениях in vivo 2,7,8. Кроме того, серотип 9 AAV был выбран из-за его естественной способности пересекать гематоэнцефалический барьер и воздействовать на ЦНС как у новорожденных, так и у взрослых мышей51,52. Наконец, был выбран серотип 2 AAV, учитывая его способность связываться с гепарином, что позволяет проводить аффинную хроматографию33. Очищенные частицы rAAV1/2 и rAAV2/9 сочетают в себе свойства обоих родительских серотипов AAV и, следовательно, представляют собой подходящие векторы для трансдукции ЦНС 45,46,48,49.
ПРИМЕЧАНИЕ: На рисунке 1 приведена иллюстрация, обобщающая протокол. Смотрите Таблицу материалов для получения подробной информации обо всех материалах, инструментах и реагентах, используемых в этом протоколе. Все работы, связанные с клетками и вирусами, должны выполняться в специальных шкафах и инкубаторах биобезопасности, отделенных от тех, которые регулярно используются для обслуживания клеточных линий. Оборудование и реагенты, вступающие в контакт с культивируемыми клетками и вирусами, должны быть стерильными. Важно, чтобы удаление опасных реагентов и материалов, зараженных вирусами, осуществлялось в соответствии с паспортами безопасности материалов и в соответствии с национальными законами и руководящими принципами, разработанными отделом по охране окружающей среды и безопасности каждого учреждения. По состоянию на апрель 2019 года в рекомендациях NIH по исследованиям с использованием рекомбинантных или синтетических молекул нуклеиновых кислот все серотипы AAV (не связанные с заболеванием у здоровых взрослых людей) классифицируются как агенты группы риска 1 (не связанные с заболеванием у здоровых взрослых людей), а также рекомбинантные или синтетические конструкции AAV. Эта классификация применяется, когда трансген не кодирует потенциально опухолевый генный продукт или токсин, и конструкции производятся без вируса-помощника.
Все эксперименты с участием животных проводились в соответствии с директивой Сообщества Европейского союза (2010/63/EU) об уходе за лабораторными животными и их использовании, перенесенной в португальское законодательство в 2013 году (Законодательный декрет 113/2013). Кроме того, процедуры с животными были одобрены Ответственной организацией по благополучию животных медицинского факультета и Центром неврологии и клеточной биологии лицензированного ветеринарного учреждения Университета Коимбры. Исследователи прошли соответствующую подготовку (курс, сертифицированный FELASA) и сертификацию от португальских властей (Direcção Geral de Alimentação e Veterinária, Лиссабон, Португалия) для проведения экспериментов.
1. Плазмидные конструкции
2. Клеточная культура
3. Получение rAAV транзиентной трансфекцией
4. Экстракция rAAV и очистка FPLC
5. Концентрация очищенных rAAV
6. Количественная оценка очищенных rAAV
7. SDS-PAGE, синее окрашивание Кумасси и западная блота
8. Просвечивающая электронная микроскопия (ПЭМ)
9. Последовательное поглощение ультрафиолетового видимого света, статическое рассеяние света и динамический анализ рассеяния света
10. Анализ трансдукции in vitro
11. Эксперименты in vivo
ПРИМЕЧАНИЕ: Животные содержались в помещении с регулируемой температурой, поддерживаемом 12-часовым циклом свет/темнота. Еда и вода предоставлялись в свободном количестве. Были приложены все усилия, чтобы свести к минимуму страдания животных.
В этой работе мы представляем подробный протокол производства, очистки и характеристики мозаичных rAAV (обобщенных на рисунке 1), которые обладают потенциалом для нацеливания и трансдукции ЦНС (например, AAV1 и AAV9), одновременно подходя для очистки гепариновой аффинной хроматографии (AAV2). Для достижения этой цели капсиды из природных серотипов AAV 1, 2 и 9 были использованы для создания мозаичных векторов rAAV1/2 и rAAV2/9.
Перед началом плазмидные препараты были проверены на структурную целостность. В дополнение к расщеплению, необходимому для проверки правильности вставки клонирующих фрагментов, важно последовательно проводить скрининг pITR-плазмид для обнаружения потенциальных делеций/вставок ITR. Например, целостность ITR в различных клонах pITR плазмиды контролировали после расщепления плазмиды с помощью фермента рестрикции SmaI (дополнительный рисунок S1).
Оба типа мозаичных векторов были получены путем котрансфекции соответствующих плазмид капсида AAV в соотношении 1:1 в соответствии со стандартными методами трансфекции6. Вкратце, HEK293T клетки трансфицировали i) плазмидой, содержащей интересующий трансген, упакованным между последовательностями ITR (pITR), ii) плазмидой, содержащей ORF Rep и Cap генома AAV дикого типа AAV2 и AAV1 или AAV9 (pAAV-RC плазмиды) и iii) плазмидой, кодирующей аденовирусные белки (E1A, E1B, E4 и E2A), а также аденовирус-ассоциированные РНК, необходимые для хелперных функций (pHelper). Через 48 часов клетки были собраны 6,36, и rAAV были очищены от клеточного гомогената с помощью аффинной хроматографии с использованием системы FPLC. Как показано на рисунке 2A, после уравновешивания колонки (стадия уравновешивания) на колонку наносили клеточный лизат, содержащий rAAV, (загрузка образца). Из-за естественного сродства rAAV2 к гепарину33 rAAV связывались со смолой колонки, в то время как другие компоненты осуществлялись в работающем буфере и детектировались УФ-монитором (протеканием), что приводило к увеличению поглощения. Затем колонку промывали (стадия промывки) и rAAV окончательно элюировали путем увеличения концентрации NaCl (стадия элюирования). Элюированные вирусы были обнаружены с помощью УФ-монитора и собраны во фракции по 1 мл.
Репрезентативный профиль пика элюирования rAAV1/2 и rAAV2/9 показан на рисунке 2B и дополнительном рисунке S2A соответственно, при этом различные вирусные партии последовательно демонстрируют один пик, начиная с фракции F7 до F16. Пиковая высота варьируется среди производств rAAV, при этом более высокие пики обычно приводят к более высокому выходу rAAV. Каждую фракцию полученных rAAV1/2 и rAAV2/9 впоследствии охарактеризовали с помощью ОТ-кПЦР для оценки титров вируса (рисунок 2C и дополнительный рисунок S2B).
Чтобы охарактеризовать чистоту элюированного материала, 40 мкл каждой фракции и соответствующего протекания исследовали с помощью 10% электрофореза в геле SDS-полиакриламида (рисунок 2D для rAAV1/2 и дополнительный рисунок S2C для rAAV2/9). Окрашивание синим цветом Кумасси выявило три основные полосы во фракциях F7-F16 с молекулярной массой, соответствующей капсидным белкам VP1 (87 кДа), VP2 (72 кДа) и VP3 (62 кДа) AAV в соответствующих соотношениях 1:1:10, как ранее было описано Ван Влитом и коллегами14. В обоих случаях, а также на основании поглощения УФ-излучения, ОТ-кПЦР и интенсивности гелевых полос, ясно, что большинство мозаичных rAAV присутствует во фракциях F7 и F8 и начинает постепенно снижаться во фракциях F9-F16. В дополнение к трем вирусным белкам капсида был обнаружен другой белок (или белки) размером около 17 кДа во фракциях F8-F16.
Для устранения этого соочищающего белка (белков) фракции F7-16 впоследствии фильтровали и концентрировали с использованием центробежных фильтровальных установок с массой 100 кДа, а окончательный титр rAAV определяли методом ОТ-кПЦР (как показано на рисунке 3A, B для rAAV1/2). Конечный выход продукции rAAV зависит от длины и сложности pITR, целостности последовательностей ITR, условий культивирования клеток (например, количества клеточных пассажей) и эффективности трансфекции 24,58,59,60,61. Тем не менее, конечный титр можно отрегулировать, выполнив многократное центрифугирование препарата rAAV с использованием центробежных фильтровальных установок объемом 0,5 мл (стадия концентрации 2). В соответствии с этим протоколом для конечного объема в диапазоне от 50 до 100 мкл концентрации обычно составляют от 2 × 109 до 5 ×10 10 вг/мкл (количественное определение проводят с использованием эталонного набора для титрования).
Затем чистоту окончательных препаратов rAAV оценивали на 10% SDS-полиакриламидном геле. Как показано на рисунке 3C, для препарата rAAV1/2 наблюдались только три полосы, представляющие капсидные белки rAAV, и не было идентифицировано никаких обнаруживаемых коочищающих белков. Эти результаты согласуются с результатами, полученными для rAAV2/9 (дополнительный рисунок S2C). Для подтверждения идентичности и дальнейшей характеристики чистоты векторов rAAV1/2 и rAAV2/9 вирусные фракции и концентрированные запасы были проанализированы методом вестерн-блоттинга со специфическими антителами B1 (дополнительный рисунок S3A и дополнительный рисунок S4A) и A69 (дополнительный рисунок S3B и дополнительный рисунок S4B). В то время как антитело B1 распознает С-концевой эпитоп, общий для всех белков VP большинства серотиповAAV 62, клон A69 распознает только эпитопы VP1 и VP263. Тем не менее, некоторые слабые полосы с молекулярной массой ниже VP3 (<62 кДа) также могут быть обнаружены при мечении B1 и A69.
Чтобы охарактеризовать структурную морфологию и в дальнейшем оценить чистоту rAAV, вирусные частицы были непосредственно визуализированы с помощью TEM. Этот метод является стандартной процедурой для оценки целостности и чистоты образцов вируса, поскольку он позволяет количественно определять пустые и полные частицы rAAV, а также оценивать загрязнение в образце 29,64,65,66,67. Как показано на рисунке 3D, большое количество частиц rAAV диаметром ~25 нм можно наблюдать на чистом фоне. Пустые частицы (черная стрелка) с электронно-плотным центром, а также полные векторы (белая стрелка) также можно наблюдать по всему полю образца.
Мы также выполнили контроль качества очищенных rAAV с помощью Stunner, платформы, которая сочетает в себе ультрафиолетовую (УФ-видимую) спектроскопию, статическое рассеяние света (SLS) и динамическое рассеяние света (DLS)68. Для каждого образца с помощью УФ-ВИД спектроскопии измеряли общее количество белка, одноцепочечной ДНК, а также поглощающие примеси и фоновую мутность (рисунок 3E и дополнительный рисунок S5A). Затем SLS и DLS были применены для оценки светорассеивающего поведения капсидов rAAV. Учитывая, что AAV имеют средний диаметр 25 нм, частицы в диапазоне диаметров 15-45 нм считаются неповрежденными. Более крупные частицы обычно представляют собой вирусные агрегаты, а все, что меньше, скорее всего, содержит мелкие частицы, включая несобранные капсидные белки68. Для rAAV1/2 один пик, соответствующий интактным частицам капсида, наблюдался на длине волны 30 нм (рис. 3F) с 0% от совокупной интенсивности и 0% от интенсивности мелких частиц. Для препарата rAAV2/9 также был обнаружен пик на длине волны 30 нм, представляющий 78% интенсивность капсида (дополнительный рисунок S5B). Несмотря на то, что интенсивность мелких частиц составила 0%, для этого образца была измерена совокупная интенсивность 22% (изображена серым цветом), причем основной вклад (19,9%) внесли крупные агрегаты со средним диаметром 620 нм (дополнительный рисунок S5B). Благодаря сочетанию УФ-ВИД спектроскопии с информацией SLS и DLS, Станнер выявил общий общий титр капсида, полный титр капсида, свободный и агрегированный белок, а также свободную и агрегированную одноцепопенную ДНК для двух вирусных препаратов, показанных на рисунке 3G и дополнительном рисунке S5C (конкретные значения указаны в подписи к каждому рисунку).
Параллельно для оценки биологической активности разработанных мозаичных AAV-векторов HEK293T клетки инфицировали 50 мкл каждой фракции, полученной FPLC (F2-F16) препарата rAAV1/2 или rAAV2/9. Поскольку вектор rAAV1/2 кодирует одноцепочечный зеленый флуоресцентный белок (GFP) под контролем промотора ЦМВ (PAAV-CMV-SSGFP), а вектор rAAV2/9 кодирует самокомплементарный GFP, под контролем промотора ЦМВ (PAAV-CMV-SCGFP53), прямая флуоресценция GFP была исследована в этих клетках через 48 часов после заражения (дополнительный рисунок S6 и дополнительный рисунок S7). В соответствии с предыдущими наблюдениями для ОТ-кПЦР, синего Кумасси и вестерн-блота наибольший уровень инфекционности был достигнут для вирусных фракций F7 и F8, постепенно снижаясь во фракциях F9 до F16.
Чтобы подтвердить, сохраняется ли биологическая активность rAAV после этапов ультрафильтрации и концентрирования, клетки Neuro2A, помещенные как в 24-луночные планшеты, так и в 8-луночное камерное стекло, были инфицированы концентрированным вектором rAAV1/2, кодирующим scGFP под контролем промотора ЦМВ (pAAV-CMV-scGFP53). Светлопольные и флуоресцентные изображения были получены через 48 ч после заражения (рис. 4A, B для изображений с более высоким разрешением).
С целью изучения инфекционной способности полученных rAAV в более релевантной и отражающей клеточной модели, полуплотные первичные нейронные культуры из коры головного мозга засеивали на 12-луночный планшет и инфицировали ранее использованным rAAV1/2 - CMV-scGFP. Через сорок восемь часов после заражения клетки фиксировали и помечали DAPI и WGA, конъюгированными с Alexa Fluor 633, широко используемый лектин для маркировки фиксированных клеток. Изображения, показанные на рисунке 4C, D, были получены с помощью Zeiss Axio Observer Z1 и конфокального объектива Zeiss LSM 710. Как показано на этих рисунках с помощью прямой флуоресценции GFP, концентрированные мозаичные вирусы сохраняют свои свойства переноса генов для нейрональных клеток.
Охарактеризовав мозаичные rAAV с точки зрения чистоты, физических свойств и функциональности in vitro, мы затем оценили возможность использования очищенных мозаичных векторов rAAV1/2 для трансдукции мозжечка мышей C57BL/6. Для этого 9-недельным мышам была выполнена стереотаксическая инъекция, а экспрессия GFP была оценена через 12 недель. Как и ожидалось, животные, которым вводили PBS, не проявляли флуоресценции при иммуномечении GFP. Эпифлуоресцентные изображения мышей, которым вводили векторы rAAV1/2, кодирующие GFP под контролем промотора синапсина 1 (rAAV1/2 - Syn-ssGFP), показали, что векторы rAAV1/2 успешно трансдуцировали несколько областей мозжечка, а именно область глубоких ядер мозжечка (DCN), а также различные дольки мозжечка (рис. 5). Эти результаты демонстрируют длительную экспрессию трансгена в мозге млекопитающих (12 недель).
Рисунок 1: Схематическое изображение протокола производства и очистки rAAV. rAAV получают путем транзиторной трансфекции HEK293T клеток с использованием полиэтиленимина (PEI). Затем клетки собирают и лизируют, а rAAV очищают от клеточного гомогената с помощью аффинной хроматографии. Затем собранные фракции, содержащие rAAV, концентрируют, и конечные вирусные запасы характеризуют с точки зрения титра, чистоты, морфологических особенностей и биологической активности. Сокращения: rAAV = рекомбинантный аденоассоциированный вирус; PEI = полиэтиленимин; RT-qPCR = количественная полимеразная цепная реакция в реальном времени; SDS-PAGE = электрофорез в геле додецилсульфата натрия и полиакриламида. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 2: Протокол очистки FPLC и репрезентативный профиль элюирования rAAV1/2. (A) Схематическое изображение полного профиля хроматограммы, показывающее различные стадии процесса очистки rAAV. После шага уравновешивания столбца применяется выборка. Затем колонку промывают и элюируют с увеличением концентрации NaCl. Для анализа собирают несвязанный материал (проточный) и фракции 1 мл элюированных вирусов. Поглощение на длине волны 280 нм выражается в мА.е., а ось x указывает на объем в мл. (B) Увеличенная частичная хроматограмма, показывающая пик элюирования rAAV1/2 (черным цветом), с соответствующими номерами фракций (F2-F16) и отходами (обозначены красным цветом). Концентрация буфера B и проводимость (выраженная в мСм/см) также показаны зеленым и фиолетовым цветом соответственно. (C) ОТ-кПЦР каждой фракции, собранной во время аффинной очистки (F2-F16) и протекания. Титр в vg/μL представлен в логарифмической шкале. (D) Анализ собранных вирусных фракций SDS-PAGE. Равные объемы (40 мкл) каждой фракции со стадии элюирования (F2-F16) и соответствующий проток загружали и растворяли на 10% SDS-полиакриламидном геле. Белковые полосы визуализировались синим окрашиванием Кумасси. Обозначены полосы, соответствующие капсидным белкам AAV VP1, VP2 и VP3. Стандартная лестница размеров белка обозначается как (L), а также указывается соответствующая молекулярная масса. Сокращения: rAAV = рекомбинантный аденоассоциированный вирус; RT-qPCR = количественная полимеразная цепная реакция в реальном времени; SDS-PAGE = электрофорез в геле додецилсульфата натрия и полиакриламида. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 3: Характеристика концентрированных векторов rAAV1/2. (A) Кривые амплификации концентрированного образца rAAV1/2 (синего цвета), серийно разбавленных стандартов от 2 × 107 vg/μL до 2 × 102 vg/μL (черного цвета) и нематричного контроля (зеленого цвета), полученных в ходе RT-qPCR. (B) Стандартная кривая (линейная регрессия) для определения титра образца rAAV в vg/μL. (C) SDS-PAGE анализ концентрированных вирусных частиц. В общей сложности на геле было объединено 2,3 ×10 10 vg концентрированного запаса. (D) Просвечивающее электронное микроскопическое изображение частиц rAAV1/2 диаметром ~25-30 нм. Пустые частицы с электронно-плотным центром (о чем свидетельствуют черные стрелки) можно отличить от полных капсид (о чем свидетельствуют белые стрелки). Масштабная линейка = 100 нм. (E) Спектр поглощения препарата rAAV1/2, измеренный Stunner (черным цветом). Также показан вклад белков (синий), одноцепочечной ДНК (зеленый), других УФ-поглощающих соединений или примесей (фиолетовый) и фоновая мутность (серый). (F) Распределение интенсивности DLS rAAV1/2 с одним пиком на 30 нм, измеренное Stunner. Интенсивность рассеяния капсида 100% определяли путем измерения площади под кривой от 15 до 45 нм (заштриховано зеленым). (G) Потрясающий анализ векторного препарата rAAV1/2, демонстрирующего общий титр капсида 1,19 ×10 14 кп/мл (темно-синий) и полный титр капсида 1,73 ×10 13 вг/мл (темно-зеленый). Также измеряли свободный и агрегированный белок в эквиваленте 7,16 ×10 12 cp/мл (светло-голубой), а также свободную и агрегированную одноцепочечную ДНК в эквиваленте 1,04 × 1012 vg/мл (светло-зеленый). Сокращения: rAAV = рекомбинантный аденоассоциированный вирус; RT-qPCR = количественная полимеразная цепная реакция в реальном времени; SDS-PAGE = электрофорез в геле додецилсульфата натрия и полиакриламида; ssDNA = одноцепочечная ДНК; DLS = динамическое рассеяние света. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 4: Оценка инфекционности in vitro концентрированного образца rAAV1/2. (A) Клетки Neuro2A инфицировали rAAV1/2 - CMV-scGFP или инкубировали с эквивалентным объемом PBS в качестве отрицательного контроля. Светлопольные и флуоресцентные изображения клеток, полученные через 48 ч после заражения. Изображения были получены с помощью объектива Zeiss Axio Observer Z1 (10-кратный объектив). Масштабные линейки = 100 мкм. (B) Подробные изображения клеток Neuro2A через 48 ч после заражения rAAV1/2 - CMV-scGFP. Изображения были получены с помощью объектива Zeiss LSM 710 (40-кратный объектив). Масштабные линейки = 20 мкм. (C) Полуплотные первичные культуры нейронов, инфицированные rAAV1/2 - CMV-scGFP или инкубированные с эквивалентным объемом PBS, служащие в качестве отрицательного контроля. Клетки были помечены ядерным красителем (DAPI синего цвета) и мембранным окрашиванием (WGA белым). Изображения были получены с помощью объектива Zeiss Axio Observer Z1 (40-кратный объектив). Масштабные линейки = 20 мкм. (D) Подробные изображения полуплотных первичных нейрональных культур через 48 ч после заражения rAAV1/2 - CMV-scGFP. Изображения получены с помощью объектива Zeiss LSM 710 (40-кратный объектив). Масштабные линейки = 20 μм. Сокращения: rAAV = рекомбинантный аденоассоциированный вирус; ЦМВ = цитомегаловирус; scGFP = самокомплементарный зеленый флуоресцентный белок; PBS = фосфатно-солевой буфер; DAPI = 4',6-диамидино-2-фенилиндол; WGA = агглютинин зародышей пшеницы. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 5: Эффективность трансдукции rAAV1/2 in vivo после внутрипаренхиматозной инъекции. Репрезентативные иммунофлуоресцентные изображения, показывающие широко распространенную экспрессию GFP (зеленым цветом) по всему мозжечку при центральной инъекции rAAV1/2 - Syn-ssGFP в мозжечок. Ядра окрашивали DAPI (синим цветом). Масштабные линейки = 500 μм. Сокращения: rAAV = рекомбинантный аденоассоциированный вирус; Syn = Синапсин 1; ssGFP = одноцепочечный зеленый флуоресцентный белок; DAPI = 4',6-диамидино-2-фенилиндол; PBS = фосфатно-солевой буфер. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Дополнительный рисунок S1: Анализ агарозного геля плазмиды вектора rAAV, расщепленной SmaI. Шесть клонов (C1-C6) pITR расщепляли ферментом рестрикции SmaI (дорожки 2, 4, 6, 8, 10 и 12), который разрезается дважды в каждом инвертированном концевом повторе. В этом случае ожидается, что полное расщепление этого пИТР приведет к образованию двух полос (3 796.о. и 3 013.о.). В успешных препаратах (С1, С3, С4 и С5) все еще видна полоса в 6809.о., возникающая в результате частичного переваривания (~5% от общего количества). В препаратах с рекомбинацией ИТР пропорции обратные (С2), либо переваривание не происходило (С6). Также представлены соответствующие непереваренные клоны (дорожки 3, 5, 7, 9, 11, 13). Сокращения: rAAV = рекомбинантный аденоассоциированный вирус; ITR = инвертированный терминальный повтор. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы загрузить этот файл.
Дополнительный рисунок S2: очистка rAAV2/9 с помощью гепариновой аффинной хроматографии. (A) Профиль элюирования rAAV2/9 с одним пиком (выделен черным цветом) после увеличения концентрации NaCl. Собранные фракции обозначены цифрами (2-16) красным цветом в нижней части графика, поглощение на 280 нм выражается в мАЕ, проводимость выражается в мСм/см, а по оси x указывается объем в мл. (B) титры rAAV, количественно определенные с помощью ОТ-кПЦР для каждой объединенной фракции (F2-F16) и сквозного потока. Значения представлены в логарифмической шкале. (C) Анализ чистоты с помощью SDS-PAGE и окрашивание в синий цвет Кумасси. Равные объемы (40 мкл) каждой фракции (F2-F16) и соответствующего протекания загружали и разрешали на 10% SDS-PAGE. Концентрированный запас количественно определяли с помощью ОТ-кПЦР, и 2,3 ×10 10 vg разбавляли в 40 мкл PBS и объединяли на геле. Белковые полосы визуализировались синим окрашиванием Кумасси. Показаны капсидные белки AAV (VP1, VP2 и VP3). Стандартная лестница размеров белка обозначается (L), а также указывается соответствующая молекулярная масса. Сокращения: rAAV = рекомбинантный аденоассоциированный вирус; RT-qPCR = количественная полимеразная цепная реакция в реальном времени; SDS-PAGE = электрофорез в геле додецилсульфата натрия и полиакриламида. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы загрузить этот файл.
Дополнительный рисунок S3: Вестерн-блоттинг векторов rAAV1/2, очищенных FPLC. (A) Собранные фракции и концентрированные векторы rAAV1/2 растворяли на геле SDS-PAGE и зондировали мышиным моноклональным антителом против AAV (B1), которое распознает капсидные белки VP1, VP2 и VP3. (B) Собранные фракции и концентрированные векторы rAAV1/2 растворяли на геле SDS-PAGE и зондировали мышиным моноклональным антителом против AAV (A69), которое распознает капсидные белки VP1 и VP2. Сокращения: rAAV = рекомбинантный аденоассоциированный вирус; FPLC = быстрая белковая жидкостная хроматография; SDS-PAGE = электрофорез в геле додецилсульфата натрия и полиакриламида; L = стандартная лестница размера белка. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы загрузить этот файл.
Дополнительный рисунок S4: Вестерн-блоттинг векторов rAAV2/9, очищенных FPLC. (A) Собранные фракции и концентрированные векторы rAAV2/9 растворяли на геле SDS-PAGE и зондировали мышиным моноклональным антителом против AAV (B1), которое распознает капсидные белки VP1, VP2 и VP3. (B) Собранные фракции и концентрированные векторы rAAV2/9 растворяли на геле SDS-PAGE и зондировали мышиным моноклональным антителом против AAV (A69), которое распознает капсидные белки VP1 и VP2. Сокращения: rAAV = рекомбинантный аденоассоциированный вирус; FPLC = быстрая белковая жидкостная хроматография; SDS-PAGE = электрофорез в геле додецилсульфата натрия и полиакриламида; L = стандартная лестница размера белка. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы загрузить этот файл.
Дополнительный рисунок S5: количественное определение и характеристика вектора rAAV2/9 с помощью Stunner. (A) Спектр поглощения (черный) вектора rAAV2/9, измеренный Stunner. Также изображен вклад белков (синий), одноцепочечной ДНК (зеленый), других УФ-поглощающих соединений или примесей (фиолетовый) и фоновая мутность (серый). (B) Распределение интенсивности DLS rAAV2/9 с основным пиком на 30 нм, соответствующим интенсивности рассеяния капсида 78%, что определено путем измерения площади под кривой от 15 до 45 нм (заштриховано зеленым). Также была измерена общая совокупная интенсивность 22% (заштриховано серым цветом) с основным вкладом крупных агрегатов (19,9%) со средним диаметром 620 нм. (C) Потрясающий анализ векторного препарата rAAV2/9, демонстрирующего общий титр капсида 2,18 ×10 14 кп/мл (темно-синий) и полный титр капсида 2,35 ×10 13 вг/мл (темно-зеленый). В этом препарате также измеряли свободный и агрегированный белок в эквиваленте 2,92 ×10 13 cp/мл (светло-голубой), а также свободную и агрегированную ssDNA в эквиваленте 3,14 ×10 12 vg/мл (светло-зеленый). Сокращения: rAAV = рекомбинантный аденоассоциированный вирус; ssDNA = одноцепочечная ДНК; DLS = динамическое рассеяние света. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы загрузить этот файл.
Дополнительный рисунок S6: Эффективность трансдукции in vitro и жизнеспособность очищенных фракций rAAV1/2. HEK293T клетки, экспрессирующие GFP (прямую флуоресценцию) через 48 ч после трансдукции 50 мкл FPLC-фракций вектора rAAV1/2, кодирующего ssGFP (rAAV1/2 - CMV-ssGFP). Масштабные линейки = 100 μм. Сокращения: rAAV = рекомбинантный аденоассоциированный вирус; FPLC = быстрая белковая жидкостная хроматография; ssGFP = одноцепочечный зеленый флуоресцентный белок. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы загрузить этот файл.
Дополнительный рисунок S7: Эффективность трансдукции in vitro и жизнеспособность очищенных фракций rAAV2/9. HEK293T клетки были инфицированы 50 мкл каждой фракции FPLC (F2-F16) или протоком вектора rAAV2/9, кодирующего scGFP под контролем промотора ЦМВ. Клетки, экспрессирующие GFP, визуализировали через 48 ч после заражения. Масштабные линейки = 100 μм. Сокращения: rAAV = рекомбинантный аденоассоциированный вирус; FPLC = быстрая белковая жидкостная хроматография; scGFP = самокомплементарный зеленый флуоресцентный белок; ЦМВ = цитомегаловирус. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы загрузить этот файл.
Быстро расширяющийся инструментарий вектора AAV стал одной из самых перспективных систем доставки генов для широкого спектра типов клеток с помощью различных путей введения. В этой работе мы стремились разработать улучшенный протокол для производства, очистки и характеристики мозаичных векторов rAAV, который мог бы доказать свою ценность в доклинических исследованиях. Для этой цели здесь описана генерация векторов мозаики rAAV1/2 и rAAV2/9, но процедура также может быть применена для очистки стандартных векторов rAAV2 (данные не показаны).
Мозаичные rAAV производили оптимизированным методом трансфекции с использованием PEI в качестве реагента для трансфекции. Метод транзиторной трансфекции был выбран из-за его большей гибкости и скорости, значительных преимуществ на ранних стадиях доклинических исследований. После того, как конкретный трансген и серотип были проверены, система производства может быть точно настроена для достижения лучшей масштабируемости и экономической эффективности путем создания стабильной трансфицированной клеточной линии, которая экспрессирует подмножество специфических генов Rep/Cap , с дополнительными генами, полученными в результате инфекционного процесса24. По сравнению с кальций-фосфатной трансфекцией ПЭИ имеет ряд преимуществ. Это стабильный и экономичный реагент для трансфекции, который эффективно работает в более широком диапазоне pH. Кроме того, он устраняет необходимость замены клеточной среды после трансфекции, что приводит к значительному снижению как затрат, так и рабочей нагрузки69.
В попытке обойти некоторые ограничения, налагаемые градиентами CsCl или йодиксанола, полученные rAAV собирали и очищали с помощью аффинной хроматографии. Эта стратегия предлагает упрощенный и масштабируемый подход, который может быть выполнен без необходимости ультрацентрифугирования и градиентов, что дает чистые и высокие титры вируса. Действительно, методы хроматографии с использованием системы FPLC могут быть автоматизированы и масштабированы за счет упаковки большего объема смолы в колонку с большей высотой слоя. Протокол, описанный в настоящем документе, может быть легко адаптирован для включения 5 мл столбцов HiTrap Heparin HP (данные не показаны). Кроме того, гепариновые колонки могут быть повторно использованы несколько раз, что способствует экономической эффективности этого метода.
Затем очищенные rAAV были охарактеризованы с точки зрения титра, чистоты, морфологических особенностей и биологической активности. Интересно, что при окрашивании синим цветом Кумасси полоса с примерно 17 кДа была обнаружена во фракциях F8-F16 в дополнение к трем типичным белкам вирусного капсида. Однако эта полоса больше не присутствует после стадии концентрации rAAV. Более того, некоторые слабые полосы с молекулярной массой ниже VP3 (<62 кДа) также могут быть обнаружены при мечении B1 и A69, что позволяет предположить, что они могут быть фрагментами капсидных белков VP1, VP2 и VP370. Другая возможность заключается в том, что на самом деле это другие коочищающие белки, такие как ферритин или другие клеточные белки с полипептидами, которые имеют схожие белковые отпечатки с белками капсида AAV и могут быть вовлечены в биологию AAV, как предполагалось ранее 26,71,72.
ПЭМ и анализ оглушения также выявили наличие пустых частиц на различных уровнях в различных производствах. Аналогичным образом, в других исследованиях ранее сообщалось о генерации вариабельных и высоких уровней (>65%) пустых капсидов для rAAV, приготовленных методами трансфекции или инфекции24,73. Механизм генерации rAAV начинается с быстрого образования пустых капсидов из вновь синтезированных белков VP, за которым следует медленный ограничивающий скорость этап упаковки генома в предварительно сформированные капсиды, опосредованный белками Rep74,75. Таким образом, пустые капсиды генерируются в продуктах rAAV, хотя соотношение пустых и полных капсидов может варьироваться в зависимости от размера и последовательности интересующего трансгена и условий культивирования клеток58,73. Пустые капсиды вызывают некоторые опасения, поскольку, не имея интересующего генома, они не могут обеспечить терапевтический эффект, а также потенциально могут усилить врожденный или адаптивный иммунный ответ. Однако некоторые отчеты также показали, что, регулируя их соотношение, пустые капсиды AAV могут служить высокоэффективной приманкой для специфических AAV-специфических нейтрализующих антител и, следовательно, увеличивать эффективность трансдукции 60,76,77. Если присутствие пустых капсидов является критически вредным и учитывая несколько меньший анионный характер пустых частиц по сравнению с полными векторами, потенциальное решение может включать проведение второго этапа полировочной очистки с использованием методов анионообменной хроматографии64.
Это исследование также предоставляет убедительные доказательства того, что сгенерированные мозаичные rAAV способны эффективно трансдуцировать не только культуры нейронов in vitro , но и ЦНС при внутричерепной инъекции rAAV1/2. В целом, эти результаты свидетельствуют о том, что описанный протокол производства и очистки делает высокочистые и биологически активные rAAV готовыми к использованию в течение 6 дней, представляя собой универсальный и экономически эффективный метод получения rAAV в доклинических исследованиях.
Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.
Мы благодарны за сотрудничество, идеи и техническую помощь, предоставленные доктором Моникой Зузарте из Института клинических и биомедицинских исследований Коимбры (iCBR) и Центра инновационной биомедицины и биотехнологии (CIBB) в отношении TEM-анализа rAAV. Мы выражаем признательность доктору Доминик Фернандес из Центра неврологии и клеточной биологии Университета Коимбры (CNC-UC) и Института междисциплинарных исследований Университета Коимбры (IIIUC) за ее неоценимую техническую помощь и идеи в отношении экспериментов с первичными культурами нейронов. Плазмиды pRV1, pH21 и pFdelta6, необходимые для этого исследования, были любезно предоставлены доктором Кристиной МакКлюр из Школы медицинских наук Колледжа наук о жизни и медицины Абердинского университета, за что мы благодарны. Эта работа финансировалась Европейским фондом регионального развития (ЕФРР) в рамках Региональной операционной программы Centro 2020; через COMPETE 2020 - Оперативную программу конкурентоспособности и интернационализации, и португальские национальные фонды через FCT - Fundação para a Ciência e a Tecnologia, в рамках проектов: UIDB/04539/2020, UIDP/04539/2020, LA/P/0058/2020, ViraVector (CENTRO-01-0145-FEDER-022095), Imagene (PTDC/BBB-NAN/0932/2014 | POCI-01-0145-FEDER-016807), ReSet - IDT-COP (CENTRO-01-0247-FEDER-070162), Борьба с Sars-CoV-2 (CENTRO-01-01D2-FEDER-000002), BDforMJD (CENTRO-01-0145-FEDER-181240), ModelPolyQ2.0 (CENTRO-01-0145-FEDER-181258), MJDEDIT (CENTRO-01-0145-FEDER-181266); Американо-португальским фондом биомедицинских исследований (APBRF) и Фондом исследований болезней Ричарда Чина и Лили Лок Мачадо-Джозефа, ARDAT в рамках соглашения о гранте IMI2 JU No 945473 при поддержке ЕС и EFPIA; GeneT - Teaming Project 101059981 поддерживается программой Европейского Союза Horizon Europe. M.M.L. был поддержан 2021.05776.BD; К.Х. был поддержан 2021.06939.BD; A.C.S. был поддержан 2020.07721.BD; и D.D.L. был поддержан 2020.09668.BD. Рисунок 1 был создан с использованием BioRender.com.
Name | Company | Catalog Number | Comments |
10% povidone-iodine | Medline | MDS093943 | |
12-well plates | Thermo Scientific | 11889684 | |
24-well plates | VWR | 734-2325 | |
4’,6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) | Invitrogen | D1306 | |
96-well Stunner plate | Unchained Labs | 701-2025 | 96-well quantification plate for the consecutive ultraviolet-visible light absorption, static light scattering, and dynamic light scattering analysis of rAAV samples |
AAVpro Titration Kit (for Real-Time PCR) Ver.2 | Takara | 6233 | For determining the titer of AAV using RT-qPCR. This kit contains DNase I, Lysis Buffer, Dilution Buffer, positive control, Taq II mix, primer forward, primer reverse, water |
Acetic acid glacial | Fisher Chemical | A/0360/PB17 | |
ÄKTA pure 25 | Cytiva | 29018224 | FPLC system controlled by UNICORN software, version 6.3 |
Alkaline phosphatase-linked goat anti-mouse | Invitrogen | 31328 | |
Amicon ultra-0.5 centrifugal filter unit | Merck Millipore | UFC5100 | |
Amicon ultra-15 centrifugal filter unit | Merck Millipore | UFC9100 | |
Benzonase Nuclease | Merck Millipore | E1014 | |
Bromophenol blue | Sigma-Aldrich | B0126 | |
CFX96 Real-Time PCR detection system | Biorad | 184-5096 | |
ChemiDoc Touch Imaging System | Bio-Rad Laboratories | 1708370 | |
Chicken polyclonal anti-GFP primary antibody | Abcam | ab13970 | |
Coomassie Blue G250 | Fisher Chemical | C/P541/46 | |
Dithiothreitol (DTT) | Fisher Bioreagents | BP17225 | |
DMEM | Sigma-Aldrich | D5796 | |
ECF Substrate for Western Blotting | Cytiva | RPN5785 | |
FastDigest SmaI | Thermo Scientific | FD0663 | |
FEI-Tecnai G2 Spirit Biotwin | FEI | Biotwin | Transmission electron microscope |
Fetal bovine serum | Biowest | S1810 | |
Fluorescence mounting medium | Dako | S3023 | |
Formvar-carbon coated 200 mesh grid | TAAB Laboratories Equipment | F077/025 | |
Gas evacuation apparatus | RWD | R546W | |
Glycerol | Fisher BioReagents | 10021083 | |
Goat polyclonal anti-chicken antibody, Alexa Fluor 488 | Invitrogen | A-11039 | |
Hamilton needle 30G, Small Hub RN Needle, 25 mm, PST3 | Hamilton | 7803-07 | |
Hamilton syringe (10 µL) | Hamilton | 7653-01 | |
HEK293T | American Type Culture Collection | CRL-11268 | |
HiTrap Heparin HP 1 x 5 mL | Cytiva | 17040701 | Pre-packed heparin column |
HiTrap Heparin HP 5 x 1 mL | Cytiva | 17040601 | Pre-packed heparin column |
Immobilon-P PVDF Membrane | Merck Millipore | IPVH00010 | |
Isoflurane | Braun | 469860 | |
Ketamine | Dechra Pharmaceuticals | N/A | Nimatek |
Low-retention microcentrifuge tubes (2 mL) | Fisher Scientific | 11906965 | |
Lunatic & Stunner Client software | Unchained Labs | N/A | Client analysis software version 8.0.1.235. Software for the consecutive ultraviolet-visible light absorption, static light scattering, and dynamic light scattering analysis of rAAV samples |
Methanol | Fisher Chemical | M/4000/FP21 | |
Mouse monoclonal anti-AAV, VP1, VP2 antibody (A69) | American Research Products | 03-61057 | |
Mouse monoclonal anti-AAV, VP1, VP2, VP3 antibody (B1) | American Research Products | 03-61058 | |
Neuro2a | American Type Culture Collection | CCL-131 | |
Normal goat serum | Gibco | 16210064 | |
NucleoBond Xtra Maxi EF | Macherey-Nagel | 12738422 | |
NZYColour Protein Marker II | NZYtech | MB09002 | |
pAAV-CMV-scGFP | Addgene | 32396 | Addgene plasmid # 32396; http://n2t.net/addgene:32396; RRID:Addgene_32396 |
pAAV-CMV-ssGFP | Addgene | 105530 | Addgene plasmid # 105530; http://n2t.net/addgene:105530; RRID:Addgene_105530 |
pAAV2/9n | Addgene | 112865 | Addgene plasmid # 112865; http://n2t.net/addgene:112865; RRID:Addgene_112865 |
Paraformaldehyde | Acros Organics | 10342243 | |
PBS | Fisher BioReagents | BP2438 | |
Penicillin-streptomycin | Gibco | 15140-122 | |
Pluronic F-68 Non-ionic Surfactant (100x) | Gibco | 24040032 | |
Polyethylenimine MAX, MW 40,000 | Polysciences Europe | 24765 | |
R500 Series Compact Small Animal Anesthesia Machine - Isoflurane | RWD | N/A | |
Sample Inlet Valve V9-IS | Cytiva | 29027746 | |
Sample pump P9-S | Cytiva | 29027745 | |
Sodium azide | Sigma-Aldrich | S2002 | |
Sodium chloride | Fisher Scientific | 10428420 | |
Sodium deoxycholate | Sigma-Aldrich | D6750 | |
Sodium dodecyl sulfate (SDS) | Fisher Bioreagents | BP166 | |
Sterile PVDF syringe filter | Fisher Scientific | 15191499 | |
Stunner Platform | Unchained Labs | 700-2002 | Equipment for the consecutive ultraviolet-visible light absorption, static light scattering, and dynamic light scattering analysis of rAAV samples |
Superloop 150 mL | Cytiva | 18-1023-85 | |
Superloop 50 mL | Cytiva | 18-1113-82 | |
SURE 2 supercompetent cells | Stratagene, Agilent Technologies | HPA200152 | |
Treated culture dishes | Corning | 734-1711 | |
Tris base | Fisher BioReagents | BP152 | |
Tris hydrochloride | Fisher BioReagents | BP153 | |
Triton X-100 | Sigma-Aldrich | T8787 | |
Trypsin-EDTA | Gibco | 25200-072 | |
Wheat Germ Agglutinin (WGA) conjugated with Alexa Fluor 633 | Invitrogen | W21404 | |
Xylazine | Dechra Pharmaceuticals | N/A | Sedaxylan |
Zeiss Axio Observer Z1 | Carl Zeiss Microscopy GmbH | N/A | Inverted fluorescence microscope equiped with an EC Plan-Neofluar 10x/0.30 objective and a Plan-Apochromat 40x/0.95 objective |
Zeiss Axio Scan.Z1 | Carl Zeiss Microscopy GmbH | N/A | Slide scanner fluorescence microscope equipped with a Plan-Apochromat 20x/0.8 objective |
Zeiss LSM 710 | Carl Zeiss Microscopy GmbH | N/A | Inverted confocal microscope equipped with a Plan-Apochromat 40x/1.4 Oil DIC objective |
µ-Slide 8 well Ibidi | Ibidi | 80826 | 8-well chamber slide |
Запросить разрешение на использование текста или рисунков этого JoVE статьи
Запросить разрешениеСмотреть дополнительные статьи
This article has been published
Video Coming Soon
Авторские права © 2025 MyJoVE Corporation. Все права защищены