La litière et la nidification limitées comme modèle d’adversité au début de la vie chez les souris

Résumé

Ce protocole décrit un modèle animal pour étudier comment l’adversité au début de la vie, provoquée par un environnement appauvri et des soins maternels imprévisibles pendant la période postnatale précoce, affecte le développement du cerveau et le risque futur de troubles mentaux.

Résumé

L’adversité au début de la vie, comme la maltraitance, la négligence, le manque de ressources et un environnement familial imprévisible, est un facteur de risque connu de développer des troubles neuropsychiatriques tels que la dépression. Des modèles animaux pour l’ELA ont été utilisés pour étudier l’impact du stress chronique sur le développement du cerveau, et reposent généralement sur la manipulation de la qualité et/ou de la quantité des soins maternels, car il s’agit de la principale source d’expériences précoces chez les mammifères, y compris les humains. Ici, un protocole détaillé pour l’utilisation du modèle de litière et de nidification limitées (LBN) chez la souris est fourni. Ce modèle imite un environnement à faibles ressources, qui provoque des modèles fragmentés et imprévisibles de soins maternels pendant une fenêtre de développement critique (jours postnatals 2 à 9) en limitant la quantité de matériaux de nidification donnés au barrage pour construire un nid pour ses petits et en séparant les souris de la litière via une plate-forme en filet dans la cage. Des données représentatives sont fournies pour illustrer les changements dans le comportement maternel, ainsi que la diminution du poids des petits et les changements à long terme des niveaux de corticostérone basale, qui résultent du modèle LBN. À l’âge adulte, il a été démontré que la progéniture élevée dans l’environnement LBN présente une réponse au stress aberrante, des déficits cognitifs et un comportement semblable à l’anhédonie. Par conséquent, ce modèle est un outil important pour définir comment la maturation des circuits cérébraux sensibles au stress est modifiée par l’ELA et entraîne des changements comportementaux à long terme qui confèrent une vulnérabilité aux troubles mentaux.

Introduction

Le début de la période postnatale est une fenêtre de développement critique au cours de laquelle les influences environnementales peuvent modifier la trajectoire du développement. Par exemple, l’adversité en début de vie (ELA) peut modifier le développement du cerveau pour provoquer des changements à long terme dans les fonctions cognitives et émotionnelles. Des exemples de PEA comprennent la violence physique ou psychologique, la négligence, l’insuffisance des ressources et un environnement familial imprévisible survenant pendant l’enfance ou l’adolescence¹. Il est connu que l’ELA est un facteur de risque de développer des troubles tels que la dépression, les troubles liés à l’utilisation de substances, le trouble de stress post-traumatique (SSPT) et l’anxiété 2,3,4,5. C’est important étant donné que les niveaux de pauvreté infantile aux États-Unis ont plus que doublé récemment, passant de 5,2 % en 2021 à 12,4 % en 2022⁶, et bien que la pauvreté elle-même ne soit pas nécessairement ELA, elle augmente la probabilité de divers types d’ELA⁷.

Les modèles animaux sont depuis longtemps essentiels pour comprendre les effets du stress précoce sur le développement du cerveau et les résultats à l’âge adulte. Les deux principaux modèles animaux utilisés ces dernières années pour disséquer ce phénomène sont la séparation maternelle (SEP) et un environnement appauvri induit par une litière et des matériaux de nidification limités (LBN). La SP a été développée comme un modèle de privation parentale⁸. Dans celui-ci, les mères rongeurs sont retirées de leurs petits, généralement pendant plusieurs heures, tous les jours jusqu’au sevrage⁸. Il a été constaté que le paradigme de la SEP entraîne des comportements dépressifs et anxieux à l’âge adulte⁹, ainsi qu’une réponse aberrante au stress chronique^10,11. D’autre part, le modèle LBN, développé pour la première fois dans le laboratoire Baram¹², ne sépare pas la mère des petits, mais modifie plutôt l’environnement dans lequel les petits sont élevés, imitant un environnement à faibles ressources^12,13. Dans ce modèle, la diminution de la quantité de matériaux de nidification et l’interdiction de l’accès direct à la litière entraînent une perturbation des soins maternels des mères³. Étant donné que des soins maternels robustes et prévisibles sont nécessaires au bon développement des circuits cérébraux cognitifs et émotionnels¹⁴, les soins maternels fragmentés de LBN peuvent entraîner une gamme de résultats, notamment un axe hypothalamo-hypophyso-surrénalien (HPA) hyperactif, un équilibre excitateur-inhibiteur modifié dans plusieurs régions du cerveau, une augmentation des niveaux d’hormone de libération de la corticotrophine (CRH) et un comportement dépressif chez la progéniture^13, 15,16,17,18,19.

Le mécanisme exact par lequel l’ELA entraîne un risque accru de troubles neuropsychiatriques n’est pas complètement compris. On pense qu’il est lié à des altérations des circuits de l’axe HPA^19,20, et des preuves récentes montrent que cela peut être causé par des changements dans l’élagage synaptique microglial¹⁹. Le modèle LBN s’est avéré être un outil crucial pour comprendre l’impact de l’environnement périnatal sur le développement du cerveau et les résultats comportementaux à long terme. Bien que ce modèle ait été initialement développé pour les rats, il a également été adapté pour les souris afin de tirer parti des outils transgéniques existants^12,13. Notamment, le modèle est très similaire dans les deux espèces et provoque des résultats très convergents, tels que des altérations de l’axe HPA, des déficits cognitifs et un comportement de type dépressif, mettant ainsi en évidence son utilité inter-espèces et son potentiel de traduction. Cet article fournira une description détaillée de la façon d’utiliser le modèle de litière et de nidification limitées chez la souris, en recueillant et en analysant le comportement maternel et les résultats de la progéniture pour valider l’efficacité du modèle et les résultats attendus.

Protocole

Toutes les procédures impliquant des animaux ont été effectuées conformément au Guide des National Institutes of Health pour le soin et l’utilisation des animaux de laboratoire, et approuvées par le Comité institutionnel de soin et d’utilisation des animaux de l’Université d’État de Géorgie (numéro d’approbation A24011). Les souris ont été élevées et maintenues dans les animaleries de l’Université d’État de Géorgie. Les expériences ont été réalisées sur une souche C57BL/6J pendant la période périnatale (jour postnatal [P] 2-10) et ont inclus des mâles et des femelles. Les réactifs et l’équipement utilisés pour cette étude sont énumérés dans la table des matériaux.

1. Configuration du matériel

1. Coupez le séparateur en maille en fonction des dimensions de la cage, en laissant un excédent de 3 cm sur les côtés les plus longs.
   REMARQUE : Le treillis fourni dans le tableau des matériaux est coupé par le fabricant.
2. Pliez les bords, y compris l’excédent, de manière à créer une plate-forme ajustée précisément aux bords de la cage et avec une hauteur de ~2,5 cm au-dessus du sol. Cela permettra à l’urine et aux excréments de passer à travers le séparateur de maille sans que les animaux puissent récupérer la litière des épis de maïs. Enfin, assurez-vous que toutes les arêtes vives sont repliées pour éviter tout dommage aux animaux.
   REMARQUE : Les séparateurs en maille sont réutilisables et doivent être soigneusement nettoyés entre les utilisations avec de l’eau chaude et du savon, suivi d’une pulvérisation d’éthanol à 70%.
3. Installez les appareils photo sur des trépieds et préparez le système d’enregistrement.
   REMARQUE : Il est recommandé d’utiliser un logiciel de gestion vidéo. Ces enregistrements génèrent des fichiers .mp4 qui sont automatiquement regroupés en segments de 1 h.
4. Ajustez les paramètres pour l’enregistrement continu.
   REMARQUE : Les paramètres supplémentaires recommandés sont une résolution de 1920 x 1080 et 30 images/s.
5. Réglez les fichiers .mp4 résultants à diviser en segments de 1 h si ce n’est pas fait automatiquement par un logiciel de gestion vidéo.
6. Si vous analysez la période d’extinction des feux, utilisez un éclairage infrarouge.
   REMARQUE : Pour réduire l’éblouissement de l’enregistrement sur le côté de la cage, il est recommandé de désactiver l’infrarouge (IR) de la caméra. Au lieu de cela, utilisez des projecteurs IR dans la pièce pendant l’enregistrement en phase sombre.

2. Paradigme de la litière et de la nidification limitées (LBN)

1. Associez 1 à 4 femelles avec un reproducteur mâle logé seul.
   REMARQUE : L’âge recommandé pour le premier accouplement chez les femelles expérimentales est P75. L’idéal est d’utiliser des femelles nullipares, mais dans des situations où cela n’est pas possible, comme avec des lignées de souris transgéniques précieuses, les femelles multipares peuvent continuer à se reproduire pendant environ quatre mois par la suite. Il est recommandé, bien que non obligatoire, de vérifier quotidiennement la présence de bouchons vaginaux pour confirmer le jour de l’accouplement (jour embryonnaire [E]0).
   1. Une fois que les mères sont enceintes, gardez les perturbations minimales.
      REMARQUE : Les femelles multipares peuvent généralement être réutilisées pour produire jusqu’à cinq portées avant que la fertilité ne diminue. Si les mères sont réutilisées pour l’expérience, elles doivent être utilisées de préférence pour la même condition à chaque fois ou seulement passer du contrôle au LBN, mais jamais l’inverse, afin d’éviter tout effet résiduel à long terme du LBN sur le barrage.
2. À E17 (ou si les bouchons n’ont pas été vérifiés, chaque fois que les femelles semblent manifestement enceintes), séparez les femelles dans leur propre cage en plexiglas standard et donnez-leur un nid en coton (5 x 5 cm) pour construire un nid.
   REMARQUE : Il est optimal de déplacer les femelles séparées dans une petite pièce calme, à l’écart de la pièce principale de la colonie, avec un cycle lumière/obscurité de 12 heures et un minimum de perturbations de la part du personnel pour la configuration du contrôle et du LBN.
3. Notez la date de naissance (vers E19).
4. À P2, comptez et sexez les petits. Attribuez au hasard les portées aux conditions LBN ou de contrôle (s’il s’agit de la première portée de la mère). Cette interaction avec les petits doit être terminée entre 1 et 4 h après l’allumage des lumières.
   1. Placez soigneusement les chiots dans une nouvelle cage propre pour qu’ils soient triés par sexe. La distance anogénitale entre l’anus et les organes génitaux est plus grande chez les hommes que chez les femmes et peut être utilisée comme identificateur.
   2. Séparez les mâles et les femelles en groupes pour les compter.
   3. Éliminez les portées de plus de 8 petits et jetez les portées de moins de 4 petits. La taille optimale de la portée est de 4 à 8 petits, car tout ce qui se trouve en dehors de cette plage peut interférer avec la distribution des soins maternels pendant l’étude.
      REMARQUE : Les variables qui peuvent être affectées en raison de la taille de la portée sont le poids des petits, les possibilités d’alimentation et les interactions mère-petit, ce qui pourrait fausser l’expérience. Idéalement, les souris ne seront pas croisées car elles ont moins de chances de survivre que les rats.
5. Configurez les conditions de contrôle et de LBN comme illustré à la Figure 1.
   1. Lutte : Utiliser une cage de boîte à chaussures de souris de taille standard (19,4 cm x 13,0 cm x 38,1 cm) avec ~220 g de litière d’épis de maïs (selon les dimensions de la cage, visant une hauteur de ~1 cm) et un nid carré en coton standard (5 x 5 cm).
      1. Pour aider les souris à s’acclimater à cet environnement inconnu, placez l’une de leurs boulettes fécales de leur ancienne cage dans chaque coin de la nouvelle cage. De plus, placez une petite quantité (de la taille d’une pièce de dix cents) de l’oisillon en coton usagé de la cage précédente sur le nouvel oisillon.
   2. LBN : Placez le séparateur en maille préalablement préparé dans une cage de boîte à chaussures standard avec ~110 g de litière d’épis de maïs (visant une hauteur de ~0,5 cm). Le grillage doit empêcher le contact direct entre les souris et la litière des épis de maïs.
      1. Enfin, ajoutez la moitié d’un carré de nid en coton (2,5 x 5 cm). Répétez toutes les étapes ci-dessus pour aider à l’acclimatation.
         REMARQUE : Il est recommandé de maintenir les cages de boîte à chaussures sur des supports standard non ventilés car il a été démontré que cette configuration est silencieuse et n’induit pas d’hypothermie chez les chiots élevés dans les cages LBN²¹. Cependant, ce n’est peut-être pas le cas avec l’augmentation du débit d’air dans les cages ventilées ; Par conséquent, les chercheurs doivent mesurer les niveaux de bruit et les températures centrales des petits dans leur système s’ils utilisent des cages ventilées.
6. Ajoutez les chiots dans leur cage désignée et placez-les sur le dessus du nid. Ensuite, placez la mère dans la cage face aux chiots, car cela l’aidera à remarquer plus rapidement qu’ils sont présents. Assurez-vous qu’il y a suffisamment de nourriture et d’eau pendant au moins 8 jours pour éviter de déranger la cage jusqu’à la fin de l’expérience à P10.
7. Placez un appareil photo sur un trépied devant la cage, ce qui permet d’avoir une vue latérale claire de la mère et de ses petits. En option, placez des miroirs autour de la cage pour mieux capturer tous les angles. Bien qu’il ne faille analyser que 1 heure d’enregistrement vidéo par jour, la caméra est configurée pour enregistrer en continu 24 heures sur 24 et 7 jours sur 7 pendant l’expérience afin de pouvoir surveiller les perturbations.
   REMARQUE : Les souris peuvent également être observées en personne et le comportement maternel peut être noté à la main, bien qu’il soit préférable d’enregistrer une vidéo pour éviter toute perturbation due à la présence de l’expérimentateur dans la pièce. Si des racks ventilés sont utilisés, il peut également être nécessaire d’utiliser une procédure différente de celle décrite ici pour disposer les caméras d’enregistrement des soins maternels.
8. Le matin du P10, remettez tous les animaux dans des conditions de cage standard (idéalement identiques à la condition de contrôle ci-dessus) et pesez les petits.
9. Traitez tous les chiots de la même manière et sevrez-les au P21 en groupes de 2 à 5 compagnons de portée du même sexe.
   REMARQUE : Essayez d’héberger des compagnons de portée de même sexe ensemble dans la mesure du possible, mais si nécessaire, hébergez ensemble des descendants de même sexe de différentes portées dans le même état. Il est recommandé d’éviter ensemble le contrôle du logement et la progéniture LBN (voir Yang et al. pour l’effet de la composition du compagnon de cage sur les phénotypes comportementaux²²).

Figure 1 : Exemple de configuration de cage. La cage du côté gauche de l’image montre une cage de contrôle standard (CTL) contenant une quantité complète de litière et un nid plein. La cage du côté droit montre une configuration de litière et de nidification limitée (LBN) avec la moitié de la quantité de litière, la moitié d’un nid et un séparateur en filet pour séparer les animaux de la litière. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

3. Score du comportement maternel

1. Bien que des enregistrements continus soient collectés dans cette configuration, n’analysez que 1 h de P3 à P6. Il est recommandé d’analyser les vidéos enregistrées au plus tôt 1 heure après le changement des lumières pour permettre l’accoutumance et d’analyser les vidéos à partir d’une heure constante chaque jour.
   REMARQUE : La période de P3 à P6 contient généralement les plus grandes différences dans les soins maternels dues au LBN ; Par conséquent, il n’est nécessaire d’analyser que ces jours. Le temps d’observation/d’enregistrement suggéré permet de capturer l’activité après le passage du cycle actif au cycle inactif ou vice versa. Cependant, la phase inactive est le moment où la mère est la plus susceptible de s’engager dans les soins maternels et il a déjà été démontré qu’elle contient les plus grandes différences de groupe dans le comportement maternel³.
   REMARQUE : Capturez les enregistrements P2 plus tard que les autres jours car les souris ont besoin d’au moins 1 h pour s’habituer au changement de cage. À moins qu’il ne s’agisse d’une variable d’intérêt, écartez ce jour de l’analyse.
2. Évaluez tous les comportements présentés dans le tableau 1. En règle générale, les comportements sont notés pendant les 50 premières minutes après le début de la collecte des données.
   REMARQUE : Cela peut être fait à la main ou électroniquement à l’aide du logiciel interactif de recherche sur l’observation comportementale (BORIS, un logiciel open source) ou d’un type de logiciel similaire. Les instructions ci-dessous concernent le marquage à la main et peuvent être adaptées au logiciel choisi.
3. Dans un tableau imprimé, notez le comportement observé à l’aide de l’abréviation, de l’heure de début et de la durée du combat, ainsi que des notes descriptives. Par exemple, si la mère allaite activement et quitte le nid mais que les petits sont toujours attachés à elle, notez-le comme AN, suivi de O. La description des chiots (et combien) encore attachés doit être conservée sous forme de note sur le côté au cas où cela serait nécessaire plus tard.
   REMARQUE : Tout comportement de moins de 3 s n’est pas analysé. Cette règle permet de filtrer les comportements momentanés dus à des perturbations extérieures, telles que le bruit environnemental. Une exception est faite lorsqu’il y a une interruption visible d’une crise d’AN (comme par un mouvement important ou un étirement) qui est rapidement reprise. Dans ce cas, le comportement noté est AN, suivi de N-AN, comme décrit dans le Tableau 1.
4. Dans le cas où plusieurs comportements se produisent en même temps, enregistrez le plus actif. Par exemple, si la mère est faible, mais commence plus tard à lécher et à toiletter, on note que les soins infirmiers sont faibles et que le comportement suivant doit être marqué comme LG avec une note indiquant que cela s’est produit pendant LN.

Type de comportement		Abréviation	Description
Léchage / toilettage		LG	La mère est engagée dans le léchage/toilettage de ses petits.
Soins infirmiers actifs		UN	La mère allaite ses petits debout, tandis que son dos est arqué.
Nouvelles soins infirmiers actifs		N-AN	Ce comportement est utilisé spécifiquement lorsque le barrage interrompt l’allaitement mais reprend rapidement. Il s’agit d’une exception à la règle des 3 secondes.
Faible taux d’allaitement		DANS	La mère allaite activement ses petits, mais son dos est bas ou presque plat. Ce comportement suit généralement l’AN après un certain temps.
Soins infirmiers latéraux		SN	La digue est couchée sur le côté pendant l’allaitement (également connu sous le nom d’allaitement passif).
Hors du nid		O	La mère n’est pas sur le nid et elle ne mange ni ne boit. Cela peut être observé lorsqu’elle se promène dans la cage ou qu’elle explore.
Manger/boire		E	Le barrage est à l’extérieur du nid en train de manger ou de boire.
Auto-toilettage		SG	La mère se toilette.
Transporter des chiots		C	La mère porte les petits, généralement pour les ramener au nid.
Construction du nid		NB	Le barrage est en train de construire ou de déplacer activement le nid.
Déplacer sur le nid		M	Le barrage se déplace sur le nid. Cela se présente avec la mère interagissant avec les chiots d’une manière différente de LG ou de tout type d’allaitement, comme renifler, élever ou marcher sur les chiots.

Tableau 1 : Description des comportements en matière de soins maternels.

4. Analyse des données sur le comportement maternel

1. Compilez les résultats de la notation dans une feuille de calcul.
2. Si les vidéos ont été analysées électroniquement, supprimez les comportements dont les épisodes sont inférieurs à 3 s, comme décrit à l’étape 3.
3. Calculez la durée moyenne des épisodes, la fréquence moyenne et la durée totale du léchage et du toilettage pour chaque jour d’observation.
   REMARQUE : Des statistiques descriptives peuvent être effectuées sur n’importe lequel des comportements notés, mais le léchage et le toilettage présenteront généralement les perturbations les plus évidentes en termes de fragmentation par LBN (c’est-à-dire des épisodes plus courts et plus fréquents). Ces variables peuvent être analysées comme une moyenne sur P3-P6, ou comme des mesures répétées par jour pour rechercher tout changement au fil du temps si cela vous intéresse.

5. Calcul de l’entropie

REMARQUE : L’entropie, ou l’imprévisibilité, des comportements de soins maternels est calculée sur la base de la méthode proposée par Vegetabile et ^al.23. Cette méthode est basée sur l’hypothèse que les comportements de soins maternels agissent comme une chaîne de Markov, qui peut être utilisée pour estimer le taux d’entropie d’une séquence comportementale. La séquence de comportements de chaque barrage est caractérisée à l’aide de la matrice de transition empirique ij> _{i,j = 1... 7} des probabilités conditionnelles de passer d’un comportement (i) à un autre comportement (j), et le taux d’entropie est calculé à partir de cela comme décrit précédemment ^3,23 et comme suit :

où P_ij est la probabilité conditionnelle que le comportement J soit observé après qu’un DAM soit observé en train d’exécuter le comportement I, π_i est la fréquence à laquelle le comportement I est observé, et M (=7) est le nombre total de comportements différents. Le lecteur est invité à se reporter à Vegetabile et ^al.23 pour une discussion des fondements théoriques des équations ; ici, l’accent est mis sur la manière d’appliquer la méthode dans le modèle LBN.

1. Pour ce faire, organisez le format requis pour l’analyse.
   1. Combinez AN, LN, SN et N-AN en une seule variable nommée N en additionnant les heures, car elles impliquent toutes des soins infirmiers.
      REMARQUE : Reportez-vous au tableau 1 pour la description des comportements en matière de soins maternels.
   2. Ajoutez les comportements qui ne sont pas liés aux comportements auto-dirigés ou dirigés vers le chiot (M et O) dans O.
   3. Entrez LG, E, SG, C et NB séparément pour obtenir 7 comportements au total.
2. Créez une feuille de calcul avec des colonnes dans l’ordre suivant : ID de souris, ID de portée, # de portée, Traitement, Jour, Heure, Comportement et État.
   1. Dans l’ID de la souris, ajoutez la ligne/le génotype de la souris de la mère.
   2. Dans l’identification de la portée, utilisez l’identifiant de la mère suivi du numéro de portée.
   3. Dans la portée #, indiquez le nombre de portées que la mère a eues.
   4. S’assurer que le traitement est LBN ou Contrôle, selon les conditions dans lesquelles les animaux ont été placés.
   5. Indiquez le jour comme le jour postnatal correspondant analysé.
   6. Indiquez l’heure comme horodatage dans la vidéo lorsque le comportement a commencé et s’est terminé (par rapport au début de l’enregistrement).
   7. Sélectionnez le comportement parmi les sept décrits précédemment (N, O, LG, E, SG, C et NB) (Tableau 1).
   8. Marquez les deux types d’états, START et STOP. Par conséquent, chaque comportement apparaîtra deux fois ; La première notation marque le début, et la seconde marque la fin.
3. En suivant ce format, incluez les informations de tous les jours analysés.
4. Dans l’environnement R, importez les jeux de données qui ont été formatés comme ci-dessus.
5. Installez les paquets disponibles à l’https://github.com/bvegetabile/entropyRate.
   REMARQUE : L’exécution de ce code génère un dossier nommé LBN ; Quelle que soit la condition, ce dossier contient l’entropie calculée. De plus, l’entropie de chaque jour peut ensuite être moyennée par le sujet pour P3-P6 et comparée entre les conditions.

Résultats

Les résultats représentatifs démontrent comment l’ELA, imposée par un environnement appauvri dans les cages LBN, affecte les soins maternels des mères et des résultats physiologiques de la progéniture. L’entropie quotidienne dans le comportement de soins maternels est plus élevée chez les LBN d’un jour à l’autre des jours P3-P6 (F_1,58 = 7,21, p = 0,0094 ; Figure 2A), ainsi que l’entropie moyenne de chaque barrage pour cette période (t₁₅ = 3...

Discussion

Cet article fournit un protocole détaillé pour appliquer le modèle LBN chez la souris. Ce modèle est un outil important pour comprendre comment une forme de stress chronique pertinente sur le plan éthologique et translationnel au début de la vie contribue au développement de troubles neuropsychiatriques chez la progéniture¹³. Il est également utile pour étudier le comportement maternel et tout changement dans le cerveau des mères d’un point de vue moléculaire, neuroendocrinien ou bas...

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