Analyse GC-MS de l’enrichissement en deutérium du rétinol dans le sérum et estimation des réserves totales de vitamine A pour l’organisme

Résumé

Cette méthode consiste à extraire le rétinol du sérum, à le séparer à l’aide de la CLHP et à déterminer les isotopes du rétinol marqués et non marqués à l’aide de la GC-MS. Le rapport entre le rétinol étiqueté et le rétinol non étiqueté est utilisé pour estimer les réserves totales de vitamine A du corps.

Résumé

Cette méthode décrit la détermination de l’enrichissement en deutérium du rétinol dans le sérum et l’estimation des réserves de vitamine A dans l’organisme. Le procédé consiste à extraire le rétinol de 0,4 mL de sérum à l’aide de 0,5 mL de solution saline à 0,85 %, de 100 μL de solution étalon interne et de 5 mL de solution de chloroforme-méthanol (2:1 v/v). Après centrifugation et élimination de la couche inférieure de chloroforme, le mélange est séché sous l’azote et remis en suspension dans 0,1 mL d’éthanol, et la fraction de rétinol est séparée des autres constituants à l’aide d’un système HPLC équipé d’une colonne PE C18. La fraction de rétinol peut être collectée manuellement ou à l’aide d’un collecteur de fractions. Par la suite, la fraction de rétinol est séchée sous azote et dérivée avec de l’O-bis(triméthylsilyl)trifluoroacétamide (BSTFA) contenant 10 % de triméthylchlorosilane. Enfin, les isotopes du rétinol marqués et non marqués sont quantifiés à l’aide d’un système GC-MS équipé d’une colonne capillaire de méthylsiloxane 19091z-431 HP-1, utilisant une ionisation chimique négative par capture d’électrons avec de l’hélium comme gaz porteur et du méthane comme agent d’ionisation. Le rapport entre le rétinol étiqueté et le rétinol non étiqueté est ensuite utilisé dans les équations d’Olson, de Green ou du bilan massique pour estimer les réserves de vitamine A.

Introduction

La vitamine A est un nutriment essentiel nécessaire au système visuel et au maintien de la fonction cellulaire pour la croissance, l’intégrité épithéliale, la production de globules rouges, l’immunité et la reproduction¹. La carence en vitamine A est un grave problème de santé publique dans le monde entier, affectant plus de 100 pays. Elle touche de manière disproportionnée les jeunes enfants et les femmes enceintes dans les pays à faible revenu. Environ 190 millions d’enfants dans le monde souffrent d’une carence en vitamine A, ce qui en fait un problème critique pour la santé publique et le développement de l’enfant².

En réponse à cette situation, plusieurs programmes, notamment la supplémentation en vitamine A avec distribution semestrielle de fortes doses de vitamine A aux enfants de moins de 5 ans et l’enrichissement en vitamine A de certains produits alimentaires, ont été mis en œuvre depuis des décennies dans de nombreux pays à faible revenu. Cependant, ces interventions se chevauchent souvent, exposant certaines populations à un apport chronique excessif en vitamine A par inadvertance ^3,4. Ce double risque de carence et d’excès souligne la nécessité de disposer d’un biomarqueur capable d’évaluer avec précision le statut en vitamine A sur l’ensemble du spectre, de la carence à la toxicité, afin d’orienter l’évaluation du programme.

Les biomarqueurs de la vitamine A sont essentiels pour évaluer l’état nutritionnel. Les biomarqueurs les plus couramment utilisés sont les concentrations sériques de rétinol et de protéine de liaison au rétinol (RBP). Cependant, il est important de noter que ces biomarqueurs peuvent être temporairement supprimés par les infections et l’inflammation, ce qui peut réduire la spécificité des évaluations de la vitamine A dans certaines populations ^5,6,7.

Alors que les échantillons de biopsie ou d’autopsie du foie sont considérés comme l’étalon-or pour évaluer le statut en vitamine A, l’indicateur indirect le plus sensible des réserves totales de vitamine A du foie est la méthode de dilution isotopique du rétinol (RID)⁸. Le RID fournit une estimation quantitative de l’état de la vitamine A sur l’ensemble du spectre, allant des réserves déficientes aux réserves excessives⁹. Dans la plupart des applications de recherche, la méthode RID consiste à administrer une dose orale de deutérium (²H) ou d’acétate de rétinyle marqué au ¹³C, qui se mélange ensuite aux réserves corporelles sur une période de 14 à 21 jours. Après cette période, un échantillon de sang est prélevé et le sérum est stocké à -80 °C. Le rapport entre le rétinol marqué et le rétinol total est ensuite analysé à l’aide de la spectrométrie de masse pour estimer les réserves de vitamine A¹⁰, en utilisant l’équation^{d’Olson 11}, l’équation du bilan massique¹² ou l’équation de Green¹³. Le protocole présenté dans cet article est valable pour l’administration d’acétate de rétinyle marqué au deutérium (²H) ou ^{au 13}C et est basé sur les travaux de Tang et al.14. L’objectif global de cette méthode est d’évaluer et de surveiller avec précision le statut de la vitamine A dans le corps¹¹. Il s’agit d’une méthode puissante qui fournit une estimation quantitative des concentrations de vitamine A à travers un large éventail de statuts, de la carence à l’excès^{de 15}. Elle est plus exacte et plus précise que les autres méthodes, qui reposent souvent sur des mesures indirectes⁹.

Protocole

Le protocole a été approuvé par la Commission d’éthique du ministère de la Santé publique (n° 2015/02/550/CE/CNERSH/SP), et le consentement éclairé a été obtenu des parents/tuteurs.

REMARQUE : Parce que la vitamine A est sensible à la lumière, il est crucial que toutes les procédures soient effectuées dans la pénombre ou sous un éclairage fluorescent doré¹⁶. Les matériaux utilisés sont détaillés dans la table des matériaux.

1. Préparation des réactifs

1. Chlorure de sodium (0,85 % p/v) : Dissoudre 0,85 g de NaCl dans de l’eau distillée dans une fiole jaugée de 100 mL. Remplissez jusqu’à la graduation avec de l’eau distillée et mélangez.
2. Chloroforme-méthanol (2:1 v/v) : Transvaser 300 mL de chloroforme dans une fiole jaugée de 500 mL à l’aide d’un cylindre mesureur. Ajouter 150 ml de méthanol et mélanger.
3. Phase A mobile pour HPLC : Acétonitrile/Tétrahydrofurane/eau ultrapure (50/20/30, v/v/v) : Transférer 500 mL d’acétonitrile dans une fiole jaugée de 1000 mL. Ajouter 200 mL de tétrahydrofurane et 300 mL d’eau. Mélangez la solution, filtrez-la à l’aide d’un filtre à membrane avec une taille de pores de 0,45 μm et du sonicate (amplitude 100 %, fréquence 40 kHz et durée 15 min).
4. Phase B mobile pour HPLC : Acétonitrile/Tétrahydrofurane/eau ultrapure (50/44/6, v/v/v) : Transférer 500 mL d’acétonitrile dans une fiole jaugée de 1000 mL. Ajouter 440 ml de tétrahydrofurane et 60 ml d’eau. Mélangez la solution, filtrez-la à l’aide d’un filtre à membrane avec une taille de pores de 0,45 μm et soniquez.

2. Préparation des solutions étalons

1. Préparez la solution mère en dissolvant 40 mg de l’étalon dans de l’éthanol dans une fiole jaugée de 100 ml, comme l’illustre le tableau 1. Remplissez jusqu’à la graduation avec le solvant et mélangez soigneusement.
2. Solutions mères diluées : Préparez la solution mère diluée en transférant 1 mL de la solution mère dans une fiole jaugée de 50 mL, comme l’indique le tableau 2. Remplissez jusqu’à la marque de graduation avec le solvant approprié et mélangez soigneusement.
3. Détermination de la concentration des solutions mères diluées : Placer une aliquote (1 mL) de la solution diluée dans un tube de quartz et mesurer son absorbance dans le spectrophotomètre à la longueur d’onde spécifiée (tableau 3) en utilisant de l’éthanol comme blanc. Calculez le à l’aide de la loi Lambert-Beer¹⁷. Assurez-vous que le spectrophotomètre est étalonné avant l’analyse en réchauffant l’instrument pendant 15 à 30 minutes, en sélectionnant la longueur d’onde souhaitée et en mettant l’instrument à zéro en plaçant le blanc dans le porte-échantillon. Calculez la concentration à l’aide de la formule suivante :
   Concentration = (absorbance/coefficient d’absorption) x 10⁶ (μg/dL)
   REMARQUE : Pour convertir les valeurs des unités conventionnelles (μg/dL) en unités S.I. (μmol/L), multipliez la valeur conventionnelle par les facteurs de conversion suivants : 0,0304 pour l’acétate de rétinyle et 0,0349 pour le rétinol¹⁸.
4. Préparation des étalons de travail : À l’aide d’une pipette volumétrique, transvaser 2 mL des solutions mères diluées dans une fiole conique de 100 mL. Remplissez le ballon jusqu’à la graduation avec de l’éthanol, mélangez bien et fermez avec un bouchon.
   1. Pour déterminer la concentration exacte de chaque solution, évaluez la pureté de chaque composant à l’aide d’une HPLC équipée d’une colonne C18 et d’un détecteur à barrettes de diodes réglé sur 340 nm. Programmez la pompe pour qu’elle utilise la phase mobile A et la phase mobile B selon le calendrier indiqué dans le tableau 4. Assurez-vous que le système HPLC est calibré avant l’analyse en validant les différents composants tels que la pompe, le détecteur, l’échantillonneur automatique et les performances de l’ensemble du système.
   2. Transférez 1 mL des solutions mères diluées dans des flacons à sertir et injectez les échantillons dans le système HPLC selon la procédure normale. Déterminez la pureté à l’aide de l’équation suivante :
      
      ÉQUATION 1
      Avec cette correction de pureté, calculez la concentration exacte des différents composants dans la solution étalon.
5. Préparation de l’étalon interne (acétate de rétinyle DO ~ 0,2) : À l’aide d’une pipette volumétrique, transvaser 30 ml de l’étalon de travail en acétate de rétinyle dans une fiole conique de 100 ml. Remplissez le ballon jusqu’à la graduation avec de l’éthanol, mélangez bien et fermez avec un bouchon.
6. Préparation des solutions de travail : Ajouter 20 μg de rétinol non étiqueté à 10,00, 3,33, 1,00, 0,33 et 0,00 μg de rétinol étiqueté pour obtenir des rapports de rétinol étiqueté et non étiqueté de 0,500, 0,167, 0,050, 0,0167 et 0,00.

3. Analyse de l’échantillon

REMARQUE : Les échantillons de sérum utilisés dans cette étude ont été prélevés le 14^e jour chez des enfants ayant reçu une dose orale (2 mg d’équivalents rétinol) de D8-rétinol dans le cadre d’une étude conçue pour surveiller et évaluer le statut en vitamine A des enfants au Cameroun.

1. Extraction de rétinoïdes dans le sérum : Cette extraction est basée sur les travaux de Folch et ^al.19 tels que modifiés par Tang et ^al.14. Suivez les étapes décrites ci-dessous.
   1. Laisser décongeler doucement les échantillons de sérum congelés à température ambiante (20-25 °C) avant l’analyse. Aliquote 400 μL de sérum dans un tube de culture jetable de 16 x 100 mm. Ajouter 500 μL de solution saline à 0,85 %, 100 μL d’étalon interne et 5 mL de solution de chloroforme-méthanol (2:1 v/v).
   2. Vortex pendant 30 s et centrifugeuse à 1157 x g pendant 10 min à 4 °C. À l’aide d’une pipette Pasteur en verre, prélever délicatement la couche inférieure du chloroforme dans un tube de culture jetable de 13 x 100 mm. Sécher sous azote gazeux dans un bain-marie (40 °C) et remettre en suspension le résidu dans 100 μL d’éthanol. Vortex et sonicate pendant 30 s. Transférez l’échantillon dans un flacon à sertir avec un insert, fermez le puits et étiquetez. L’échantillon est prêt pour la collecte de rétinol HPLC.
2. Effectuez la collecte de rétinol HPLC comme décrit ci-dessous.
   1. Injectez 70 μL de chaque échantillon de sérum dans un système HPLC équipé d’une colonne C18 et d’un détecteur à barrettes de diodes réglé à 340 nm. Programmez la pompe pour qu’elle fournisse les phases mobiles A et B à un débit constant de 1 mL/min, en suivant le calendrier indiqué dans le tableau 4.
   2. Avant d’injecter les échantillons de sérum, injectez 70 μL de la solution de travail de rétinol dans le système HPLC et enregistrez le temps de rétention du pic de rétinol. Ensuite, installez le collecteur de fractions pour recueillir la fraction de rétinol éluée dans une plage spécifiée dans un tube de 5 mL avec un bouchon en verre rodé. Dans ce cas, la fraction de rétinol a été collectée sur un intervalle de 3 minutes, de 7,5 à 10,5 minutes.
      REMARQUE : La concentration de rétinol peut également être calculée au cours de cette étape à l’aide d’une courbe d’étalonnage des étalons de rétinol et du taux de récupération obtenu à partir de l’étalon interne.
3. Effectuez la dérivation du rétinol comme décrit ci-dessous.
   1. Faites sécher la fraction de rétinol recueillie par HPLC sous azote gazeux dans un bain-marie à 40 °C pendant au moins 3 h. Ajouter de l’éthanol pour faciliter l’évaporation de l’humidité pendant le séchage (les échantillons doivent être complètement secs, car la dérivation est sensible à l’humidité). Ajouter 20 μL de BSTFA avec 10 % de TMCS dans le tube.
   2. Placez le tube dans un chauffe-moteur sec réglé à 70 °C et incubez pendant 30 min. À l’aide d’une pipette Pasteur en verre, transférez le mélange réactionnel dans un flacon à sertir avec un insert, fermez hermétiquement avec un capuchon à sertir à l’aide d’une pince à sertir et étiquetez. L’échantillon est maintenant prêt pour l’analyse GC/MS et peut être stocké dans un dessiccateur à 4 °C jusqu’à l’analyse.
   3. De plus, séchez un ensemble de 100 μL de solutions étalons de travail et dérivez comme décrit ci-dessus pour calibrer la GC/MS.
      REMARQUE : La dérivation du rétinol à l’aide de BSTFA implique une réaction chimique où le groupe hydroxyle (-OH) du rétinol est remplacé par le groupe triméthylsilyle (-Si(CH₃)₃), formant ainsi du rétinyl triméthylsilyl éther. Ce processus améliore la volatilité et la stabilité du rétinol, ce qui le rend plus adapté à l’analyse GC/MS²⁰.
4. Analyse GC/MS : L’analyse GC/MS est effectuée à l’aide de la procédure décrite par Tang et ^al.14. Suivez les étapes décrites ci-dessous.
   1. Injecter 3 μL de l’échantillon de rétinol dérivé à l’aide d’un échantillonneur automatique dans le GC avec un injecteur froid sur colonne connecté par un connecteur à volume mort zéro à une colonne capillaire en silice fondue de 15 m x 0,25 mm de diamètre intérieur recouverte d’une phase stationnaire DB-1 d’une épaisseur de film de 0,25 μm.
   2. Programmez les températures du four à colonne et de l’injecteur sur colonne pour qu’elles passent de 50 °C à 285 °C à une vitesse de 15 °C/min, et réglez la température de l’interface GC/MS à 285 °C. Utilisez l’hélium comme gaz porteur pour éluer le dérivé triméthylsilyle du rétinol pendant environ 12 minutes.
   3. Détectez l’éluat de GC à l’aide d’un spectromètre de masse quadripolaire à l’aide d’une ionisation chimique d’ions négatifs de méthane de 0,5 torr, avec la température de la source d’ions réglée à 150 °C. Réglez le spectromètre de masse pour qu’il scanne entre 260 et 280 daltons.

4. Analyse des données

1. Utilisez le logiciel d’analyse de données GC/MS.
2. Extrayez tous les ions souhaités en fonction de leur rapport masse/charge (m/z), intégrez la surface du pic (utilisez l’intégration manuelle pour ajuster les points de début et de fin du pic) et transférez les résultats dans un fichier de tableur.
   REMARQUE : Selon l’isotope utilisé, les ions souhaités seront les suivants : 268-270 m/z pour le rétinol natif ; 271-274 m/z pour le [²H₄]-rétinol ; 278-280 m/z pour le [¹³C]-rétinol ; et 276-280 m/z pour le [²H₈]-rétinol.
3. Calculez la somme des pics pour le rétinol marqué (ΣD) en ajoutant l’aire des pics à m/z 274, 275, 276, 277 et 278. Calculez la somme des pics pour le rétinol non marqué (ΣH) en ajoutant l’aire des pics à m/z 268, 269 et 270.
4. Calculez l’enrichissement en rétinol marqué (D) à l’aide de l’équation suivante : D = ΣD/(ΣH + ΣD). Calculez la quantité de rétinol non étiqueté (H) à l’aide de l’équation suivante : H = 1 - D.
   REMARQUE : La spectrométrie de masse par chromatographie en phase gazeuse à ionisation chimique négative de l’éther de rétinyle triméthylsilyle ne donne pas d’ion moléculaire mais un ion fragment majeur à m/z 268 à 271 pour le rétinol non marqué, à m/z 272 à 275 pour le D4-rétinol et à m/z 276 à 280 pour le D8-rétinol¹⁴.
5. Pour contrôler le système, calculez une équation de régression linéaire entre les rapports de poids des étalons d’étalonnage et les zones intégrées pour le rétinol marqué et le rétinol non marqué.

5. Estimation des réserves de vitamine A

REMARQUE : Cette étape permet d’évaluer le statut en vitamine A d’un individu.

1. Calculer les réserves totales de vitamine A dans le foie à l’aide de l’équation^{d’Olson 11}
   Vitamine A Réserves totales du foie = F x Dose x [S x a x (H/D - 1)]
   où F est un facteur de l’efficacité de l’absorption et du stockage de la dose administrée par voie orale (F = 0,50), La dose est la quantité de vitamine A marquée administrée par voie orale (μmol), S est un facteur qui corrige l’inégalité du rapport plasma/foie du rétinol marqué au rétinol non marqué (S = 0,65), a est un facteur qui corrige la perte irréversible de vitamine A marquée pendant la période de mélange ; Plus précisément, a = ^E-kt, où k est le taux catabolique fractionnel estimé du système (k = LN 2/32 jours pour les enfants), et t est le temps, exprimé en jours depuis la dose ; D/H est le rapport isotopique sérique du rétinol marqué et du rétinol non marqué, -1 corrige la contribution de la dose de vitamine A marquée au pool de vitamine A du corps entier.
2. Pour calculer les réserves totales de vitamine A (TBS), utilisez l’équation de Green¹³
   SCT = Fa × S × (1/SAp)
   où Fa est la fraction de la dose de VA marquée par voie orale absorbée et trouvée dans les réserves interchangeables de l’organisme au temps t, et S est le rapport entre l’activité spécifique du rétinol dans le sérum et celle dans les réserves au temps t (pour les enfants, Fa × S = 0,642 à 14 jours)²¹. SAp est la fraction de la dose sérique par dose molaire (c.-à-d. [rétinol marqué] / ([rétinol non marqué + rétinol marqué] dans le sérum) / dose orale de rétinol marqué (μmol)).

Résultats

L’injection de 3 μL d’un échantillon dérivé d’une solution séchée contenant environ 50 pM/μL d’étalons (rétinol et D 8-rétinol) dans la GC/MS n’a révélé aucun ion moléculaire mais a montré un ion fragmentaire majeur à m/z 268 pour le rétinol (figure 1) et à m/z 278 pour le D_8-rétinol (figure 2). Cela indique que les ions moléculaires du rétinyltriméthylsilyléther formés, formés lors de la dérivation du rétinol et du D 8-rétinol, ne sont pas stables dans les conditions d’ionisation utilisées en GC/MS. Ils se décomposent en fragments plus petits, principalement par clivage alpha. Ce modèle de fragmentation commun implique la rupture de la liaison adjacente au groupe triméthylsilyléther. Le clivage alpha entraîne la perte du groupe triméthylsilyle (TMS, qui a une masse de 73 Da) et d’un atome d’hydrogène, conduisant à un ion fragmentaire d’une masse de 268 Da pour le rétinol et de 278 Da pour le D 8-rétinol²². Ce mécanisme permet d’identifier et de confirmer la présence de rétinol et de ses dérivés dans l’échantillon en analysant les ions de fragments spécifiques produits lors de la spectrométrie de masse. L’injection de mélanges de rétinol et de D8-rétinol a montré deux ions fragments majeurs à m/z 268 pour le rétinol et m/z 276 pour le D8-rétinol (Figure 3), indiquant la présence de ces composés dans l’échantillon. La courbe d’étalonnage a montré une excellente linéarité, comme l’indique un coefficient de corrélation élevé (Figure 4), montrant que la relation entre le rapport de crête et le rapport de poids a un modèle très droit et prévisible.

La réponse GC/MS obtenue à partir des injections d’échantillons de sérum (sérum d’enfants ayant reçu une dose orale de 2 mg d’équivalents rétinol de D8-rétinol ; Graphique 5) montre la présence de rétinol et de D8-rétinol, les deux principaux ions fragmentaires étant observés à m/z 268 et m/z 274. Les résultats obtenus après extraction des ions et intégration des zones de pics à m/z 274, 275, 276, 277 et 278 pour le D8-rétinol et à m/z 268, 269 et 270 pour le rétinol non marqué sont présentés dans le tableau 5. Ces résultats sont à intégrer dans l’équation^{d’Olson 11} ou l’équation de Green¹³ pour calculer les réserves de vitamine A dans l’organisme.

La technique de dilution des isotopes stables permet de mesurer les niveaux de vitamine A qui ne peuvent pas être obtenus par d’autres méthodes, ce qui permet d’évaluer avec précision le statut de la vitamine A. Cette méthode est précieuse pour les études nutritionnelles, les diagnostics cliniques et la recherche épidémiologique.

Figure 1 : Chromatogramme et spectre de masse du rétinol. La figure montre le chromatogramme de chromatographie en phase gazeuse/capture d’électrons de méthane par ionisation chimique négative et spectrométrie de masse (panneau supérieur) à partir de l’analyse de l’étalon de rétinol dérivé. Le panneau inférieur est un spectre de masse montrant m/z 268 pour le rétinol. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Figure 2 : Chromatogramme et spectre de masse du D8-rétinol. La figure montre le chromatogramme de chromatographie en phase gazeuse/capture d’électrons de méthane par ionisation chimique négative et spectrométrie de masse (panneau du haut) à partir de l’analyse de l’étalon de rétinol D8 dérivé. Le panneau inférieur est un spectre de masse montrant m/z 278 pour le D8-rétinol. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Figure 3 : Chromatogramme et spectre de masse d’un mélange de rétinol et de D8-rétinol. La figure montre le chromatogramme de chromatographie en phase gazeuse/capture d’électrons de méthane par ionisation chimique négative et spectrométrie de masse (panneau du haut) à partir de l’analyse d’un mélange dérivé d’étalons de rétinol et de D8-rétinol. Le panneau inférieur est un spectre de masse montrant m/z 268 pour le rétinol et m/z 276 pour le D8-rétinol. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Figure 4 : Courbe d’étalonnage. Cette figure illustre la relation entre la réponse GC/MS et la concentration de rétinol non marqué et marqué. Il est décrit par l’équation y = 9,8379x + 0,7019, où y (les rapports de surface) représente la réponse de l’instrument, 9,8379 est la sensibilité, x (les rapports de poids) représente la concentration de l’analyte et 0,7019 est le signal de fond. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Figure 5 : Chromatogramme et spectre de masse de l’échantillon de sérum. Cette figure illustre la chromatographie par chromatographie en phase gazeuse/capture d’électrons de méthane, chromatogramme négatif par ionisation chimique-spectrométrie de masse (panneau du haut) à partir de l’analyse de la fraction de rétinol dérivé du sérum. Le panneau inférieur est un spectre de masse montrant m/z 274 pour le D8-rétinol. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Standard	Poids (mg)	Fiole jaugée (mL)	Solvant
Rétinol	40	100	Éthanol
Acétate de rétinyle	40	100	Éthanol
Acétate de rétinyle marqué au deutérium	40	100	Éthanol

Tableau 1 : Préparation de la solution mère. Ce tableau montre comment préparer des solutions concentrées de rétinol et d’acétate de rétinyle marqué au deutérium, qui peuvent ensuite être diluées à des concentrations plus faibles pour de futures expériences.

Standard	Solution mère (mL)	Fiole jaugée (mL)	Solvant
Rétinol	1	50	Éthanol
Acétate de rétinyle	1	50	Éthanol
Acétate de rétinyle marqué au deutérium	1	50	Éthanol

Tableau 2 : Préparation des solutions mères diluées. Ce tableau montre comment préparer des solutions prêtes à l’emploi de rétinol et d’acétate de rétinyle marqué au deutérium.

Standard	Longueur d’onde (nm)	E1%1 cm
Rétinol	325	1850
Acétate de rétinyle	326	1550

Tableau 3 : Longueur d’onde et E1 % 1 cm (coefficient d’absorption).

Temps (min)	Débit (mL/min)	Phase A mobile ( %)	Phase B mobile ( %)
0 – 6	1	100	0
6 – 13	1	100 → 50	0 → 50
13 - 18	1	50	50
18 - 20	1	50 → 0	50 → 100
20 - 28	1	0	100
28 - 29	1	0 → 100	100 → 0

Tableau 4 : Calendrier des phases mobiles HPLC. Ce tableau illustre la séquence et la durée prévues des différentes phases au cours de l’exécution chromatographique HPLC.

	SH	SD	D	H
Sujet 1	64030809	566089.7	0.008763	0.991237
Sujet 2	194354	43861.39	0.184125	0.815875
Sujet 3	793490	80179.28	0.091773	0.908227
Sujet 4	2002063	45286.7	0.02212	0.97788
Sujet 5	80999193	355980.7	0.004376	0.995624
Sujet 6	32196717.7	216152.7	0.006669	0.993331
Sujet 7	40905724.5	334818.1	0.008119	0.991881
Sujet 8	28336711.5	218924.1	0.007667	0.992333
Sujet 9	8695135.5	542077	0.058684	0.941316
Sujet 10	103260212	1717728	0.016363	0.983637
SH : somme de l’aire de crête à m/z 268, 269 et 270
SD : somme de l’aire de crête à m/z 274, 275, 276, 277 et 278
D : enrichissement en rétinol marqué
H : taux de rétinol non étiqueté

Tableau 5 : Résultats de la GC/MS de la fraction sérique de rétinol dérivé. Ce tableau présente les résultats GC/MS nécessaires au calcul de la réserve corporelle totale de vitamine A. H est la somme de l’aire du pic à m/z 268, 269 et 270 ; D est la somme de l’aire du pic à m/z 274, 275, 276, 277 et 278 ; D est l’enrichissement en rétinol marqué ; H est le niveau de rétinol non marqué ; TBS est un magasin de vitamine A pour tout le corps.

Discussion

La mise en œuvre réussie de ce protocole repose sur l’exécution efficace de chaque étape. Une bonne préparation des solutions et des normes est cruciale pour garantir l’exactitude et la fiabilité des données collectées. Les procédures décrites dans le protocole ont été testées dans divers contextes et conviennent à l’obtention de solutions et de normes qui répondent aux objectifs de l’analyse des échantillons.

L’analyse des échantillons commence par l’extraction et la séparation du rétinol dans le sérum. Il est essentiel de stocker les échantillons de sérum à -80 °C jusqu’à l’analyse pour prévenir la dégradation de la vitamine A. De plus, il est nécessaire de travailler dans la pénombre¹⁶. La procédure HPLC utilisée pour collecter la fraction de rétinol est conçue pour séparer le rétinol des autres composants liposolubles afin d’éviter toute interférence dans le processus de dérivatisation. Il permet également d’exécuter des centaines d’échantillons sans vider la colonne.

La fraction de rétinol recueillie à partir de la HPLC est dérivée avec du BSTFA à 70 °C pendant 30 min. L’étape de dérivatisation est essentielle pour améliorer la volatilité du rétinol et sa détectabilité dans les GC-MS. Comme il est sensible à l’eau, il est crucial de sécher complètement l’échantillon avant la dérivatisation et de laisser suffisamment de temps pour que la réaction de dérivatisation se produise avant l’analyse GC-MS. Il a été remarqué que le processus de dérivatisation avec BSTFA est très doux et efficace par rapport à celui utilisé avec le N-méthyl-N-(tert-butyldiméthylsilyl) trifluoroacétamide (MTBSTFA)^23,24 et fournit un pic très net pour le rétinol dérivé, sans résidus ni pics de fond dans la plage de masse balayée¹⁴. Le rétinol dérivé dans un flacon scellé peut être conservé dans un dessiccateur à 4 °C pendant 1 mois sans dégradation¹⁴.

Pour l’analyse GC-MS, il est essentiel d’assurer un étalonnage et une maintenance corrects de la colonne, et d’optimiser le volume d’injection, la température et les débits. Les conditions utilisées ici avec l’injection sur colonne ont montré des résultats bons et fiables¹⁴. Au cours de l’analyse GC-MS du rétinol deutéré et non marqué, Tang et ^coll.14 ont observé que les pics de rétinol deutéré apparaissaient à la fois dans la dose administrée et dans le sérum des sujets ayant reçu la dose. Cette tendance n’a pas été observée avec le rétinol non marqué. Par conséquent, ils ont conclu que les pics de rétinol deutéré sont préformés dans la dose et ne résultent pas d’une fragmentation dans le spectromètre de masse, suggérant que le rétinol deutéré conserve sa structure tout au long du processus métabolique, fournissant un marqueur fiable pour le suivi du rétinol dans les études biologiques. L’enrichissement en rétinol deutéré dans le sérum après l’administration de 2 mg de rétinol D8 chez les enfants d’âge préscolaire a commencé à augmenter à 7 h et a atteint son pic à 14 jours, ce qui correspond au temps de prélèvement optimal plus court²⁵. Dans 200 μL de sérum humain, le pourcentage minimum détectable d’enrichissement en rétinol est de 0,01 %, ce qui démontre que la méthode est suffisamment sensible pour analyser des échantillons de sérum prélevés sur des sujets présentant un large éventail de statuts en vitamine A¹⁴.

Bien que la technique de dilution des isotopes stables présentée ici offre des avantages significatifs pour évaluer le statut en vitamine A, il convient de noter que cette méthode nécessite un équipement sophistiqué et une expertise technique, ce qui la rend coûteuse et moins accessible pour une utilisation courante dans de nombreux contextes²⁶. Par conséquent, il est essentiel de tenir compte de cette limitation lors de la planification de l’utilisation de cette technique.

matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
13x100 mm disposable culture tubes		99445-13	PYREX  Disposable Rimless Culture Tubes
16x100 mm disposable culture tubes		99445-16	PYREX  Disposable Rimless Culture Tubes
24 Position N-EVAP Nitrogen Evaporator	Organomation Associates, Inc	11250	N-EVAP 112, Nitrogen Evaporator, with OA-SYS heating system
Acetonitrile	Sigma-Aldrich	00687	Acetonitrile, suitable for HPLC, gradient grade, ≥99.9%
Amber colored Crimp vials, 2 mL,		SU860033	Short thread autosampler vial, amber vial 11.6 x 32 mm
Analytical Balance	Mettler Toledo	30133525	Precision Balance MS303TS/00
C18 column	Perkin-Elmer Inc	2580195	Brownlee Pecosphere RA C18 Cartridge Column - 33 mm x 4.6 mm I.D., Pkg. 5
cap crimper	MilliporeSigma	Z114243	Hand-operated aluminum cap crimper O.D. 20 mm
Capillary column	J & W Scientific	122-1011	15 m × 0.25 mm i.d. fused silica capillary column coated with a DB-1 stationary phase of 0.25 mm film thickness
Centrifuge	Sigma 3-18KS
Chloroform	Sigma-Aldrich	528730	Chloroforme, HPLC grade, ≥ 99.9%
Conical Flasks: 100 mL,		4980016	Borosil Erlenmeyer Flasks Graduated Conical NM Borosilicate
Crimp caps with PTFE seal	Supelco	27455-U	Crimp seals with PTFE/silicone septa
D8-Retinyl acetate	Cambridge Isotope Laboratories Inc.	DLM-2244-PK	Vitamin A acetate 3-4% cis (10, 14, 19, 19, 19, 20, 20, 20-D8, 90%)
Dispenser for 1-10 mL	Gilson	F110103	DISPENSMAN Bottle-top Dispenser
Dry Block Heater	Grant		Grant QBH2 High Performance Digital Dry Block Heater
Ethanol	Sigma-Aldrich	459844	Ethyl alcohol, Pure, ≥ 99.5%, ACS reagent, 200 proof
GC-MS	Agilent		Agilent 7890 A Series Gas Chromatography with 5975C Mass Spectrometer System equipped with a 5975C inert XL EI/CI MSD/DS Turbo CI System, a 7693A Auto?injector Includes transfer turret and a 7693 sample Tray
Glass stoppered volumetric Flasks:  2000 mL		956854	BRAND BLAUBRAND volumetric flask, glass stopper, clear glass
Glass stoppered volumetric Flasks: 100 mL		956849	BRAND BLAUBRAND volumetric flask, glass stopper, clear glass
Glass stoppered volumetric Flasks: 1000 mL		956853	BRAND BLAUBRAND volumetric flask, glass stopper, clear glass
Glass stoppered volumetric Flasks: 25 mL		956841	BRAND BLAUBRAND volumetric flask, glass stopper, clear glass
Glass stoppered volumetric Flasks: 50 mL		956847	BRAND BLAUBRAND volumetric flask, glass stopper, clear glass
Glass stoppered volumetric Flasks: 500 mL		956852	BRAND BLAUBRAND volumetric flask, glass stopper, clear glass
Helium (highest purity)	Air Liquide		UN 1046 Helium compressed, Class 2.2
HPLC	Varian		Varian 940LC HPLC with fraction collector
Inserts for crimp vials, 5 mm, 175 μL,		AR0-4521-12	Verex insert, 5 mm Dia, 175 µl, clear, conical bottom, w/bottom spring
Measuring Cylinders: 100 mL		213902402	DURAN Measuring Cylinder, with Hexagonal Base, Class A
Measuring Cylinders: 250 mL		213903604	DURAN Measuring Cylinder, with Hexagonal Base, Class A
Methane (highest purity)	Air Liquide		UN1971 Methane compressed, Class 2.1
Methanol	Sigma-Aldrich	34860	Methanol, suitable for HPLC, ≥ 99.9%
N, O-bis(trmethylsilyi)trifluoroacetamide (BSTFA) with 10% Trimethylchlorosilane (TMCS)	Thermo Scientific	043939.22
Nitrogen			Produced by Parker Balston NitroVap Generator
Pasteur Pipettes, glass,		13-678-20A	Fisherbrand Disposable Borosilicate Glass Pasteur Pipets
Quartz glass Cuvettes		EW-83301-12	Cole-Parmer Standard Single Quartz Cuvettes
Retinol	Sigma-Aldrich	17772	≥95.0% (HPLC), ~2700 U/mg
Retinyl acetate	Sigma-Aldrich	R0635	analytical standard grade
Sodium chloride	Sigma-Aldrich	S9888	Chlorure de sodium, ACS reagent, ≥ 99.0%
Spectrophotometer	Shimadzu		Uvmini-1240 UV-Vis Spectrophotometer
Tetrahydrofuran	Sigma-Aldrich	439215	Tetrahydrofurane, HPLC grade, ≥ 99.9%, inhibitor-free
Ultrasonic cleaner	Bransonic	CPX-952-339R	Branson CPX Bransonic Ultrasonic Bath
Volumetric Pipettes: 100-1000 µL		3123000063	Eppendorf 1-canal micropipette with T.I.P.S. Box 2.1
Volumetric Pipettes: 20-200 µL		3123000055	Eppendorf 1-canal micropipette with T.I.P.S. Box 2.0
Vortex mixer	Ika		Vortx Genius 3