Method Article
Este método envolve a extração de retinol do soro, separando-o usando HPLC e determinando isótopos de retinol marcados e não marcados usando GC-MS. A proporção de retinol rotulado para não rotulado é usada para estimar os estoques corporais totais de vitamina A.
Este método descreve a determinação do enriquecimento de deutério do retinol no soro e a estimativa dos estoques de vitamina A no corpo. O processo envolve a extração de retinol de 0,4 mL de soro usando 0,5 mL de solução salina a 0,85%, 100 μL de solução de padrão interno e 5 mL de solução de clorofórmio-metanol (2:1 v/v). Após centrifugação e remoção da camada inferior de clorofórmio, a mistura é seca sob nitrogênio e ressuspensa em 0,1 mL de etanol, e a fração de retinol é separada dos demais constituintes por meio de um sistema de HPLC equipado com uma coluna de PE C18. A fração de retinol pode ser coletada manualmente ou com um coletor de frações. Posteriormente, a fração retinol é seca sob nitrogênio e derivatizada com O-bis(trimetilsilil)trifluoroacetamida (BSTFA) contendo 10% de trimetilclorossilano. Finalmente, os isótopos de retinol marcados e não marcados são quantificados usando um sistema GC-MS equipado com uma coluna capilar de metil siloxano 19091z-431 HP-1, empregando ionização química negativa de captura de elétrons com hélio como gás transportador e metano como agente de ionização. A proporção de retinol marcado para não marcado é então usada nas equações de Olson, Green ou balanço de massa para estimar os estoques de vitamina A.
A vitamina A é um nutriente essencial necessário para o sistema visual e manutenção da função celular para o crescimento, integridade epitelial, produção de glóbulos vermelhos, imunidade e reprodução1. A deficiência de vitamina A é um grave problema de saúde pública em todo o mundo, afetando mais de 100 países. Afeta desproporcionalmente crianças pequenas e mulheres grávidas em países de baixa renda. Aproximadamente 190 milhões de crianças em todo o mundo sofrem de deficiência de vitamina A, tornando-se uma questão crítica para a saúde pública e o desenvolvimento infantil2.
Em resposta a essa situação, vários programas, incluindo suplementação de vitamina A com distribuição semestral de altas doses de vitamina A para crianças menores de 5 anos de idade e fortificação de vitamina A de certos produtos alimentares, foram implementados há décadas em muitos países de baixa renda. No entanto, essas intervenções muitas vezes se sobrepõem, expondo algumas populações à ingestão excessiva crônica inadvertida de vitamina A 3,4. Esse risco duplo de deficiência e excesso destaca a necessidade de um biomarcador que possa avaliar com precisão o status da vitamina A em todo o espectro, da deficiência à toxicidade, para orientar a avaliação do programa.
Os biomarcadores de vitamina A são cruciais para avaliar o estado nutricional. Os biomarcadores mais comumente usados são as concentrações séricas de retinol e proteína de ligação ao retinol (RBP). No entanto, é importante notar que esses biomarcadores podem ser temporariamente suprimidos por infecções e inflamações, o que pode diminuir a especificidade das avaliações de vitamina A em certas populações 5,6,7.
Embora as amostras de biópsia ou autópsia hepática sejam consideradas o padrão-ouro para avaliar o status de vitamina A, o indicador indireto mais sensível das reservas totais de vitamina A do fígado é o método de diluição de isótopos de retinol (RID)8. O RID fornece uma estimativa quantitativa do status de vitamina A em todo o espectro, variando de estoques deficientes a excessivos9. Na maioria das aplicações de pesquisa, o método RID envolve a administração de uma dose oral de deutério (2H) ou acetato de retinila marcado com 13C, que então se mistura com os estoques corporais por um período de 14 a 21 dias. Após este período, é recolhida uma amostra de sangue e o soro é armazenado a -80 °C. A proporção de retinol marcado para total é então analisada usando espectrometria de massa para estimar os estoques de vitamina A10, empregando a equação de Olson11, a equação de balanço de massa12 ou a equação de Green13. O protocolo apresentado neste trabalho é válido para a administração de acetato de retinonila marcado com deutério (2H) ou 13C e é baseado no trabalho de Tang et al.14. O objetivo geral desse método é avaliar e monitorar com precisão o status de vitamina A no corpo11. É um método poderoso que fornece uma estimativa quantitativa das concentrações de vitamina A em um amplo espectro de status, da deficiência ao excesso15. É mais exato e preciso do que outros métodos, que muitas vezes dependem de medidas indiretas9.
O protocolo foi aprovado pelo Comitê de Ética do Ministério da Saúde Pública (nº 2015/02/550/CE/CNERSH/SP), e o consentimento informado foi obtido dos pais/responsáveis.
NOTA: Como a vitamina A é sensível à luz, é crucial que todos os procedimentos sejam realizados com pouca luz ou sob iluminação fluorescente dourada16. Os materiais utilizados são detalhados na Tabela de Materiais.
1. Preparação de reagentes
2. Preparação de soluções-padrão
3. Análise da amostra
NOTA: As amostras de soro utilizadas neste estudo foram coletadas no14º dia de crianças que receberam uma dose oral (2 mg equivalentes de retinol) de D8-retinol como parte de um estudo projetado para monitorar e avaliar o status de vitamina A de crianças em Camarões.
4. Análise dos dados
5. Estimativa de estoques de vitamina A
NOTA: Esta etapa permite a avaliação do status de vitamina A de um indivíduo.
A injeção de 3 μL de uma amostra derivatizada de uma solução seca contendo aproximadamente 50 pM/μL de calibrantes (retinol e D8-retinol) no GC/MS não mostrou nenhum íon molecular, mas exibiu um íon fragmento maior em m/z 268 para retinol (Figura 1) e m/z 278 para D8-retinol (Figura 2). Isso indica que os íons moleculares do éter retinil trimetilsilílico, formados durante a derivatização do retinol e do D 8-retinol, não são estáveis nas condições de ionização usadas no GC/MS. Eles se decompõem em fragmentos menores, principalmente por meio da clivagem alfa. Este padrão de fragmentação comum envolve a quebra da ligação adjacente ao grupo éter trimetilsilílico. A clivagem alfa resulta na perda do grupo trimetilsilil (TMS, que tem massa de 73 Da) e um átomo de hidrogênio, levando a um íon fragmento com massa de 268 Da para retinol e 278 Da para D8-retinol 22. Esse mecanismo ajuda a identificar e confirmar a presença de retinol e seus derivados na amostra, analisando os íons de fragmentos específicos produzidos durante a espectrometria de massa. A injeção de misturas de retinol e D8-retinol mostrou dois íons fragmentos principais em m/z 268 para retinol e m/z 276 para D8-retinol (Figura 3), indicando a presença desses compostos na amostra. A curva de calibração apresentou excelente linearidade, conforme indicado por um alto coeficiente de correlação (Figura 4), mostrando que a relação entre a razão de pico e a razão de peso tem um padrão muito reto e previsível.
A resposta GC/MS obtida a partir das injeções de amostras de soro (soro de crianças que receberam uma dose oral de 2 mg de retinol equivalentes de D8-retinol; Figura 5) mostra a presença de retinol e D8-retinol, com os dois principais íons de fragmentos observados em m/z 268 e m/z 274. Os resultados obtidos após a extração de íons e integração das áreas de pico em m/z 274, 275, 276, 277 e 278 para D8-retinol e em m/z 268, 269 e 270 para retinol não marcado são apresentados na Tabela 5. Esses resultados devem ser integrados à equação de Olson11 ou à equação de Green13 para calcular os estoques de vitamina A no corpo.
A técnica de diluição de isótopos estáveis fornece medições dos níveis de vitamina A que não podem ser obtidas por outros métodos, permitindo avaliações precisas do status de vitamina A. Este método é valioso para estudos nutricionais, diagnósticos clínicos e pesquisas epidemiológicas.
Figura 1: Cromatograma e espectro de massa do retinol. A figura mostra a cromatografia gasosa / captura de elétrons de metano cromatograma de ionização química negativa-espectrometria de massa (painel superior) a partir da análise do padrão de retinol derivatizado. O painel inferior é um espectro de massa mostrando m / z 268 para retinol. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 2: Cromatograma e espectro de massa do D8-retinol. A figura mostra a cromatografia gasosa / captura de elétrons de metano cromatograma de ionização química negativa-espectrometria de massa (painel superior) a partir da análise do padrão D8-retinol derivatizado. O painel inferior é um espectro de massa mostrando m / z 278 para D8-retinol. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 3: Cromatograma e espectro de massa de uma mistura de retinol e D8-retinol. A figura mostra a cromatografia gasosa / elétrons de metano capturam cromatograma de ionização química negativa-espectrometria de massa (painel superior) a partir da análise de uma mistura derivatizada de padrões de retinol e D8-retinol. O painel inferior é um espectro de massa mostrando m / z 268 para retinol e m / z 276 para D8-retinol. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 4: Curva de calibração. Esta figura ilustra a relação entre a resposta GC/MS e a concentração de retinol não marcado e marcado. É descrito pela equação y = 9,8379x + 0,7019, onde y (as razões de área) representa a resposta do instrumento, 9,8379 é a sensibilidade, x (as razões de peso) representa a concentração do analito e 0,7019 é o sinal de fundo. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 5: Cromatograma e espectro de massa da amostra de soro. Esta figura ilustra a cromatografia gasosa / captura de elétrons de metano cromatograma de ionização química negativa de espectrometria de massa (painel superior) a partir da análise da fração de retinol derivatizada do soro. O painel inferior é um espectro de massa mostrando m / z 274 para D8-retinol. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Padrão | Peso (mg) | Balão volumétrico (ml) | Solvente |
Retinol | 40 | 100 | Etanol |
Acetato de retinilo | 40 | 100 | Etanol |
Acetato de retinilo marcado com deutério | 40 | 100 | Etanol |
Tabela 1: Preparação da solução-mãe. Esta tabela demonstra como preparar soluções concentradas de retinol e acetato de retinila marcado com deutério, que podem ser diluídas em concentrações mais baixas para experimentos futuros.
Padrão | Solução estoque (mL) | Balão volumétrico (ml) | Solvente |
Retinol | 1 | 50 | Etanol |
Acetato de retinilo | 1 | 50 | Etanol |
Acetato de retinilo marcado com deutério | 1 | 50 | Etanol |
Tabela 2: Preparação de soluções de estoque diluídas. Esta tabela demonstra como preparar soluções prontas para uso de retinol e acetato de retinila marcado com deutério.
Padrão | Comprimento de onda (nm) | E1%1 cm |
Retinol | 325 | 1850 |
Acetato de retinilo | 326 | 1550 |
Tabela 3: Comprimento de onda e E1% 1 cm (coeficiente de absorção).
Tempo (min) | Fluxo (mL / min) | Móvel Fase A (%) | Móvel Fase B (%) |
0 – 6 | 1 | 100 | 0 |
6 – 13 | 1 | 100 → 50 | 0 → 50 |
13 - 18 | 1 | 50 | 50 |
18 - 20 | 1 | 50 → 0 | 50 → 100 |
20 - 28 | 1 | 0 | 100 |
28 - 29 | 1 | 0 → 100 | 100 → 0 |
Tabela 4: Cronograma para fases móveis de HPLC. Este quadro ilustra a sequência planeada e a duração das diferentes fases durante a execução cromatográfica por HPLC.
SH | SD | D | H | |
Assunto 1 | 64030809 | 566089.7 | 0.008763 | 0.991237 |
Assunto 2 | 194354 | 43861.39 | 0.184125 | 0.815875 |
Assunto 3 | 793490 | 80179.28 | 0.091773 | 0.908227 |
Assunto 4 | 2002063 | 45286.7 | 0.02212 | 0.97788 |
Assunto 5 | 80999193 | 355980.7 | 0.004376 | 0.995624 |
Assunto 6 | 32196717.7 | 216152.7 | 0.006669 | 0.993331 |
Assunto 7 | 40905724.5 | 334818.1 | 0.008119 | 0.991881 |
Assunto 8 | 28336711.5 | 218924.1 | 0.007667 | 0.992333 |
Assunto 9 | 8695135.5 | 542077 | 0.058684 | 0.941316 |
Assunto 10 | 103260212 | 1717728 | 0.016363 | 0.983637 |
SH: soma da área do pico em m/z 268, 269 e 270 | ||||
DP: soma da área do pico em m / z 274, 275, 276, 277 e 278 | ||||
D: enriquecimento de retinol marcado | ||||
H: nível de retinol não marcado |
Tabela 5: Resultados de GC/MS da fração de retinol derivatizada do soro. Esta tabela relata os resultados de GC/MS necessários para o cálculo do estoque corporal total de vitamina A. H é a soma da área do pico em m/z 268, 269 e 270; D é a soma da área do pico em m/z 274, 275, 276, 277 e 278; D é o enriquecimento do retinol marcado; H é o nível de retinol não marcado; TBS é vitamina A Total Body Store.
A implementação bem-sucedida deste protocolo depende da execução efetiva de cada etapa. A preparação adequada de soluções e padrões é crucial para garantir que os dados coletados sejam precisos e confiáveis. Os procedimentos descritos no protocolo foram testados em vários cenários e são adequados para a obtenção de soluções e padrões que atendam aos objetivos da análise da amostra.
A análise das amostras começa com a extração e separação do retinol no soro. O armazenamento de amostras de soro a -80 °C até a análise é essencial para evitar a degradação da vitamina A. Além disso, é necessário trabalhar com pouca luz16. O procedimento de HPLC usado para coletar a fração de retinol é projetado para separar o retinol de outros componentes lipossolúveis para evitar interferência no processo de derivatização. Também permite executar centenas de amostras sem lavar a coluna.
A fração de retinol coletada da HPLC é derivatizada com BSTFA a 70 °C por 30 min. A etapa de derivatização é crítica para melhorar a volatilidade do retinol e sua detectabilidade em GC-MS. Por ser sensível à água, é crucial secar completamente a amostra antes da derivatização e permitir tempo suficiente para que a reação de derivatização ocorra antes da análise por GC-MS. Percebeu-se que o processo de derivatização com BSTFA é muito suave e eficiente em comparação com o que utiliza N-metil-N-(terc-butildimetilsilil) trifluoroacetamida (MTBSTFA)23,24 e fornece um pico muito acentuado para o retinol derivatizado, sem picos de cauda ou fundo na faixa de massaescaneada14. O retinol derivatizado em um frasco selado pode ser mantido em um dessecador a 4 ° C por 1 mês sem degradação14.
Para a análise GC-MS, é fundamental garantir a calibração e manutenção adequadas da coluna e otimizar o volume de injeção, temperatura e vazão. As condições aqui utilizadas com injeção na coluna mostraram resultados bons e confiáveis14. Durante a análise por CG-EM do retinol deuterado e não marcado, Tang et al.14 observaram que os picos de retinol deuterado apareceram tanto na dose administrada quanto no soro dos indivíduos que receberam a dose. Esse padrão não foi observado com retinol não marcado. Portanto, eles concluíram que os picos de retinol deuterado são pré-formados na dose e não resultado da fragmentação no espectrômetro de massa, sugerindo que o retinol deuterado mantém sua estrutura através do processo metabólico, fornecendo um marcador confiável para rastrear o retinol em estudos biológicos. O enriquecimento de retinol deuterado no soro após a administração de 2 mg de D8-retinol em crianças em idade pré-escolar começou a aumentar às 7 h e atingiu seu pico aos 14 dias, que é o menor tempo ideal de amostragem25. Em 200 μL de soro humano, o percentual mínimo detectável de enriquecimento de retinol é de 0,01%, demonstrando que o método é sensível o suficiente para analisar amostras de soro coletadas de indivíduos com uma ampla gama de status de vitamina A14.
Embora a técnica de diluição de isótopos estáveis apresentada aqui ofereça vantagens significativas para avaliar o status da vitamina A, deve-se notar que esse método requer equipamentos sofisticados e conhecimento técnico, tornando-o caro e menos acessível para uso rotineiro em muitos ambientes26. Portanto, é essencial considerar essa limitação ao planejar o uso dessa técnica.
Este manuscrito faz parte de uma série intitulada Utilizando o Método de Diluição de Isótopos de Retinol para Avaliação de Reservas Corporais de Vitamina A e Concentração de Vitamina A no Fígado apoiada pela AIEA.
Aprendemos este protocolo durante uma bolsa no Laboratório de Carotenóides e Saúde, Jean Mayer USDA Human Nutrition Research Center on Aging, Tufts University, Boston, EUA, sob a supervisão de Guangwen Tang e com o apoio financeiro da Agência Internacional de Energia Atômica (AIEA).
Name | Company | Catalog Number | Comments |
13x100 mm disposable culture tubes | 99445-13 | PYREX Disposable Rimless Culture Tubes | |
16x100 mm disposable culture tubes | 99445-16 | PYREX Disposable Rimless Culture Tubes | |
24 Position N-EVAP Nitrogen Evaporator | Organomation Associates, Inc | 11250 | N-EVAP 112, Nitrogen Evaporator, with OA-SYS heating system |
Acetonitrile | Sigma-Aldrich | 00687 | Acetonitrile, suitable for HPLC, gradient grade, ≥99.9% |
Amber colored Crimp vials, 2 mL, | SU860033 | Short thread autosampler vial, amber vial 11.6 x 32 mm | |
Analytical Balance | Mettler Toledo | 30133525 | Precision Balance MS303TS/00 |
C18 column | Perkin-Elmer Inc | 2580195 | Brownlee Pecosphere RA C18 Cartridge Column - 33 mm x 4.6 mm I.D., Pkg. 5 |
cap crimper | MilliporeSigma | Z114243 | Hand-operated aluminum cap crimper O.D. 20 mm |
Capillary column | J & W Scientific | 122-1011 | 15 m × 0.25 mm i.d. fused silica capillary column coated with a DB-1 stationary phase of 0.25 mm film thickness |
Centrifuge | Sigma 3-18KS | ||
Chloroform | Sigma-Aldrich | 528730 | Chloroforme, HPLC grade, ≥ 99.9% |
Conical Flasks: 100 mL, | 4980016 | Borosil Erlenmeyer Flasks Graduated Conical NM Borosilicate | |
Crimp caps with PTFE seal | Supelco | 27455-U | Crimp seals with PTFE/silicone septa |
D8-Retinyl acetate | Cambridge Isotope Laboratories Inc. | DLM-2244-PK | Vitamin A acetate 3-4% cis (10, 14, 19, 19, 19, 20, 20, 20-D8, 90%) |
Dispenser for 1-10 mL | Gilson | F110103 | DISPENSMAN Bottle-top Dispenser |
Dry Block Heater | Grant | Grant QBH2 High Performance Digital Dry Block Heater | |
Ethanol | Sigma-Aldrich | 459844 | Ethyl alcohol, Pure, ≥ 99.5%, ACS reagent, 200 proof |
GC-MS | Agilent | Agilent 7890 A Series Gas Chromatography with 5975C Mass Spectrometer System equipped with a 5975C inert XL EI/CI MSD/DS Turbo CI System, a 7693A Auto‐injector Includes transfer turret and a 7693 sample Tray | |
Glass stoppered volumetric Flasks: 2000 mL | 956854 | BRAND BLAUBRAND volumetric flask, glass stopper, clear glass | |
Glass stoppered volumetric Flasks: 100 mL | 956849 | BRAND BLAUBRAND volumetric flask, glass stopper, clear glass | |
Glass stoppered volumetric Flasks: 1000 mL | 956853 | BRAND BLAUBRAND volumetric flask, glass stopper, clear glass | |
Glass stoppered volumetric Flasks: 25 mL | 956841 | BRAND BLAUBRAND volumetric flask, glass stopper, clear glass | |
Glass stoppered volumetric Flasks: 50 mL | 956847 | BRAND BLAUBRAND volumetric flask, glass stopper, clear glass | |
Glass stoppered volumetric Flasks: 500 mL | 956852 | BRAND BLAUBRAND volumetric flask, glass stopper, clear glass | |
Helium (highest purity) | Air Liquide | UN 1046 Helium compressed, Class 2.2 | |
HPLC | Varian | Varian 940LC HPLC with fraction collector | |
Inserts for crimp vials, 5 mm, 175 μL, | AR0-4521-12 | Verex insert, 5 mm Dia, 175 µl, clear, conical bottom, w/bottom spring | |
Measuring Cylinders: 100 mL | 213902402 | DURAN Measuring Cylinder, with Hexagonal Base, Class A | |
Measuring Cylinders: 250 mL | 213903604 | DURAN Measuring Cylinder, with Hexagonal Base, Class A | |
Methane (highest purity) | Air Liquide | UN1971 Methane compressed, Class 2.1 | |
Methanol | Sigma-Aldrich | 34860 | Methanol, suitable for HPLC, ≥ 99.9% |
N, O-bis(trmethylsilyi)trifluoroacetamide (BSTFA) with 10% Trimethylchlorosilane (TMCS) | Thermo Scientific | 043939.22 | |
Nitrogen | Produced by Parker Balston NitroVap Generator | ||
Pasteur Pipettes, glass, | 13-678-20A | Fisherbrand Disposable Borosilicate Glass Pasteur Pipets | |
Quartz glass Cuvettes | EW-83301-12 | Cole-Parmer Standard Single Quartz Cuvettes | |
Retinol | Sigma-Aldrich | 17772 | ≥95.0% (HPLC), ~2700 U/mg |
Retinyl acetate | Sigma-Aldrich | R0635 | analytical standard grade |
Sodium chloride | Sigma-Aldrich | S9888 | Chlorure de sodium, ACS reagent, ≥ 99.0% |
Spectrophotometer | Shimadzu | Uvmini-1240 UV-Vis Spectrophotometer | |
Tetrahydrofuran | Sigma-Aldrich | 439215 | Tetrahydrofurane, HPLC grade, ≥ 99.9%, inhibitor-free |
Ultrasonic cleaner | Bransonic | CPX-952-339R | Branson CPX Bransonic Ultrasonic Bath |
Volumetric Pipettes: 100-1000 µL | 3123000063 | Eppendorf 1-canal micropipette with T.I.P.S. Box 2.1 | |
Volumetric Pipettes: 20-200 µL | 3123000055 | Eppendorf 1-canal micropipette with T.I.P.S. Box 2.0 | |
Vortex mixer | Ika | Vortx Genius 3 |
Solicitar permissão para reutilizar o texto ou figuras deste artigo JoVE
Solicitar PermissãoThis article has been published
Video Coming Soon
Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. Todos os direitos reservados