Análise GC-MS do enriquecimento de deutério de retinol no soro e estimativa dos estoques corporais totais de vitamina A

Resumo

Este método envolve a extração de retinol do soro, separando-o usando HPLC e determinando isótopos de retinol marcados e não marcados usando GC-MS. A proporção de retinol rotulado para não rotulado é usada para estimar os estoques corporais totais de vitamina A.

Resumo

Este método descreve a determinação do enriquecimento de deutério do retinol no soro e a estimativa dos estoques de vitamina A no corpo. O processo envolve a extração de retinol de 0,4 mL de soro usando 0,5 mL de solução salina a 0,85%, 100 μL de solução de padrão interno e 5 mL de solução de clorofórmio-metanol (2:1 v/v). Após centrifugação e remoção da camada inferior de clorofórmio, a mistura é seca sob nitrogênio e ressuspensa em 0,1 mL de etanol, e a fração de retinol é separada dos demais constituintes por meio de um sistema de HPLC equipado com uma coluna de PE C18. A fração de retinol pode ser coletada manualmente ou com um coletor de frações. Posteriormente, a fração retinol é seca sob nitrogênio e derivatizada com O-bis(trimetilsilil)trifluoroacetamida (BSTFA) contendo 10% de trimetilclorossilano. Finalmente, os isótopos de retinol marcados e não marcados são quantificados usando um sistema GC-MS equipado com uma coluna capilar de metil siloxano 19091z-431 HP-1, empregando ionização química negativa de captura de elétrons com hélio como gás transportador e metano como agente de ionização. A proporção de retinol marcado para não marcado é então usada nas equações de Olson, Green ou balanço de massa para estimar os estoques de vitamina A.

Introdução

A vitamina A é um nutriente essencial necessário para o sistema visual e manutenção da função celular para o crescimento, integridade epitelial, produção de glóbulos vermelhos, imunidade e reprodução¹. A deficiência de vitamina A é um grave problema de saúde pública em todo o mundo, afetando mais de 100 países. Afeta desproporcionalmente crianças pequenas e mulheres grávidas em países de baixa renda. Aproximadamente 190 milhões de crianças em todo o mundo sofrem de deficiência de vitamina A, tornando-se uma questão crítica para a saúde pública e o desenvolvimento infantil².

Em resposta a essa situação, vários programas, incluindo suplementação de vitamina A com distribuição semestral de altas doses de vitamina A para crianças menores de 5 anos de idade e fortificação de vitamina A de certos produtos alimentares, foram implementados há décadas em muitos países de baixa renda. No entanto, essas intervenções muitas vezes se sobrepõem, expondo algumas populações à ingestão excessiva crônica inadvertida de vitamina A ^3,4. Esse risco duplo de deficiência e excesso destaca a necessidade de um biomarcador que possa avaliar com precisão o status da vitamina A em todo o espectro, da deficiência à toxicidade, para orientar a avaliação do programa.

Os biomarcadores de vitamina A são cruciais para avaliar o estado nutricional. Os biomarcadores mais comumente usados são as concentrações séricas de retinol e proteína de ligação ao retinol (RBP). No entanto, é importante notar que esses biomarcadores podem ser temporariamente suprimidos por infecções e inflamações, o que pode diminuir a especificidade das avaliações de vitamina A em certas populações ^5,6,7.

Embora as amostras de biópsia ou autópsia hepática sejam consideradas o padrão-ouro para avaliar o status de vitamina A, o indicador indireto mais sensível das reservas totais de vitamina A do fígado é o método de diluição de isótopos de retinol (RID)⁸. O RID fornece uma estimativa quantitativa do status de vitamina A em todo o espectro, variando de estoques deficientes a excessivos⁹. Na maioria das aplicações de pesquisa, o método RID envolve a administração de uma dose oral de deutério (²H) ou acetato de retinila marcado com ¹³C, que então se mistura com os estoques corporais por um período de 14 a 21 dias. Após este período, é recolhida uma amostra de sangue e o soro é armazenado a -80 °C. A proporção de retinol marcado para total é então analisada usando espectrometria de massa para estimar os estoques de vitamina A¹⁰, empregando a equação de Olson¹¹, a equação de balanço de massa¹² ou a equação de Green¹³. O protocolo apresentado neste trabalho é válido para a administração de acetato de retinonila marcado com deutério (²H) ou ¹³C e é baseado no trabalho de Tang et ^al.14. O objetivo geral desse método é avaliar e monitorar com precisão o status de vitamina A no corpo¹¹. É um método poderoso que fornece uma estimativa quantitativa das concentrações de vitamina A em um amplo espectro de status, da deficiência ao excesso¹⁵. É mais exato e preciso do que outros métodos, que muitas vezes dependem de medidas indiretas⁹.

Protocolo

O protocolo foi aprovado pelo Comitê de Ética do Ministério da Saúde Pública (nº 2015/02/550/CE/CNERSH/SP), e o consentimento informado foi obtido dos pais/responsáveis.

NOTA: Como a vitamina A é sensível à luz, é crucial que todos os procedimentos sejam realizados com pouca luz ou sob iluminação fluorescente dourada¹⁶. Os materiais utilizados são detalhados na Tabela de Materiais.

1. Preparação de reagentes

1. Cloreto de sódio (0,85% p/v): Dissolver 0,85 g de NaCl em água destilada em balão volumétrico de 100 mL. Encha até a marca de graduação com água destilada e misture.
2. Clorofórmio-metanol (2:1 v/v): Transferir 300 ml de clorofórmio para um balão volumétrico de 500 ml com uma proveta graduada. Adicione 150 mL de metanol e misture.
3. Fase móvel A para HPLC: Acetonitrila/tetrahidrofurano/água ultrapura (50/20/30, v/v/v): Transferir 500 mL de acetonitrila para um balão volumétrico de 1000 mL. Adicione 200 mL de tetrahidrofurano e 300 mL de água. Misturar a solução, filtrá-la com um filtro de membrana com poros de 0,45 μm e sonicar (amplitude de 100%, frequência de 40 kHz e duração de 15 min).
4. Fase móvel B para HPLC: Acetonitrila/tetrahidrofurano/água ultrapura (50/44/6, v/v/v): Transferir 500 mL de acetonitrila para um balão volumétrico de 1000 mL. Adicione 440 mL de tetrahidrofurano e 60 mL de água. Misturar a solução, filtrá-la com um filtro de membrana com poros de 0,45 μm e sonicate.

2. Preparação de soluções-padrão

1. Preparar a solução-mãe dissolvendo 40 mg do padrão em etanol num balão volumétrico de 100 ml, conforme ilustrado no quadro 1. Encher até à marca de graduação com o solvente e homogeneizar.
2. Soluções-mãe diluídas: Preparar a solução-mãe diluída transferindo 1 ml da solução-mãe para um balão volumétrico de 50 ml, como indicado no quadro 2. Encher até à marca de graduação com o solvente adequado e homogeneizar.
3. Determinação da concentração das soluções-mãe diluídas: Colocar uma alíquota (1 ml) da solução diluída num tubo de quartzo e medir a sua absorvância no espectrofotómetro no comprimento de onda especificado (quadro 3) utilizando etanol como branco. Calcule o usando a Lei de Lambert-Beer¹⁷. Certifique-se de que o espectrofotômetro esteja calibrado antes da análise, aquecendo o instrumento por 15-30 min, selecionando o comprimento de onda desejado e zerando o instrumento colocando o branco no suporte de amostra. Calcular a concentração utilizando a seguinte fórmula:
   Concentração = (coeficiente de absorbância/absorção) x^10,6 (μg/dL)
   NOTA: Para converter valores de unidades convencionais (μg/dL) em unidades SI (μmol/L), multiplique o valor convencional pelos seguintes fatores de conversão: 0,0304 para acetato de retinila e 0,0349 para retinol¹⁸.
4. Preparação dos padrões de trabalho: Com uma pipeta volumétrica, transferir 2 ml das soluções-mãe diluídas para um balão cónico de 100 ml. Encher o balão até à marca de graduação com etanol, homogeneizar e fechar com uma rolha.
   1. Para determinar a concentração exacta de cada solução, avaliar a pureza de cada componente utilizando HPLC equipada com uma coluna C18 e um detector de díodos regulado para 340 nm. Programe a bomba para usar a Fase Móvel A e a Fase Móvel B de acordo com o cronograma mostrado na Tabela 4. Certifique-se de que o sistema HPLC esteja calibrado antes da análise, validando vários componentes, como bomba, detector, amostrador automático e o desempenho de todo o sistema.
   2. Transferir 1 ml das soluções-mãe diluídas para frascos de crimpagem e injectar as amostras no sistema de HPLC de acordo com o procedimento normal. Determine a pureza usando a seguinte equação:
      
      EQUAÇÃO 1
      Com esta correção de pureza, calcular a concentração exata dos diferentes componentes na solução-padrão.
5. Preparação do padrão interno (acetato de retinilo OD ~ 0,2): Usando uma pipeta volumétrica, transfira 30 mL do padrão de trabalho de acetato de retinila para um frasco cônico de 100 mL. Encher o balão até à marca de graduação com etanol, homogeneizar e fechar com uma rolha.
6. Preparação de soluções de trabalho: Adicione 20 μg de retinol não marcado a 10,00, 3,33, 1,00, 0,33 e 0,00 μg de retinol marcado para fornecer proporções de retinol marcado e não marcado de 0,500, 0,167, 0,050, 0,0167 e 0,00.

3. Análise da amostra

NOTA: As amostras de soro utilizadas neste estudo foram coletadas no^14º dia de crianças que receberam uma dose oral (2 mg equivalentes de retinol) de D8-retinol como parte de um estudo projetado para monitorar e avaliar o status de vitamina A de crianças em Camarões.

1. Extração de retinóides no soro: Esta extração é baseada no trabalho de Folch et ^al.19 modificado por Tang et ^al.14. Siga as etapas descritas abaixo.
   1. Deixar as amostras de soro congeladas descongelarem suavemente à temperatura ambiente (20-25 °C) antes da análise. Alíquota de 400 μL de soro em um tubo de cultura descartável de 16 x 100 mm. Adicione 500 μL de solução salina a 0,85% mais 100 μL de padrão interno e 5 mL de solução de clorofórmio-metanol (2:1 v/v).
   2. Vórtice por 30 s e centrifugue a 1157 x g por 10 min a 4 °C. Usando uma pipeta Pasteur de vidro, remova cuidadosamente a camada inferior de clorofórmio para um tubo de cultura descartável de 13 x 100 mm. Secar em banho-maria em nitrogênio gasoso (40 °C) e ressuspender o resíduo em 100 μl de etanol. Vórtice e sonicar por 30 s. Transfira a amostra para um frasco de crimpagem com uma inserção, feche o poço e etiquete. A amostra está pronta para coleta de retinol por HPLC.
2. Realize a coleta de retinol por HPLC conforme descrito abaixo.
   1. Injectar 70 μL de cada amostra de soro num sistema de HPLC equipado com uma coluna C18 e um detector de díodos regulado para 340 nm. Programe a bomba para fornecer as Fases Móveis A e B a uma vazão constante de 1 mL/min, seguindo o cronograma mostrado na Tabela 4.
   2. Antes de injetar as amostras de soro, injete 70 μL da solução de trabalho de retinol no sistema HPLC e registre o tempo de retenção do pico de retinol. Em seguida, configure o coletor de frações para coletar a fração de retinol eluída dentro de uma faixa especificada em um tubo de 5 mL com uma rolha de vidro fosco. Neste caso, a fração retinol foi coletada em um intervalo de 3 min, de 7,5 a 10,5 min.
      NOTA: A concentração de retinol também pode ser calculada nesta etapa usando uma curva de calibração dos padrões de retinol e a taxa de recuperação obtida do padrão interno.
3. Realize a derivatização do retinol conforme descrito abaixo.
   1. Secar a fracção de retinol recolhida da HPLC em azoto, em banho-maria, a 40 °C, durante, pelo menos, 3 h. Adicione etanol para facilitar a evaporação da umidade durante a secagem (as amostras devem estar completamente secas, pois a derivatização é sensível à umidade). Adicione 20 μL de BSTFA com 10% de TMCS ao tubo.
   2. Coloque o tubo em um aquecedor de bloco seco regulado para 70 °C e incube por 30 min. Usando uma pipeta Pasteur de vidro, transfira a mistura de reação para um frasco de crimpagem com uma inserção, feche bem com a tampa de crimpagem usando um crimpador de tampa e rotule. A amostra está agora pronta para análise GC/MS e pode ser armazenada em um dessecador a 4 °C até a análise.
   3. Além disso, seque um conjunto de 100 μL de soluções-padrão de trabalho e derivatize conforme descrito acima para calibrar o GC / MS.
      NOTA: A derivatização do retinol usando BSTFA envolve uma reação química onde o grupo hidroxila (-OH) do retinol é substituído pelo grupo trimetilsilil (-Si(CH₃)₃), formando éter retinil trimetilsilílico. Esse processo aumenta a volatilidade e a estabilidade do retinol, tornando-o mais adequado para a análise de GC/MS²⁰.
4. Análise de GC/MS: A análise de GC/MS é realizada usando o procedimento descrito por Tang et ^al.14. Siga as etapas descritas abaixo.
   1. Injete 3 μL da amostra de retinol derivatizado usando um amostrador automático no GC com um injetor frio na coluna conectado através de um conector de volume morto zero a uma coluna capilar de sílica fundida de 15 m x 0,25 mm de diâmetro interno revestida com uma fase estacionária DB-1 de 0,25 μm de espessura de filme.
   2. Programe as temperaturas do forno de coluna e do injetor na coluna para aumentar de 50 °C para 285 °C a uma taxa de 15 °C/min e defina a temperatura da interface GC/MS para 285 °C. Use hélio como gás transportador para eluir o derivado trimetilsilil do retinol por aproximadamente 12 min.
   3. Detectar o eluído de GC com um espectrômetro de massa quadrupolo usando ionização química de íons negativos de metano de 0,5 torr, com a temperatura da fonte de íons ajustada para 150 °C. Configure o espectrômetro de massa para escanear entre 260 e 280 daltons.

4. Análise dos dados

1. Use o software de análise de dados GC/MS.
2. Extraia todos os íons desejados com base em suas proporções massa-carga (m/z), integre a área do pico (use a integração manual para ajustar os pontos inicial e final do pico) e transfira os resultados para um arquivo de planilha.
   NOTA: Dependendo do isótopo utilizado, os íons desejados serão os seguintes: 268-270 m/z para retinol nativo; 271-274 m/z para [²H₄]-retinol; 278-280 m/z para [¹³C]-retinol; e 276-280 m/z para [²H₈]-retinol.
3. Calcule a soma dos picos para retinol marcado (ΣD) adicionando a área do pico em m / z 274, 275, 276, 277 e 278. Calcule a soma dos picos para retinol não marcado (ΣH) adicionando a área do pico em m / z 268, 269 e 270.
4. Calcule o enriquecimento do retinol marcado (D) usando a seguinte equação: D = ΣD/(ΣH + ΣD). Calcule a quantidade de retinol não marcado (H) usando a seguinte equação: H = 1 - D.
   NOTA: A espectrometria de massa de ionização química negativa de captura de elétrons por cromatografia gasosa do éter trimetilsilílico retinil não fornece nenhum íon molecular, mas um íon fragmento principal em m / z 268 a 271 para retinol não marcado, em m / z 272 a 275 para D4-retinol e em m / z 276 a 280 para D8-retinol¹⁴.
5. Para controlar o sistema, calcule uma equação de regressão linear entre as proporções de peso dos padrões de calibração e as áreas integradas para retinol marcado e retinol não marcado.

5. Estimativa de estoques de vitamina A

NOTA: Esta etapa permite a avaliação do status de vitamina A de um indivíduo.

1. Calcule os estoques totais de vitamina A no fígado usando a equação de Olson¹¹
   Reservas Totais de Vitamina A no Fígado = F x Dose x [S x a x (H/D - 1)]
   onde F é um fator para a eficiência de absorção e armazenamento da dose administrada por via oral (F = 0,50), Dose é a quantidade de vitamina A marcada administrada por via oral (μmol), S é um fator que corrige a desigualdade do plasma para a proporção hepática de retinol marcado para não marcado (S = 0,65), a é um fator que corrige a perda irreversível de vitamina A marcada durante o período de mistura; especificamente, a = ^e-kt, onde k é a taxa catabólica fracionária estimada do sistema (k = ln 2/32 dias para crianças) e t é o tempo, expresso em dias desde a dose; D/H é a razão isotópica sérica de retinol marcado para não marcado, -1 corrige a contribuição da dose de vitamina A marcada para o pool total de vitamina A do corpo.
2. Para calcular os estoques corporais totais de vitamina A (TBS), use a equação de Green¹³
   TBS = Fa × S × (1/SAp)
   onde Fa é a fração da dose de VA marcada por via oral absorvida e encontrada nos reservatórios de armazenamento trocáveis do corpo no tempo t, e S é a razão entre a atividade específica do retinol no soro e a dos estoques no tempo t (para crianças, Fa × S = 0,642 em 14 dias)²¹. SAp é a fração da dose no soro por dose de μmol (ou seja, [retinol marcado] / ([não marcado + retinol marcado] no soro) / dose oral de retinol marcado (μmol)).

Resultados

A injeção de 3 μL de uma amostra derivatizada de uma solução seca contendo aproximadamente 50 pM/μL de calibrantes (retinol e D_8-retinol) no GC/MS não mostrou nenhum íon molecular, mas exibiu um íon fragmento maior em m/z 268 para retinol (Figura 1) e m/z 278 para D_8-retinol (Figura 2). Isso indica que os íons moleculares do éter retinil trimetilsilílico, formados durante a derivatização do retinol e do D 8-retinol, não são estáveis nas condições de ionização usadas no GC/MS. Eles se decompõem em fragmentos menores, principalmente por meio da clivagem alfa. Este padrão de fragmentação comum envolve a quebra da ligação adjacente ao grupo éter trimetilsilílico. A clivagem alfa resulta na perda do grupo trimetilsilil (TMS, que tem massa de 73 Da) e um átomo de hidrogênio, levando a um íon fragmento com massa de 268 Da para retinol e 278 Da para D_8-retinol ²². Esse mecanismo ajuda a identificar e confirmar a presença de retinol e seus derivados na amostra, analisando os íons de fragmentos específicos produzidos durante a espectrometria de massa. A injeção de misturas de retinol e D8-retinol mostrou dois íons fragmentos principais em m/z 268 para retinol e m/z 276 para D8-retinol (Figura 3), indicando a presença desses compostos na amostra. A curva de calibração apresentou excelente linearidade, conforme indicado por um alto coeficiente de correlação (Figura 4), mostrando que a relação entre a razão de pico e a razão de peso tem um padrão muito reto e previsível.

A resposta GC/MS obtida a partir das injeções de amostras de soro (soro de crianças que receberam uma dose oral de 2 mg de retinol equivalentes de D8-retinol; Figura 5) mostra a presença de retinol e D8-retinol, com os dois principais íons de fragmentos observados em m/z 268 e m/z 274. Os resultados obtidos após a extração de íons e integração das áreas de pico em m/z 274, 275, 276, 277 e 278 para D8-retinol e em m/z 268, 269 e 270 para retinol não marcado são apresentados na Tabela 5. Esses resultados devem ser integrados à equação de Olson¹¹ ou à equação de Green¹³ para calcular os estoques de vitamina A no corpo.

A técnica de diluição de isótopos estáveis fornece medições dos níveis de vitamina A que não podem ser obtidas por outros métodos, permitindo avaliações precisas do status de vitamina A. Este método é valioso para estudos nutricionais, diagnósticos clínicos e pesquisas epidemiológicas.

Figura 1: Cromatograma e espectro de massa do retinol. A figura mostra a cromatografia gasosa / captura de elétrons de metano cromatograma de ionização química negativa-espectrometria de massa (painel superior) a partir da análise do padrão de retinol derivatizado. O painel inferior é um espectro de massa mostrando m / z 268 para retinol. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 2: Cromatograma e espectro de massa do D8-retinol. A figura mostra a cromatografia gasosa / captura de elétrons de metano cromatograma de ionização química negativa-espectrometria de massa (painel superior) a partir da análise do padrão D8-retinol derivatizado. O painel inferior é um espectro de massa mostrando m / z 278 para D8-retinol. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 3: Cromatograma e espectro de massa de uma mistura de retinol e D8-retinol. A figura mostra a cromatografia gasosa / elétrons de metano capturam cromatograma de ionização química negativa-espectrometria de massa (painel superior) a partir da análise de uma mistura derivatizada de padrões de retinol e D8-retinol. O painel inferior é um espectro de massa mostrando m / z 268 para retinol e m / z 276 para D8-retinol. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 4: Curva de calibração. Esta figura ilustra a relação entre a resposta GC/MS e a concentração de retinol não marcado e marcado. É descrito pela equação y = 9,8379x + 0,7019, onde y (as razões de área) representa a resposta do instrumento, 9,8379 é a sensibilidade, x (as razões de peso) representa a concentração do analito e 0,7019 é o sinal de fundo. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 5: Cromatograma e espectro de massa da amostra de soro. Esta figura ilustra a cromatografia gasosa / captura de elétrons de metano cromatograma de ionização química negativa de espectrometria de massa (painel superior) a partir da análise da fração de retinol derivatizada do soro. O painel inferior é um espectro de massa mostrando m / z 274 para D8-retinol. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Padrão	Peso (mg)	Balão volumétrico (ml)	Solvente
Retinol	40	100	Etanol
Acetato de retinilo	40	100	Etanol
Acetato de retinilo marcado com deutério	40	100	Etanol

Tabela 1: Preparação da solução-mãe. Esta tabela demonstra como preparar soluções concentradas de retinol e acetato de retinila marcado com deutério, que podem ser diluídas em concentrações mais baixas para experimentos futuros.

Padrão	Solução estoque (mL)	Balão volumétrico (ml)	Solvente
Retinol	1	50	Etanol
Acetato de retinilo	1	50	Etanol
Acetato de retinilo marcado com deutério	1	50	Etanol

Tabela 2: Preparação de soluções de estoque diluídas. Esta tabela demonstra como preparar soluções prontas para uso de retinol e acetato de retinila marcado com deutério.

Padrão	Comprimento de onda (nm)	E1%1 cm
Retinol	325	1850
Acetato de retinilo	326	1550

Tabela 3: Comprimento de onda e E1% 1 cm (coeficiente de absorção).

Tempo (min)	Fluxo (mL / min)	Móvel Fase A (%)	Móvel Fase B (%)
0 – 6	1	100	0
6 – 13	1	100 → 50	0 → 50
13 - 18	1	50	50
18 - 20	1	50 → 0	50 → 100
20 - 28	1	0	100
28 - 29	1	0 → 100	100 → 0

Tabela 4: Cronograma para fases móveis de HPLC. Este quadro ilustra a sequência planeada e a duração das diferentes fases durante a execução cromatográfica por HPLC.

	SH	SD	D	H
Assunto 1	64030809	566089.7	0.008763	0.991237
Assunto 2	194354	43861.39	0.184125	0.815875
Assunto 3	793490	80179.28	0.091773	0.908227
Assunto 4	2002063	45286.7	0.02212	0.97788
Assunto 5	80999193	355980.7	0.004376	0.995624
Assunto 6	32196717.7	216152.7	0.006669	0.993331
Assunto 7	40905724.5	334818.1	0.008119	0.991881
Assunto 8	28336711.5	218924.1	0.007667	0.992333
Assunto 9	8695135.5	542077	0.058684	0.941316
Assunto 10	103260212	1717728	0.016363	0.983637
SH: soma da área do pico em m/z 268, 269 e 270
DP: soma da área do pico em m / z 274, 275, 276, 277 e 278
D: enriquecimento de retinol marcado
H: nível de retinol não marcado

Tabela 5: Resultados de GC/MS da fração de retinol derivatizada do soro. Esta tabela relata os resultados de GC/MS necessários para o cálculo do estoque corporal total de vitamina A. H é a soma da área do pico em m/z 268, 269 e 270; D é a soma da área do pico em m/z 274, 275, 276, 277 e 278; D é o enriquecimento do retinol marcado; H é o nível de retinol não marcado; TBS é vitamina A Total Body Store.

Discussão

A implementação bem-sucedida deste protocolo depende da execução efetiva de cada etapa. A preparação adequada de soluções e padrões é crucial para garantir que os dados coletados sejam precisos e confiáveis. Os procedimentos descritos no protocolo foram testados em vários cenários e são adequados para a obtenção de soluções e padrões que atendam aos objetivos da análise da amostra.

A análise das amostras começa com a extração e separação do retinol no soro. O armazenamento de amostras de soro a -80 °C até a análise é essencial para evitar a degradação da vitamina A. Além disso, é necessário trabalhar com pouca luz¹⁶. O procedimento de HPLC usado para coletar a fração de retinol é projetado para separar o retinol de outros componentes lipossolúveis para evitar interferência no processo de derivatização. Também permite executar centenas de amostras sem lavar a coluna.

A fração de retinol coletada da HPLC é derivatizada com BSTFA a 70 °C por 30 min. A etapa de derivatização é crítica para melhorar a volatilidade do retinol e sua detectabilidade em GC-MS. Por ser sensível à água, é crucial secar completamente a amostra antes da derivatização e permitir tempo suficiente para que a reação de derivatização ocorra antes da análise por GC-MS. Percebeu-se que o processo de derivatização com BSTFA é muito suave e eficiente em comparação com o que utiliza N-metil-N-(terc-butildimetilsilil) trifluoroacetamida (MTBSTFA)^23,24 e fornece um pico muito acentuado para o retinol derivatizado, sem picos de cauda ou fundo na faixa de massa^escaneada14. O retinol derivatizado em um frasco selado pode ser mantido em um dessecador a 4 ° C por 1 mês sem degradação¹⁴.

Para a análise GC-MS, é fundamental garantir a calibração e manutenção adequadas da coluna e otimizar o volume de injeção, temperatura e vazão. As condições aqui utilizadas com injeção na coluna mostraram resultados bons e confiáveis¹⁴. Durante a análise por CG-EM do retinol deuterado e não marcado, Tang et ^al.14 observaram que os picos de retinol deuterado apareceram tanto na dose administrada quanto no soro dos indivíduos que receberam a dose. Esse padrão não foi observado com retinol não marcado. Portanto, eles concluíram que os picos de retinol deuterado são pré-formados na dose e não resultado da fragmentação no espectrômetro de massa, sugerindo que o retinol deuterado mantém sua estrutura através do processo metabólico, fornecendo um marcador confiável para rastrear o retinol em estudos biológicos. O enriquecimento de retinol deuterado no soro após a administração de 2 mg de D8-retinol em crianças em idade pré-escolar começou a aumentar às 7 h e atingiu seu pico aos 14 dias, que é o menor tempo ideal de amostragem²⁵. Em 200 μL de soro humano, o percentual mínimo detectável de enriquecimento de retinol é de 0,01%, demonstrando que o método é sensível o suficiente para analisar amostras de soro coletadas de indivíduos com uma ampla gama de status de vitamina A¹⁴.

Embora a técnica de diluição de isótopos estáveis apresentada aqui ofereça vantagens significativas para avaliar o status da vitamina A, deve-se notar que esse método requer equipamentos sofisticados e conhecimento técnico, tornando-o caro e menos acessível para uso rotineiro em muitos ambientes²⁶. Portanto, é essencial considerar essa limitação ao planejar o uso dessa técnica.

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
13x100 mm disposable culture tubes		99445-13	PYREX  Disposable Rimless Culture Tubes
16x100 mm disposable culture tubes		99445-16	PYREX  Disposable Rimless Culture Tubes
24 Position N-EVAP Nitrogen Evaporator	Organomation Associates, Inc	11250	N-EVAP 112, Nitrogen Evaporator, with OA-SYS heating system
Acetonitrile	Sigma-Aldrich	00687	Acetonitrile, suitable for HPLC, gradient grade, ≥99.9%
Amber colored Crimp vials, 2 mL,		SU860033	Short thread autosampler vial, amber vial 11.6 x 32 mm
Analytical Balance	Mettler Toledo	30133525	Precision Balance MS303TS/00
C18 column	Perkin-Elmer Inc	2580195	Brownlee Pecosphere RA C18 Cartridge Column - 33 mm x 4.6 mm I.D., Pkg. 5
cap crimper	MilliporeSigma	Z114243	Hand-operated aluminum cap crimper O.D. 20 mm
Capillary column	J & W Scientific	122-1011	15 m × 0.25 mm i.d. fused silica capillary column coated with a DB-1 stationary phase of 0.25 mm film thickness
Centrifuge	Sigma 3-18KS
Chloroform	Sigma-Aldrich	528730	Chloroforme, HPLC grade, ≥ 99.9%
Conical Flasks: 100 mL,		4980016	Borosil Erlenmeyer Flasks Graduated Conical NM Borosilicate
Crimp caps with PTFE seal	Supelco	27455-U	Crimp seals with PTFE/silicone septa
D8-Retinyl acetate	Cambridge Isotope Laboratories Inc.	DLM-2244-PK	Vitamin A acetate 3-4% cis (10, 14, 19, 19, 19, 20, 20, 20-D8, 90%)
Dispenser for 1-10 mL	Gilson	F110103	DISPENSMAN Bottle-top Dispenser
Dry Block Heater	Grant		Grant QBH2 High Performance Digital Dry Block Heater
Ethanol	Sigma-Aldrich	459844	Ethyl alcohol, Pure, ≥ 99.5%, ACS reagent, 200 proof
GC-MS	Agilent		Agilent 7890 A Series Gas Chromatography with 5975C Mass Spectrometer System equipped with a 5975C inert XL EI/CI MSD/DS Turbo CI System, a 7693A Auto?injector Includes transfer turret and a 7693 sample Tray
Glass stoppered volumetric Flasks:  2000 mL		956854	BRAND BLAUBRAND volumetric flask, glass stopper, clear glass
Glass stoppered volumetric Flasks: 100 mL		956849	BRAND BLAUBRAND volumetric flask, glass stopper, clear glass
Glass stoppered volumetric Flasks: 1000 mL		956853	BRAND BLAUBRAND volumetric flask, glass stopper, clear glass
Glass stoppered volumetric Flasks: 25 mL		956841	BRAND BLAUBRAND volumetric flask, glass stopper, clear glass
Glass stoppered volumetric Flasks: 50 mL		956847	BRAND BLAUBRAND volumetric flask, glass stopper, clear glass
Glass stoppered volumetric Flasks: 500 mL		956852	BRAND BLAUBRAND volumetric flask, glass stopper, clear glass
Helium (highest purity)	Air Liquide		UN 1046 Helium compressed, Class 2.2
HPLC	Varian		Varian 940LC HPLC with fraction collector
Inserts for crimp vials, 5 mm, 175 μL,		AR0-4521-12	Verex insert, 5 mm Dia, 175 µl, clear, conical bottom, w/bottom spring
Measuring Cylinders: 100 mL		213902402	DURAN Measuring Cylinder, with Hexagonal Base, Class A
Measuring Cylinders: 250 mL		213903604	DURAN Measuring Cylinder, with Hexagonal Base, Class A
Methane (highest purity)	Air Liquide		UN1971 Methane compressed, Class 2.1
Methanol	Sigma-Aldrich	34860	Methanol, suitable for HPLC, ≥ 99.9%
N, O-bis(trmethylsilyi)trifluoroacetamide (BSTFA) with 10% Trimethylchlorosilane (TMCS)	Thermo Scientific	043939.22
Nitrogen			Produced by Parker Balston NitroVap Generator
Pasteur Pipettes, glass,		13-678-20A	Fisherbrand Disposable Borosilicate Glass Pasteur Pipets
Quartz glass Cuvettes		EW-83301-12	Cole-Parmer Standard Single Quartz Cuvettes
Retinol	Sigma-Aldrich	17772	≥95.0% (HPLC), ~2700 U/mg
Retinyl acetate	Sigma-Aldrich	R0635	analytical standard grade
Sodium chloride	Sigma-Aldrich	S9888	Chlorure de sodium, ACS reagent, ≥ 99.0%
Spectrophotometer	Shimadzu		Uvmini-1240 UV-Vis Spectrophotometer
Tetrahydrofuran	Sigma-Aldrich	439215	Tetrahydrofurane, HPLC grade, ≥ 99.9%, inhibitor-free
Ultrasonic cleaner	Bransonic	CPX-952-339R	Branson CPX Bransonic Ultrasonic Bath
Volumetric Pipettes: 100-1000 µL		3123000063	Eppendorf 1-canal micropipette with T.I.P.S. Box 2.1
Volumetric Pipettes: 20-200 µL		3123000055	Eppendorf 1-canal micropipette with T.I.P.S. Box 2.0
Vortex mixer	Ika		Vortx Genius 3