Pour commencer, retirez les capuchons supérieur et inférieur de la colonne d’essorage du kit d’enrichissement en protéines commercial et conservez-les pour une utilisation future. Placez la colonne d’essorage non bouché dans un micro-tube à centrifuger de deux millilitres. Centrifugez l’installation à 1000 G et à température ambiante pendant 30 à 60 secondes pour retirer et jeter la solution de stockage.
Ajoutez 200 microlitres de tampon de lavage aux billes d’enrichissement dans la colonne d’essorage et mélangez en pipetant plusieurs fois de haut en bas. Après avoir centrifugé la colonne d’essorage comme indiqué précédemment, jetez le tampon collecté. Replacez le capuchon inférieur et ajoutez 200 microlitres d’eau dans la colonne d’essorage avant de replacer le capuchon supérieur.
Mélangez la bouillie de billes aqueuses préparée en la pipetant de haut en bas avant d’en transférer 40 microlitres dans l’échantillon de produit médicamenteux à base d’anticorps monoclonaux pré-préparé. Incubez le tube en le faisant tourner à température ambiante pendant deux heures. Ensuite, faites des trous dans une fritte de taille appropriée à l’aide d’une aiguille de calibre 16 et insérez-la dans l’extrémité d’une pointe de 200 microlitres.
Transférez l’échantillon avec des billes sur la pointe préparée et placez-le dans un tube de micro-centrifugation de deux millilitres avec un trou dans le capuchon supérieur. Centrifugez l’embout dans le tube pour retirer la solution. Lavez les billes en ajoutant 200 microlitres de tampon de lavage à la pointe.
Retirez le tampon de lavage en centrifugeant l’embout dans un micro-tube à centrifuger de deux millilitres. Ensuite, lavez les billes dans la pointe avec 200 microlitres d’eau et centrifugez comme indiqué précédemment pour éliminer l’eau. Maintenant, ajoutez 10 microlitres de tampon d’élution à la pointe et trempez-y soigneusement les billes en pipetant la boue de haut en bas 10 fois.
Transférez l’embout dans un nouveau tube de micro-centrifugation de 0,5 millilitre avec un trou dans le capuchon supérieur et centrifugez le tube pour recueillir la protéine échappée. Ajoutez 1,5 microlitre de solution de trypsine dans l’éluant et laissez-le digérer toute la nuit à 28 degrés. Ensuite, ajoutez 1,5 microlitre de 25 milligrammes par millilitre de dithiothréitol à l’échantillon et incubez-le à 90 degrés pendant 20 minutes.
Ensuite, incubez l’échantillon avec 1,5 microlitre d’iodoacétamide à 0,25 molaire à température ambiante dans l’obscurité pendant 20 minutes. Après cela, ajoutez 3,5 microlitres d’acide trichloracétique à 10 % ou TFA et faites vortex l’échantillon pendant deux minutes. Centrifuger l’échantillon à 14 400 g pendant 10 minutes à température ambiante pour précipiter le SDC et le SLS.
Recueillir le surnageant acidifié pour le dessaler. Ajouter 50 microlitres de tampon B à l’embout de dessalage GC. Placez ensuite l’embout dans un support et centrifugez-le à 1000 G pendant trois minutes à température ambiante.
Ajoutez 50 microlitres de tampon A à la pointe et faites tourner la pointe comme indiqué précédemment. Maintenant, ajoutez l’échantillon acidifié à la pointe. Centrifugez l’embout dans le support à 500 G pendant six minutes à température ambiante.
Ensuite, lavez l’embout en y ajoutant 50 microlitres de tampon A et en le faisant tourner à 500 G pendant trois minutes à température ambiante. Éluer le peptide de l’embout de dessalage GC en ajoutant 50 microlitres de tampon B et en centrifugant l’embout dans un nouveau tube à 500 G pendant trois minutes à température ambiante. Après cela, séchez l’éluant collecté à l’aide d’un concentrateur sous vide.
Remettre en suspension l’éluant séché dans 30 microlitres de solution d’acide formique à 0,1 %. Mesurer l’absorbance ultraviolette des mélanges peptidiques à 214 nanomètres à l’aide d’un spectrophotomètre. Enfin, transférez 10 microlitres de l’échantillon digéré dans un flacon d’échantillon de chromatographie liquide et analysez un microgramme de l’échantillon à l’aide de nano LC-MS/MS.
Les profils de chromatogramme ionique total des protéines de la cellule hôte ont révélé que, par rapport à la digestion directe, la plupart des principaux peptides d’anticorps monoclonaux ont été réduits ou éliminés après l’enrichissement protéique démontré couplé à un protocole de digestion limité.
