Pour commencer, ensemencez un volume de 200 microlitres de 10 000 cellules de carcinome hépatocellulaire dans une plaque de 96 puits avec DMEM et 10 % FBS. Incuber les cellules pendant la nuit à 37 degrés Celsius dans un incubateur humidifié sous 5% de dioxyde de carbone. Le lendemain, remplacez le milieu de culture et traitez les cellules avec des concentrations variables de peroxyde d’hydrogène et de ménadione.
Dissoudre cinq milligrammes de DHE dans un millilitre de DMSO. Pour la solution de travail, diluer une aliquote de 100 micromoles avec un milieu DMEM préchauffé à une concentration de 10 micromoles. Agitez la solution de teinture pendant 5 à 10 secondes pour assurer un bon mélange.
Retirez maintenant le milieu de test de chaque puits avant de placer les cellules du carcinome. Ensuite, lavez délicatement chaque puits avec du PBS. Pipeter 100 microlitres de la solution de colorant de travail dans chaque puits.
Incuber l’assiette à 37 degrés Celsius pendant 30 minutes. Retirez le milieu contenant du DHE de chaque puits. Utilisez une pipette multicanaux pour laver chaque puits trois fois avec du PBS.
Maintenant, pipetez 200 microlitres de PBS contenant le colorant de coloration nucléaire Hoechst 33342 dans chaque puits. Après l’incubation, transférez la plaque sur une plate-forme de criblage à haut contenu. Lancez le logiciel de criblage à haut contenu Cellomics CX7.
Calibrez la plate-forme d’imagerie selon les spécifications du fabricant. Ouvrez les paramètres système spécifiques à la marque de la plaque dans la base de données de l’instrument. Ensuite, placez soigneusement la plaque contenant les échantillons sur la platine chauffée du système d’imagerie.
Assurez-vous que la plaque est bien positionnée et dans la bonne orientation. Appuyez ensuite doucement sur la microplaque pour vous assurer qu’elle repose à plat contre la platine. Une fois la plaque correctement positionnée, appuyez sur la touche Control et maintenez-la enfoncée.
Cliquez ensuite sur Contrôle et OK pour ouvrir la boîte de dialogue Chargement/Déchargement de la plaque. Pour sélectionner les paramètres d’imagerie, ouvrez le mode Activation de la cible dans l’interface de Cellomics BioApplications. Créer un nouveau protocole d’acquisition de données à double canal compatible avec la coloration nucléaire et la sonde de fluorescence DHE.
Ensuite, spécifiez les objectifs requis pour l’acquisition d’images, puis choisissez le grossissement approprié. Spécifiez maintenant le temps d’exposition, la flexion de la caméra et l’intervalle z-stack. Une fois les paramètres d’imagerie définis, identifiez l’objet de suivi principal d’intérêt à l’aide des différents algorithmes de l’instrument.
Après avoir segmenté l’objet identifié, validez l’objet principal en fonction des paramètres spécifiques de taille, de forme et d’intensité propres à chaque type de cellule. Définissez la région d’intérêt autour de l’objet et définissez un cercle de 20 micromètres autour de lui. Cliquez sur l’onglet Caractérisation de la population, puis définissez la limite de numérisation à 1000 cellules par puits avec un minimum de 10 objets par champ.
Cliquez maintenant sur Lancer la vue pour numériser chaque plaque de puits. Lancez ensuite le logiciel d’analyse de vue et exportez les paramètres de données quantitatives au format CSV pour une analyse supplémentaire. L’exposition au peroxyde a entraîné une augmentation statistiquement significative de la fluorescence induite par les ROS dans toutes les lignées cellulaires de manière dose-dépendante.
Avec la ménadione, les cellules JHH-4 ont montré une augmentation dose-dépendante de l’intensité fluorescente. Cependant, la différence significative de fluorescence n’a été observée qu’à des concentrations plus élevées dans les deux autres lignées cellulaires.
