1 Pour commencer, effectuezl’imagerie d’une seule molécule de la cellule 2 vivante des condensats de protéines HaloTag. 3 À l’aide d’ImageJ, convertissez chaque canal 4 du fichier de données d’imagerie brutes 5 en un fichier TIFF indépendant. 6 Si nécessaire, exécutez le peigne de pré-suivi.
Textez 7 et suivez les invites 8 pour remplacer les cadres par les plus récents. 9 Pour charger la molécule unique du fichier vidéo dans SlimFast, 10 cliquez sur charger, suivi de la pile d’images. 11 Définissez les paramètres de localisation 12 et d’acquisition sous les feuilles d’options respectives.
13 Visualisez les localisations de toutes les molécules. 14 Et en utilisant lock all, 15 générez un fichier contenant les localisations 16 de toutes les molécules dans chaque image. 17 Ensuite, allez charger les données de particules 18 et sélectionnez SlimFast pour charger le fichier 19 avec les paramètres de localisation et d’acquisition.
20 À l’aide de l’option et du suivi de la feuille, 21 ajustez les paramètres de génération de trajectoire. 22 Cliquez sur gen traj pour générer un fichier 23 contenant les trajectoires de toutes les molécules. 24 Chargez le fichier suivi de la feuille dans l’évaluation SPT 25 et réglez les paramètres 26 pour filtrer les trajectoires de moins de 2,5 secondes.
27 À l’aide des données d’exportation, générez un fichier 28 avec toutes les trajectoires filtrées. 29 Exécution de la macro ImageJ, du noyau, de la 30 et de la deuxième version du masque de cluster. texte, 31 seuil toutes les images de la vidéo acquises 32 dans le canal JFX549 pour générer une vidéo en accéléré 33 peuplée du masque binaire évolutif dans le temps 34 mettant en évidence les emplacements des condensats.
35 Utilisation de convertir ASCII suivi lent CSS 3. M, 36 reformater les trajectoires 37 et exécuter la catégorisation version 4. M 38 pour les trier en fonction de la durée de vie 39 qu’une molécule passe dans un condensat.
40 Ensuite, à l’aide de plot residence hist CSS. M, 41 extraient le taux de dissociation 42 observé des molécules spécifiquement liées 43 et le taux de photoblanchiment de la protéine dans le condensat 44 d’intérêt et les trajectoires H2B. 45 Enfin, calculez le temps de séjour moyen corrigé 46 de la protéine d’intérêt, 47 spécifiquement liée à ses condensats.
48 Une image du film bicolore à molécule unique 49 du TAF15 IDR-Halo-FTH1 montre les signaux 50 du noyau dans les canaux PA-JF646 et JFX549. 51 Lors de l’assemblage et du tri, une distinction claire a été observée pour les trajectoires 53 des molécules de PA-JF646 détectées liées aux condensats. 54 Les temps de séjour moyens calculés 55 après correction pour le photoblanchiment 56 étaient plus élevés pour TAF15-Halo-FTH1 que pour Halo-TAF15.
