Pour commencer, remettre en suspension le peptide synthétisé qui agit comme un contrôle positif à une concentration de 0,1 milligramme par millilitre dans le DMSO. Mélangez le peptide remis en suspension avec le peptide d’histone H4 biotinylé pour créer une courbe standard. Ensuite, assemblez les réactions d’acétylation en double dans des plaques de PCR à 96 puits.
Une réaction de 20 microlitres doit comprendre 10 microlitres d’enzyme, un microlitre de peptide H4, un microlitre de tampon 20X et un microlitre de DTT. Ajoutez un microlitre de DMSO ou le composé d’essai dans chaque puits. Pipeter doucement le mélange pour mélanger.
Ensuite, incubez le mélange sur de la glace pendant 10 minutes pour permettre la complexation des inhibiteurs enzymatiques. Pour la poursuite de la réaction d’acétylation, combinez deux microlitres de coenzyme A de l’huile de 4-Penten avec quatre microlitres d’eau. Ajoutez six microlitres de ce mélange dans les puits.
Après un mélange doux, centrifugez le mélange à 300G pendant 30 secondes à température ambiante. Incuber le contenu à 37 degrés Celsius pendant une heure dans des tubes bouchés. Trempez le contenu avec 20 microlitres d’urée à huit molaires et conservez-le à moins 20 degrés Celsius jusqu’à la suite du traitement.
Ensuite, pipeter 80 microlitres de PBST dans chaque puits de plaques noires de 96 puits recouvertes de neutravidine pré-bloquées BSA. Ajoutez 40 microlitres de contenu de réaction dans les puits de la plaque. Ensuite, pipetez les peptides de courbe standard en double dans les puits restants.
Agitez doucement les peptides sur un agitateur orbital pendant une heure à température ambiante pour faciliter la liaison. Une fois la liaison terminée, aspirez le liquide des puits. Utilisez un laveur de plaques pour laver les puits avec 200 microlitres de PBST.
Pour la réaction de clic, ajoutez le mélange de cuivre THPTA à l’ascorbate de sodium dans l’eau et à l’azoture de biotine dans le DMSO. Distribuez 19 microlitres de réactifs fraîchement mélangés dans chaque puits. Scellez la plaque avec du papier d’aluminium.
Ensuite, incubez-le à 37 degrés Celsius pendant une heure. Aspirez la solution des puits avant de laver comme précédemment. Ensuite, ajoutez 100 microlitres de mélange de peroxydase de raifort Streptavidin dilué dans chaque puits.
Incuber à température ambiante pendant une heure en agitant doucement sur un agitateur orbital. Pour combiner les réactifs de détection Amplex Red, pipetez 500 microlitres de peroxyde d’hydrogène dilué dans le réactif Amplex Red. Ajoutez 50 microlitres de ce mélange à 4,5 millilitres de phosphate de sodium.
Pipeter 100 microlitres du mélange réactionnel Amplex Red dans les puits lavés. Incuber ensuite la plaque à température ambiante pendant 30 minutes à l’abri de la lumière. Lancez le logiciel SmartControl et cliquez sur Plate Out.
Une fois la plaque transférée dans l’instrument, cliquez sur l’icône Amplex Red et modifiez la disposition de la plaque. Appuyez à nouveau sur l’icône Amplex Red pour voir la mise en page modifiée. Sélectionnez ensuite les puits standard en haut à gauche dans la disposition.
Modifiez le nom du fichier, puis appuyez sur Démarrer l’ajustement. Une fois le gain réglé, cliquez sur Démarrer la mesure. Appuyez sur État actuel pour observer la mesure en temps réel.
Une fois la mesure terminée, fermez l’onglet. Cliquez ensuite sur Ouvrir la dernière exécution dans le panneau supérieur. Accédez à l’onglet Mars.
Appuyez ensuite sur Exporter vers Excel dans le menu d’accueil pour exporter les résultats des données. On a observé que les composés A et C inhibaient l’activité HAT1 de près de 100 % pour plusieurs dilutions.
