Pour commencer, prenez des cellules de 293FT cultivées dans une boîte de 10 centimètres et aspirez le milieu. Lavez les cellules avec cinq millilitres de PBS. Ajoutez ensuite un millilitre de trypsine EDTA et incubez pendant 3 à 5 minutes à 37 degrés Celsius pour détacher les cellules de la parabole.
Après l’incubation, ajoutez neuf millilitres de DMEM complet aux cellules pour neutraliser la trypsine. Pipetez de haut en bas à plusieurs reprises pour générer une suspension homogène à cellule unique, puis transférez les cellules dans un tube de 15 millilitres. Transférez immédiatement 20 microlitres de cellules dans un tube de 1,7 millilitre et mélangez avec 20 microlitres de colorant bleu trypan.
Comptez les cellules à l’aide d’un compteur de cellules automatisé ou d’un hémocytomètre. Transférez le volume approprié de cellules dans un tube de 50 millilitres et diluez-les dans du DMEM complet. Ajoutez deux millilitres de suspension cellulaire dans chaque puits d’une plaque à six puits.
Incuber les cellules à 37 degrés Celsius et 10 % de dioxyde de carbone pendant la nuit. Avant la transfection, diluez la nanoluciférase CRAF et les plasmides 1433 zeta halo, ainsi qu’un vecteur vide pCDNA3 dans le tampon TE. Étiquetez un ensemble de tubes stériles de 1,7 millilitre.
Ajoutez 100 microlitres de milieu de transfection dans chaque tube, ainsi que les constructions d’expression. Ajoutez maintenant deux microlitres de réactif de transfection et mélangez doucement au vortex. Faites tourner brièvement les tubes dans une microcentrifugeuse, puis incubez les tubes à environ 25 degrés Celsius pendant 15 minutes pour permettre la formation de complexes de transfection.
Ensuite, ajoutez des complexes de transfection aux cellules et incubez à 37 degrés Celsius pendant 16 à 20 heures pour exprimer le halo et les protéines nanomarquées.
