La rétinopathie diabétique est la complication microvasculaire la plus courante du diabète. Cette méthode peut aider à répondre aux questions clés sur la pathophysiologie de la rétinopathie diabétique proliférante de la maladie de phase finale. Cette technique permet la déconstruction du paysage tridimensionnel indigène de tissu et l’investigation de la pathophysiologie de tissu dans le matériel patient vivant avec la pertinence clinique directe. Se référer au protocole texte pour plus de détails sur la chirurgie et l’instrumentation utilisée dans la dissection. Pour commencer, placez le tissu fibrovasculaire qui a été excisé des sujets humains subissant la chirurgie vitréoretinal transconjonctivale de microincision dans un plat de culture cellulaire contenant le PBS stérile. À l’aide d’un microscope stéréo de dissection verticale, couper le tissu fibrovasculaire en morceaux d’environ un millimètre carré. Submergez le tissu dans PBS et maintenez le tissu en place avec des pinces à épiler de micro dissection. Faites des coupes claires dans le tissu avec un scalpel stérile en prenant soin d’éviter de déchirer le tissu fibrovasculaire. Placez chaque morceau de tissu individuel dans un puits d’une plaque de culture cellulaire de 12 puits contenant un millilitre de PBS stérile. Tout d’abord, préparer 25 aliquots microlitres de solution fibrinogen à température ambiante. Placez un morceau de tissu fibrovasculaire au centre du puits d’une plaque de puits de 24 et enlevez tout excès de PBS. Ensuite, ajoutez 25 microlitres de solution TA à l’un des aliquots fibrinogen préparés. Et en utilisant une autre pipette réglée à 50 microlitres mélanger par pipetting. Distribuez le mélange sur le morceau de tissu fibrovasculaire et pipette de haut en bas pour s’assurer que le morceau de tissu est contenu dans la gouttelette. Le temps de la formation de fibrinogen critique pour la tridimensionnalité de la culture ex vivo, est examiné dans une intégration vide de tissu antérieur de gouttelette comme décrit dans le protocole. Incuber la plaque dans un incubateur de culture cellulaire. Après 30 à 60 minutes incliner la plaque pour vérifier que le gel fibrin est complètement formé. Ensuite, superposer les gels fibrin tissu fibrovasculaires avec ex vivo milieu de culture complété par l’aprotinine. Après cela, retournez les plaques de culture à l’incubateur de culture cellulaire pour la période désirée. Tout d’abord, remplacer le milieu de culture ex vivo par un millilitre de solution de paraformaldéhyde par puits pour fixer les cultures. Après une heure, rincer les gels à l’aide de trois lavages PBS de cinq minutes. Ensuite, remplacez le lavage PBS par deux millilitres de solution d’azide de sodium par puits. Conserver les gels fixes à quatre degrés Celsius.Utilisez une spatule à bord carré en acier inoxydable pour soulever soigneusement les gouttelettes de la plaque, en commençant par les bords avant de soulever le centre de la gouttelette. À l’aide d’une spatule à bords ronds, transférer les gouttelettes dans des puits individuels d’une plaque de puits de 12 puits contenant un millilitre de PBS. Après cela, inclinez la plaque sur un support et postfixez les gouttelettes avec un millilitre de solution glacée de méthanol d’acétone pendant une minute. Rincez ensuite avec trois à cinq lavages millilitres de PBS. Centrifugez la solution de blocage pendant 15 minutes pour enlever les débris. Ensuite, inclinez la plaque sur un support et incuber les gouttelettes dans 500 microlitres de solution de blocage pendant deux heures à température ambiante. Préparer le mélange primaire d’anticorps selon le protocole de texte. Ensuite, utilisez une spatule à bords ronds pour transférer les gouttelettes dans une assiette ronde de 96 puits. Incuber les gouttelettes dans 30 microlitres du mélange primaire d’anticorps par gouttelette pendant la nuit à quatre degrés Celsius. Le lendemain, transférez les gouttelettes dans une plaque de 12 puits contenant deux millilitres de solution de lavage par puits. Rincer les gouttelettes à l’aide de trois lavages de cinq minutes. Ensuite, lavez les gouttelettes avec neuf lavages de 30 minutes. Le lendemain, rincer les gouttelettes trois fois avec du PBS. Préparer le mélange d’anticorps secondaire conjugué au fluorophore selon le protocole du texte. Transférer les gouttelettes dans une plaque de puits à fond rond 96, comme démontré précédemment, et incuber la plaque avec 30 microlitres de mélange secondaire d’anticorps pendant quatre heures à température ambiante, à l’abri de la lumière.Après quatre heures, transférer les gouttelettes dans une plaque de 12 puits contenant deux millilitres de solution de lavage par puits. Tout d’abord, rincer les gouttelettes avec trois lavages de cinq minutes. Ensuite, lavez les gouttelettes avec quatre lavages de 30 minutes. Le lendemain, rincer les gouttelettes cinq fois avec une solution de lavage pendant 30 minutes, et trois fois avec PBS pendant 30 minutes. Le lendemain, transférez les gouttelettes dans une plaque ronde inférieure de 96 puits, comme nous l’avons déjà démontré. Contrestain les gouttelettes avec la tache nucléaire hoechst pendant 30 minutes à température ambiante. Transférer les gouttelettes dans une plaque de 12 puits contenant deux millilitres de PBS par puits et rincer trois fois avec du PBS. Ensuite, appliquez une couche étroite de support de montage durcissant rapide le long des bords d’un verre de couverture carré et laissez-le sécher pendant une minute. Rincez ensuite la gouttelette en la plongeant dans un puits d’une plaque de 12 puits contenant de l’eau déionisée. Et transférer la gouttelette sur une lame de microscope. Ensuite, distribuez 15 microlitres de milieu de montage anti-fondu non durcissant sur la gouttelette. Placez doucement le verre de couverture sur la gouttelette avec le milieu de montage faisant face à la glissière et laissez-le s’installer. Laissez sécher les glissières pendant deux heures à température ambiante et conservez-les à quatre degrés Celsius pendant la nuit. Enfin, imagez les diapositives à l’aide d’un microscope d’épifluorescence droit équipé d’une fonction de section optique à l’objectif 20x ou 40x. Dans ce protocole le tissu fibrovasculaire a été préparé et imaged. Les données représentatives ont montré que les cultures ex vivo de RDP induisent la germination de l’endothélium positif CD-31 et la préservation de vasculature en réponse à VEGFA. Inversement, TGF
