Les métabolites libérés par le microbiote intestinal produisent des effets complexes sur l’hôte. Ce protocole présente une méthode pour interroger le rôle des métabolites intestinaux dans le cerveau et le comportement de la souris. Cette technique fournit une méthode précise, méticuleuse et validée pour délivrer des métabolites intestinaux dans un cerveau chez des souris en mouvement libre.
Nous fournissons une méthodologie complète et physiologique meilleure pour mieux comprendre la recherche sur l’axe intestin-cerveau. Placez la souris sur le cadre stéréotaxique et fixez les incisives de la souris sur la barre d’incisives dans le support d’incisive stéréotaxique. Couvrez le nez avec le masque à cône nasal.
Évaluez ensuite la nociception de la souris via le réflexe de pincement supérieur, et assurez-vous d’un rythme respiratoire constant avant d’inciser le site chirurgical. Une fois la fourrure coupée sur la tête enlevée par le ruban adhésif, injectez par voie sous-cutanée l’analgésique kétoprofène pour soulager la douleur et appliquez une pommade pour les yeux. Ensuite, fixez la tête en insérant la barre d’oreille pointue dans le conduit auditif.
Serrez la pince nasale sur le porte-incisive et appuyez doucement sur la tête pour vous assurer que la tête est fixée. Utilisez 3 gommages alternés d’écouvillon de chlorhexidine pour désinfecter le cuir chevelu. Maintenant, utilisez le scalpel disséquant pour faire une incision de moins d’un centimètre dans le cuir chevelu de manière postérieure antérieure.
Après avoir ouvert l’incision, essuyez le crâne avec un coton-tige tenu par une pince à microdissection. Sur la base des coordonnées stéréotaxiques, identifier et étiqueter la position du ventricule latéral droit telle que décrite dans le manuscrit. Ensuite, percez un trou dans le crâne sur le site étiqueté à l’aide d’une perceuse stéréotaxique, puis percez deux à quatre trous supplémentaires dans le crâne.
Essuyez le crâne avec un coton-tige en lidocaïne et montez 2 à 4 vis en acier inoxydable sur les trous. Placez la canule de guidage commercial sur le support de canule stéréotaxique et désinfectez avec le stérilisateur à vitesse de verre à 150 degrés Celsius. Ensuite, déplacez le porte-canule stéréotaxique vers le trou percé pour le ventricule latéral et insérez lentement la canule de guidage commerciale dans le trou jusqu’à ce que la profondeur souhaitée soit atteinte.
Appliquez maintenant 10 microlitres d’adhésif cyanoacrylate de n-butyle pour fixer la canule de guidage commerciale dans le trou percé et attendez 3 à 4 minutes. Libérez doucement la canule de guidage commercial du porte-canule stéréotaxique et appliquez de l’acrylique dentaire sur le cuir chevelu incisé pour fixer la canule de guidage commercial et attendez au moins 5 minutes. Implantez le mannequin commercial dans la canule de guidage commercial.
Ensuite, placez la souris dans une nouvelle cage avec un coussin chauffant en dessous pour récupérer de l’anesthésie et observez continuellement jusqu’à ce que la souris se réveille complètement. Montez la seringue de microlitre, contenant 10 microlitres d’eau distillée, sur la pompe de micro-injection. À l’aide d’une seringue à insuline, remplissez le tube en polyéthylène avec de l’eau distillée et connectez la seringue de microlitre au tube en polyéthylène suspendu.
Allumez le contrôleur de micro-injection et appuyez sur Afficher tous les canaux pour accéder à l’écran de commande. Ensuite, appuyez sur configuration et définissez l’objectif de volume sur 9 800 nanolitres avec un débit de 100 nanolitres par seconde. Appuyez ensuite sur la direction pour passer en mode d’infusion et appuyez sur Run pour infuser 9 800 nanolitres d’eau distillée à partir du tube en polyéthylène connecté à la seringue de microlitre.
Maintenant, placez l’injecteur dans un flacon contenant l’huile minérale, appuyez sur la configuration et réglez l’objectif de volume à 3 000 nanolitres avec un débit de 100 nanolitres par seconde. Pour retirer 3 000 nanolitres d’huile minérale, appuyez sur la direction pour passer en mode de retrait, puis appuyez sur run. Démontez le tube en polyéthylène de l’aiguille de la seringue de microlitre.
Pour cracher 3 000 nanolitres d’eau distillée de l’aiguille de la seringue de microlitre, appuyez sur la direction pour passer en mode d’infusion et appuyez sur l’exécution. Réinsérez ensuite la seringue de microlitre dans le tube en polyéthylène. Placez l’injecteur dans un flacon contenant des AGCC.
Appuyez sur la configuration et définissez l’objectif de volume à 9 500 nanolitres avec un débit de 100 nanolitres par seconde. Retirez 9 500 nanolitres d’AGCC en appuyant sur la direction pour passer en mode de retrait et appuyez sur Run. Étiqueter la phase d’AGCC d’huile pour valider si les AGCC sont perfusés avec succès.
Appuyez sur la configuration et définissez l’objectif de volume souhaité avec un débit de 7 nanolitres par seconde. Appuyez sur la direction pour passer en mode infuse. Appuyez sur la pression pour infuser la seringue de microlitre vers l’avant jusqu’à ce que le liquide sorte à l’extrémité avant de l’injecteur commercial avant d’insérer l’injecteur dans la canule pour l’injection d’AGCC.
Après avoir anesthésié la souris, insérez l’injecteur commercial dans la canule de guidage commercial. Une fois que la souris est récupérée de l’anesthésie, placez-la dans une nouvelle cage et laissez-la explorer pendant 35 minutes librement. Infuser les AGCC en utilisant un débit de 7 nanolitres par seconde pour un volume cible de 2 100 nanolitres dans les 5 premières minutes.
Appuyez ensuite sur direction en mode infuse et appuyez sur exécuter. Après les tests comportementaux, retirez l’injecteur commercial de la canule de guidage commercial. Infuser 2 100 nanolitres du traceur neutre avec un débit de 7 nanolitres par seconde pour vérifier le site de perfusion.
Imagez le signal fluorescent dans le site de perfusion à l’aide d’un microscope à fluorescence. Les souris infusées d’ACSF et d’AGCC ont voyagé dans une nouvelle cage pendant un total de 35 minutes. Aucune différence n’a été observée dans l’activité locomotrice dans la nouvelle cage entre la perfusion d’AGCC et l’ACSF.
Le colorant fluorescent a été détecté dans le ventricule latéral et les régions environnantes du cerveau de la souris lorsqu’il a été perfusé avec une canule guide commerciale. De même, la perfusion à travers la canule guide en acier inoxydable conduit à la détection de signaux dans le ventricule latéral et les régions environnantes du cerveau de la souris. La combinaison de cette procédure avec des technologies neuronales basées sur des circuits permettra aux scientifiques de mieux comprendre le contrôle du cerveau basé sur les circuits et le comportement apporté par les métabolites intestinaux.
Cette technique ouvre la voie aux chercheurs pour explorer le rôle du microbiote et des métabolites dans l’axe complexe du cerveau intestinal.
