Biz mükemmel teknik yardım ve balık bakımı için V. Zimmermann teşekkür ederim. 310000_120611: Bu çalışma İsviçre Ulusal Bilim Vakfı, hibe numarası ile desteklenmiştir.

1. Ekipman Set-up <ol><li> Cryoinjury gerçekleştirmek için kullanılan temel araç kriyoprob, paslanmaz çelik (Şekil 1A) yapılmış kalem gibi bir araçtır. Silindirik bir kol 40 mm uzunluğunda ve 8 mm arasında bir çapa sahiptir. Aplikatör ucu 6 mm uzunluğunda ve çapı 0,8 mm&#39;dir. Ucu ve kol arasında bileşke uzun 4 mm koni şeklindedir. Buna ek olarak, kriyoprob bir tutamak prosedürü sırasında aracı tutarken bir parmak donmaya önlemek için, bir plastik tüp ve bant ile izole edilmesi gerekir. </li><li> Kriyoterapi için gerekli diğer malzemeler stereomikroskopta, keskin forseps, mikro kesme yay makas ve bir plastik transferi pipet bulunmaktadır. Ayrıca balık transferi için balık ve bir plastik kaşık anestezi için bir ölçek hazırlar. </li><li> Ameliyat sırasında, balık onun ventral yüzü yukarı (Şekil 1B) ile nemli bir sünger yerleştirilir. Bir, istikrarlı bir prosedür içinde hayvan tutunUygun oluk elle sünger yardımıyla kesilmelidir. </li><li> Ameliyat sonrası balık transfer sistemi su ile bir tank hazırlayın. </li><li> 10 saniyelik geri sayım ve sonra otomatik olarak 24 saniyelik geri sayım ile ilk çift zamanlayıcı kurun. </li></ol> 2. Cryoinjury Prosedürü <ol><li> En az 3 dakika boyunca sıvı azot, 3-5 cm ucu daldırarak kriyoprob soğumaya. </li><li> Balık sırtını açar ve solungaçları neredeyse (yaklaşık 90 saniye) hareket durdurana kadar% 0,02 tricaine içinde immerging bir yetişkin zebrabalıkları uyutmak. </li><li> (Şekil 1B) baş aşağı bir balık tutmak için kesilmiştir nemli bir sünger bir plastik kaşık ile balık aktarın. Baskın olmayan elle forseps ile sürekli balık tutun. Görme kalbin posterior medial marjı bulmak ve delinme cilde düz iridektomi makas kullanın. (Şekil 1C). </li><li> Cu tarafından kalp üzerinde küçük (yaklaşık 2 mm) kesi yapmakcilt, kaslar (Şekil 1D) ile düz öne tting. Bu hayvan öldürecek gibi, kemikli brankiyal aparatı sayesinde kesmeyin. </li><li> Yavaşça yenerek ventriküle doğrudan erişim için makas ucuyla hipodermis gümüş epitel tabakası (Şekil 1E) gözyaşı. Bu irade ponksiyon kalp gibi vücut boşluğunda derin makas takmayın. Atan kalpte iyi görünür olmalı ve hiçbir aşırı kanamalı torakotomi (Şekil 1F) sırasında meydana gelmelidir. </li><li> 24 saniye ardından 10 saniye için belirlenen programlı zamanlayıcı başlayın. 10 saniye boyunca sıvı nitrojen gelen kriyoprob çıkarın. Hafifçe sallayarak kriyoprob üzerinde daha fazla azot olduğundan emin olun. Yanal göğüs (Şekil 1F) açmak için forseps kullanarak kesi yayıldı. </li><li> Zamanlayıcı halkalar 10 saniye sonra, pr ucu ile hemen fakat nazikçe ventrikül dokunmayıne-soğutmalı kriyoprob (Şekil 1G). </li><li> Zamanlayıcı halkalar 24 saniye sonra, doku kriyoprob serbest bırakmak için göğüs üzerine plastik bir pipet kullanarak sistem su 2-3 ml dökün ve sistem su tankına balık transferi. </li><li> Balık birkaç saniye sonra solunum yeniden başlatmanız gerekir ve daha sonra yüzme devam etmesi gerekir. Bu yaklaşık 45 saniye sonra nefes değilse, kendi başına nefes başlayana kadar plastik bir pipetle solungaçları içine su squirting tarafından hayvan uyarırlar. Deneyimlerimize göre, balık% 95 cerrahi hayatta ve tüm ölümlerin ameliyat günü ortaya çıkar. Bu kesiler kapatılması için gerekli olmayacaktır. </li></ol> 3. Kalp Toplama ve Fiksasyon <ol><li> Kalp, iki forseps, mikro kesme makasları ve nemli oluklu sünger sabitlemek için bir mikrosantrifüj tüp formalin 2% 1 mL hazırlayın. </li><li> Cryoinjury sonra, seçilen gün, 5 dakika boyunca% 0.1 &#39;in tricaine balık euthanize. </li><li> Yerleştirinkadar nemli, oluklu sünger içine balık ventral tarafta. Mikro diseksiyon makas ile brankiyal kıkırdak ile kalp üzerinde büyük bir (yaklaşık 4 mm) kesi olun. Forseps (Şekil 1H) ile yaygın kesi açın. </li><li> Bulbus arteriosus, ventrikül (Şekil 1 HI) anterior beyaz bir yapı çimdiklemek ve çekerek boşluğundan kalp çıkarın. Bir bütün parçalanmış kalp Şekil 1J ve Şekil 2A &#39;de gösterilmiştir. </li><li> % 2 formalin 1 ml ile mikrosantrifüj tüpüne 3 kupa kadar yerleştirin. Yavaşça tüp birkaç kez çevirin ve 4 bir gecede tutmak ° C </li></ol> 4. Kalp Montaj <ol><li> 5 dakika süreyle PBS içinde kalp çalkalayın. 4 ° C&#39;de ön soğutulması gerekir% 30 sukroz 10 ml içine kalpler aktarın ve hafifçe karıştırın. Numune, başlangıçta sukroz çözeltinin yüzeyinde yüzen gerekir. 4 ° C&#39;de 1 saat 20 dakika süreyle inkübe Devam SonraBu süre, kalpleri tüpün dibine batar. </li><li> Kuru buz ile bir kutu hazırlayın. Bir gömme kalıp alın ve kalıbın altındaki Ekim montaj orta bir 5 mm tabaka dökülür. </li><li> Forseps kalıp orta montaj OC T içine yerleştirin kalp ile. Stereomikroskop altında, üste doğru kalıp altındaki ventriküler apeks ve bulbus arteriosus ulaşmak için numunenin yönünü ayarlamak. </li><li> Kuru buz ile numune kalıpları yerleştirin. Montaj orta dondurmak başladığında, Ekim orta ile kalıp geri kalanı doldurmak ve tamamen donmasına izin. Kesit daha önce -80 ° C sıcaklıkta, en az 1 saat boyunca kalıp tutmak. Donmuş örnek -80 birçok ay boyunca saklanabilir ° C </li></ol> 5.. Kesit Kalpler <ol><li> 16 um arasında bir kesme boyutu, -24 ° C arasında bir sıcaklıkta haznesi ve -22 ° C&#39;de numunelerin sıcaklığı ile bir kriyostat ayarlama </li><li> Ile dondurulmuş blok yerleştirinkriyostat olarak örnek ve blok alt paralel kesme başlamak için yönünü düzeltmek. </li><li> Bir blok başına altı SuperFrost-artı slaytlar hazırlamak ve 1 ila 6 bunları numaralamak. Doku ulaşılana kadar kesme başlatın ve bir traş bıçağı ile numune etrafında blok kırpın. </li><li> 6 elde etmek için bir kalp çoğaltır, slayt 1 ilk bölümünde, slayt 2 ikinci bölümünde, slayt 3 üçüncü sürebilir, vb sonra slayt 6 Altıncı bölümde yer, slayt 1 ile yeniden başlatın ve kadar devam Tüm organ kesilir. Slayt üzerinde yaklaşık 8 bölümden iki satır (Şekil 3) toplayın. </li><li> Oda sıcaklığında 1 saat boyunca izin slaytlar kuru. -20 ° C&#39;de ağzı sıkıca kapalı kutularda 1 yıl kadar için saklayın </li></ol> 6. Temsilcisi Sonuçlar Bu protokolü takip Temsilcisi kardiyak yaralanma 4 dpci az disseke bütün kalpleri gösterilir (gün sonrası cryoinjury; Şekil 2D-F). V içinin vivo miyokardiyal doku isualize, kardiyak spesifik cmlc-2 promotör 11,12 kontrolü altında EGFP ve nükleer DsRed2 ifade transjenik balık kullanılır. EGFP ve DsRed2 floresan sinyallerin yokluğu apikal-lateral ventrikül duvar boyunca bir disk şeklinde infarkt bölgesi sınırları belirgin. Dokusunun hücresel ve moleküler analizleri gerçekleştirmek için, kalpleri sabit ve bir kriyostat ile kesitler alındı. Transversal kalp bölümleri ardışık ile temsili bir kayar Şekil 3 &#39;de gösterilmiştir. Bölümleri çeşitli yöntemler (Şekil 4) ile analiz edilebilir. Skar kalbe karşı rejenerasyon kapsamını belirlemek için, farklı şekilde kardiyak ve fibrotik dokuların 9 etiketler Asit Fuchsin Turuncu-G (AFOG) boyama kullanarak histolojik analizi yapıldı. Gen ekspresyon analizleri situ hibridizasyon prosedürü göre elde edildi <sup&gt; 13. Işaretleyici proteinlerin dağılımını saptamak için, spesifik antikorlar 9 kullanılarak, bağışıklık testi uygulamıştır. Çeşitli boyama işlemleri bir arada kardiyak rejenerasyon aşağıdaki cryoinjury yer moleküler ve hücresel mekanizmaların tanımlanmasına yol açar. <img alt="Şekil 1" src="/files/ftp_upload/3666/3666fig1.jpg" /> Şekil 1. Yetişkin zebrabalıkları içinde ventrikül cryoinjury indüklenmesi. Kriyoprob (A) bir fotoğraf. (B) yetişkin zebrabalıkları kadar olan ventral yüzü sünger yarık yerleştirilir. Kalp erişmek için (CF) Göğüs kesi. (C) deri ve kas yoluyla küçük bir kesik iki göğüs yüzgeçlerinin (kırmızı çizgi) arasında yapılır. (D) makas kırmızı ok takip deri kesmek için kesi eklenir. (E) deri altında, gümüş hipodermis ince bir tabaka (mavi kesikli çizgi ile çevrili) yavaşça kalp erişmek için açılır. (F) kesi ile yayılırforseps ve dayak ventrikül (yeşil ok) cryoinjury için erişilebilir. (G) soğuk kriyoprob yavaşça kalp dokunmak için göğüs içine yerleştirilir. (HJ) Kalp koleksiyonu. (H) Bir derin ve uzun kesi perikard boşluğu erişmek için göğüs brankiyal kemerleri ile yapılır. İki kalp yapıları görülebilir: bulbus arteriosus (beyaz ok) ve ventrikül (yeşil ok). (I) bulbus arteriosus forseps ile tutun ve vücut boşluğundan dışarı çekilir. (J) tamamı kalp gövdesinin den kesilip çıkarılan edilir. <img alt="Şekil 2" src="/files/ftp_upload/3666/3666fig2.jpg" /> Şekil 2. Temsilcisi kontrolü ve EGFP ve kardiyomiyositlerde nükleer DsRed2 ifade yetişkin transgenik zebrabalıkları diseke cryoinjured kalpler. (AC) kalp yaralanmamış. (A) karanlık alan aydınlatma ventrikül gösterir atriyuma ventriküle bağlantılı olduğu (V), bulbus arteriosus (Ba, beyaz) ve vanalar (Va). T (B ve C) Floresan görüntüleri<html> O sağlam ventrikül ekran EGFP ve kardiyomiyositlerde DsRed2 ifade. 4 gün sonrası cryoinjury at (DF) Kalp (4 dpci) (D) karanlık alan aydınlatma bir disk şeklinde infarkt (sarı kesikli çizgi) açığa çıkarır. (EF) kardiyomiyosit işaretleri EGFP ve DsRed2 hasarlı miyokard (kesikli çizgi ile çevrili) gösteren, infarkt alanında algılanmaz. <img alt="Şekil 3" src="/files/ftp_upload/3666/3666fig3.jpg" /> Şekil 3. Kalp Kesit. Kalp üst kısmına doğru kalp (1 ve 2, kırmızı) (yeşil 3 ve 4) alt başlayarak enine bölüm çizime ile (A) Tam kalp. (B) AFOG (Asit Fuchsin Turuncu-G) ile boyanarak ardışık kesitler serisi ile bir slayt fotoğrafçılığı. Birinci bölüm (1 ve 2, beyaz kareler) ventriküler Apex içerir, ve kalp (3 ve 4, yeşil kareler) ile son bölümler bulbusu arteriozus içermektedir. iles/ftp_upload/3666/3666fig4.jpg &quot;/&gt; Analizi Şekil 4. Örnekler 7 gün sonrası cryoinjury az kalp bölümlerde gerçekleştirilir. Turuncu (A) AFOG (Asit Fuchsin Turuncu-G) boyama etiketler sağlıklı kas hücreleri, kırmızı, mavi ve fibrin içinde kollajen içeren skar dokusu. (B) ventriküler miyozin ağır zincir (vmhc) in situ hibridizasyon olarak mRNA sağlam miyokard (mavi boyama) görüntüler. Yaralı dokuya kardiyak gen transkript (kırmızı kesikli çizgi) yoksundur. (C) tropomiyozin ve Immunoassaying (yeşil) sağlam kardiyomiyositler değil, hasarlı doku (kesikli çizgi ile çevrili) etiketler. DAPI (mavi) lekeler tüm hücrelerin çekirdekleri. (D) çekirdeklerinde Genetik etiketli kardiyomiyositler ekspres DsRed2 (kırmızı). DAPI (mavi) tüm çekirdeklerin etiketler. Enfarkt bölgesi DsRed2-pozitif hücrelerin (beyaz kesikli çizgi) içermez.

<ol>
	<li>Laflamme, M. A., Murry, C. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Heart+regeneration.">Heart regeneration.</a> Nature. 473, 326-335 (2011).</li><li>Singh, B. N., Koyano-Nakagawa, N., Garry, J. P., Weaver, C. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Heart+of+newt:+a+recipe+for+regeneration.">Heart of newt: a recipe for regeneration.</a> J. Cardiovasc. Transl. Res. 3, 397-409 (2010).</li><li>Poss, K. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Getting+to+the+heart+of+regeneration+in+zebrafish.">Getting to the heart of regeneration in zebrafish.</a> Semin. Cell Dev. Biol. 18, 36-45 (2007).</li><li>Ausoni, S., Sartore, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=From+fish+to+amphibians+to+mammals:+in+search+of+novel+strategies+to+optimize+cardiac+regeneration.">From fish to amphibians to mammals: in search of novel strategies to optimize cardiac regeneration.</a> J. Cell Biol. 184, 357-364 (2009).</li><li>Borchardt, T., Braun, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cardiovascular+regeneration+in+non-mammalian+model+systems:+what+are+the+differences+between+newts+and+man.">Cardiovascular regeneration in non-mammalian model systems: what are the differences between newts and man.</a> Thrombosis and haemostasis. 98, 311-318 (2007).</li><li>Bos, E. J. v. a. n. d. e. n., Mees, B. M., de Waard, M. C., de Crom, R., Duncker, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+novel+model+of+cryoinjury-induced+myocardial+infarction+in+the+mouse:+a+comparison+with+coronary+artery+ligation.">A novel model of cryoinjury-induced myocardial infarction in the mouse: a comparison with coronary artery ligation.</a> Am. J. Physiol. Heart. Circ. Physiol. 289, H1291-H1300 (2005).</li><li>van Amerongen, M. J., Harmsen, M. C., Petersen, A. H., Popa, E. R., van Luyn, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cryoinjury:+a+model+of+myocardial+regeneration.">Cryoinjury: a model of myocardial regeneration.</a> Cardiovasc. Pathol. 17, 23-31 (2008).</li><li>Schnabel, K., Wu, C. C., Kurth, T., Weidinger, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regeneration+of+cryoinjury+induced+necrotic+heart+lesions+in+zebrafish+is+associated+with+epicardial+activation+and+cardiomyocyte+proliferation.">Regeneration of cryoinjury induced necrotic heart lesions in zebrafish is associated with epicardial activation and cardiomyocyte proliferation.</a> PLoS ONE. 6, (2011).</li><li>Chablais, F., Veit, J., Rainer, G., Jazwinska, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+zebrafish+heart+regenerates+after+cryoinjury-induced+myocardial+infarction.">The zebrafish heart regenerates after cryoinjury-induced myocardial infarction.</a> BMC Dev. Biol. 11, 21 (2011).</li><li>Gonz&#225;lez-Rosa, J. M., Martin, V., Peralta, M., Torres, M., Mercader, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Extensive+scar+formation+and+regression+during+heart+regeneration+after+cryoinjury+in+zebrafish.">Extensive scar formation and regression during heart regeneration after cryoinjury in zebrafish.</a> Development. 138, 1663-1674 (2011).</li><li>Rottbauer, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reptin+and+pontin+antagonistically+regulate+heart+growth+in+zebrafish+embryos.">Reptin and pontin antagonistically regulate heart growth in zebrafish embryos.</a> Cell. 111, 661-672 (2002).</li><li>Burns, C. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-throughput+assay+for+small+molecules+that+modulate+zebrafish+embryonic+heart+rate.">High-throughput assay for small molecules that modulate zebrafish embryonic heart rate.</a> Nature chemical biology. 1, 263-264 (2005).</li><li>Chablais, F., Jazwinska, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=IGF+signaling+between+blastema+and+wound+epidermis+is+required+for+fin+regeneration.">IGF signaling between blastema and wound epidermis is required for fin regeneration.</a> Development. 137, 871-879 (2010).</li><li>Baust, J. G., Gage, A. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+molecular+basis+of+cryosurgery.">The molecular basis of cryosurgery.</a> BJU Int. 95, 1187-1191 (2005).</li><li>Whelan, R. S., Kaplinskiy, V., Kitsis, R. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+death+in+the+pathogenesis+of+heart+disease:+mechanisms+and+significance.">Cell death in the pathogenesis of heart disease: mechanisms and significance.</a> Annual review of physiology. 72, 19-44 (2010).</li></ol>

Hayvanlar üzerinde yapılan deneysel araştırma Fribourg kanton veteriner dairesi tarafından onaylandı.

Cryoinjury soğuk 14 arasında hassas bir uygulama tarafından kontrol edilen doku hasarı olarak tanımlanır. Direkt termal şok proteini tahrip edilmesi ve plazma zarı yırtması hücre içi sıvı kristal buz oluşumu hücreleri yok eder. Sonuç olarak, hücreler yaralı apoptoz ve nekroz 14 ait işlemlerde ölmektedir. Bu hücre ölümü mekanizmalarının her ikisi de miyokardiyal enfarktüs sonrası 15 doku kaybına neden olduğu gösterilmiştir. Böylece, cryoinjury kalp enfarktüsü indüklenmesi uygun bir modeli gösterir. Çeşitli çalışmalar fare, sıçan, tavşan ve domuz 6,7 dahil olmak üzere çeşitli memeliler, bu iyi oldu yöntemi bildirdi. Zebra balığı yılında cryoinjury protokol adaptasyonu farklı türler arasında infarkt cevabı üzerine daha karşılaştırmalı bir tartışma sağlar. Diğer iki grup bağımsız yetişkin zebrabalıkları kalp için cryoinjury prosedür geliştirmiştir. Büyük farklar sur vardırgery yöntemleri, araçları türü ve uygulanan donma süresi. González-Rosa ve ark. Tarafından yapılan çalışmada, perikard dokusu yırtılması yerine kesilerek açıldı. Onlar çözülme 10 görülebiliyor kadar birkaç saniye için kalp dondurmak için sıvı azot içinde ön-soğutulur bir naylon tüp ile bağlantılı 0.3 mm bakır filament kullanılır. Tarafından çalışmada Schnabel ve ark., Onun çapı 2 mm&#39;lik bir sivri ucu ile 20 mm uzunlukta, kuru buz, konik bir parçası 10 saniye için kalp 8 temas etmesine kullanıldı. İki grup miyokardın ölümü ile ventriküler hasar aldı. Bizim yöntemin avantajı daha iyi bir memeli sistemlerde görülen erken enfarkt iyileştirici yanıtları taklit kolajen-zengin yara, bir daha yeniden üretilebilir çökelme olup. Zebra balığı yılında cryoinjury işlem sırasında kritik adım altta yatan bir kalp delinmesiyle olmadan cilt ve perikardiyal kese ile bir kesi yapıyor. Bir doğru performed cerrahisi küçük kanamalara sebep olur. Bol kanama makasla ventrikül istemeden ponksiyon gösterir. Bu gibi durumlarda, hayvanlar deneyden geri çekilmelidir. Kalp delinmesiyle önlemek amacıyla, makas noktası deriye sığ bir açıyla amaçlamalıdır. Tekrarlanabilir bir yaralanma oluşturmak için bir diğer önemli yönü optimal kesin bir süre için ventrikül üzerindeki soğuk kriyoprob tam konumlandırma. Çok kısa donma süresi biraz hücre ölümü ile inflamasyona neden olur. Uzun süreli donma, diğer yandan, hayvanların geliştirilmiş ölüm yol açabilir kalp büyük zarar görmesine neden olurlar. Bu uygun bir kez 2 cm uzunluğunda yetişkin zebrabalıkları için 23-26 saniye arasında donmuş halde aralığında tutmak için ventrikül tespit ve hayvanların boyutuna bağımlı olarak değişebilir. Bizim protokolü çok basit ve hızlı olduğu için, herhangi bir sınırlama yoktur, deneysel olarakYeterli biyolojik tekrarlamalı elde etmek için hayvanların yeterli sayıda tabi olarak haklı çıkarmaktadır. Kriyocerrahi tedavisi çok iyi hayvanlar tarafından tolere edilmektedir. Cryoinjury sonra farklı zaman noktalarında kalplerin Koleksiyon rejeneratif sürecinde MEB&#39;in detaylı karakterizasyonu sağlar. Cryoinjured kalplerin deneysel analizi in situ hibridizasyon ile gen transkripsiyon görselleştirme, 2) immünofloresan boyama, 3 protein dağılımının tespiti) farklı yapıların histolojik görüntüleme) 1 içerebilir. Zebra balığı miyokard infarktüsü sonrası önemli iyileşme süreçleri anlamak rejeneratif biyoloji alanında etkileyecektir. Ayrıca, rejeneratif tıpta yeni tedavi yaklaşımları tasarımı için faydalı olabilir.

<table border="1"><tbody><tr><td> Reaktif Adı </td><td> Şirket </td><td> Katalog numarası </td></tr><tr><td> Mikro kesme yay makas </td><td> Roboz Cerrahi Alet A.Ş. </td><td> RS-5602 </td></tr><tr><td> Tricaine </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> E10521 </td></tr><tr><td> Formaldehit ~% 36 </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> 47630 </td></tr><tr><td> Sakaroz </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> 84100 </td></tr><tr><td> Doku-Tek Ekim bileşik </td><td> Sakura Finetek </td><td> 4583 </td></tr><tr><td> SuperFrost Plus Slaytlar </td><td> Fisher Scientific </td><td> 12-550-15 </td></tr><tr><td> Peel-A-Way Tek gömülmesi Kalıplar - Kesik Kalıpları T8 </td><td> Polyscience, Inc </td><td> 18985 </td></tr></tbody></table>

induction of myocardial infarction in adult zebrafish using cryoinjury

Memeli kalp gibi miyokard enfarktüsü 1 gibi akut bir yaralanma sonrası önemli bir yenilenme yeteneğinde değildir. Buna karşılık, urodele amfibiler ve teleost balık çok az veya hiç ömrü boyunca 2,3 skarlasma ile kardiyak rejenerasyon için muazzam bir kapasite korumak. Sadece olmayan bazı memeli omurgalılar 4,5 kalıntı dokulardan tam bir organı yeniden neden bilinmemektedir. Farklı türlerde rejeneratif yanıtları arasındaki moleküler ve hücresel farklılıkları anlamak için, akut yaralanmalar uyandırmaya benzer yaklaşımlar kullanmak gerekir. Memelilerde, kardiyak onarım incelemek için en sık kullanılan model cryoinjury 6,7 sonrası koroner arter veya doku yıkımının bir ligasyonu sonrası akut iskemi olmuştur. Newts ve zebrabalıkları içinde kardiyak rejenerasyon ağırlıklı ventriküler apeks 2,3 kısmi rezeksiyon sonrası incelenmiştir. Son zamanlarda, çeşitli gruplar establ varyetişkin zebrabalıkları 8-10 cryoinjury tekniğin son bulur. Bu memeli ve non-memeli türlerinden elde edilen sonuçların karşılaştırmalı bir tartışma sağlar, çünkü bu yöntem büyük bir potansiyele sahiptir. Burada, cryoinjury tarafından zebrafish ventrikül tekrarlanabilir bir disk-şekilli enfarkt indüklemek için bir yöntem sunulmaktadır. Bu yaralanma modeli ventrikül duvarının kardiyomiyositlerin yaklaşık% 20 masif hücre ölümü ile sonuçlanan hızlı donma-çözülme doku dayanmaktadır. Öncelikle, küçük bir kesi kalp erişmek için iridektomi makasla göğüs ile yapılmıştır. Ventrikül duvar doğrudan 23-25 ​​saniye sıvı azot içerisinde ön soğutma, paslanmaz çelik kriyoprob için başvuran tarafından donduruldu. Oda sıcaklığında, kalp, balık suyun dondurulması durdurmak için kriyoprob ucu üzerine bırakıldı. Prosedür iyi% 95 hayatta kalma oranı ile, hayvanlar tarafından tolere edilmektedir. Rejeneratif süreci karakterize etmek için kalpleri vardıcryoinjury sonra farklı günde toplandı ve sabitlenir. Daha sonra, numune cryosectioning için gömülü edildi. Bölümleri ile slaytlar situ hibridizasyon ve immünfloresan, histolojik analiz için işlendi. Bu taahhütname zebrabalıkları içinde rejeneratif plastisite için gerekli, ve kardiyak rejenerasyon makine yeni bir anlayış sağlamak olan faktörler anlayışımızı geliştirir. Zebra balığı kalp rejenerasyon kavramsal bir anlayış ve moleküler gelişim biyolojisi ve rejeneratif tıp hem de etkileyecektir.

Watch this Scientific Journal Video about Induction of Myocardial Infarction in Adult Zebrafish Using Cryoinjury at JoVE.com

Induction of Myocardial Infarction in Adult Zebrafish Using Cryoinjury

Zebra balığı omurgalılarda kalp rejenerasyon mekanizmaları incelemek için değerli bir modeli temsil eder. Burada, cryoinjury kullanarak yetişkin zebrabalıkları yılında bir kalp infarkt indüksiyonu için bir protokol mevcut. Memeli enfarkt gözlenen benzer ventriküler duvarın 20% içinde büyük hücre ölümü, bu yöntem sonuçlar,.

Yetişkin Zebra balığı Myokard İnfarktüsü İndüksiyon Cryoinjury kullanma

The mammalian heart is incapable of significant regeneration following an acute injury such as myocardial infarction1. By contrast, urodele amphibians and ...

induction-of-myocardial-infarction-in-adult-zebrafish-using-cryoinjury

Research

JoVE Journal

Medicine

22.1K Görüntüleme.  University of Fribourg, Fribourg, Switzerland. Zebra balığı omurgalılarda kalp rejenerasyon mekanizmaları incelemek için değerli bir modeli temsil eder. Burada, cryoinjury kullanarak yetişkin zebrabalıkları yılında bir kalp infarkt indüksiyonu için bir protokol mevcut. Memeli enfarkt gözlenen benzer ventriküler duvarın 20% içinde büyük hücre ölümü, bu yöntem sonuçlar,.

Video: Induction of Myocardial Infarction in Adult Zebrafish Using Cryoinjury

Acute Myocardial Infarction in Rats

With heart failure leading the cause of death in the USA (Hunt), biomedical research is fundamental to advance medical treatments for cardiovascular diseases. Animal models that mimic human cardiac disease, such as myocardial infarction (MI) and ischemia-reperfusion (IR) that induces heart failure as well as pressure-overload (transverse aortic constriction) that induces cardiac hypertrophy and heart failure (Goldman and Tarnavski), are useful models to study cardiovascular disease. In particular, myocardial ischemia (MI) is a leading cause for cardiovascular morbidity and mortality despite controlling certain risk factors such as arteriosclerosis and treatments via surgical intervention (Thygesen). Furthermore, an acute loss of the myocardium following myocardial ischemia (MI) results in increased loading conditions that induces ventricular remodeling of the infarcted border zone and the remote non-infarcted myocardium. Myocyte apoptosis, necrosis and the resultant increased hemodynamic load activate multiple biochemical intracellular signaling that initiates LV dilatation, hypertrophy, ventricular shape distortion, and collagen scar formation. This pathological remodeling and failure to normalize the increased wall stresses results in progressive dilatation, recruitment of the border zone myocardium into the scar, and eventually deterioration in myocardial contractile function (i.e. heart failure). The progression of LV dysfunction and heart failure in rats is similar to that observed in patients who sustain a large myocardial infarction, survive and subsequently develops heart failure (Goldman). The acute myocardial infarction (AMI) model in rats has been used to mimic human cardiovascular disease; specifically used to study cardiac signaling mechanisms associated with heart failure as well as to assess the contribution of therapeutic strategies for the treatment of heart failure. The method described in this report is the rat model of acute myocardial infarction (AMI). This model is also referred to as an acute ischemic cardiomyopathy or ischemia followed by reperfusion (IR); which is induced by an acute 30-minute period of ischemia by ligation of the left anterior descending artery (LAD) followed by reperfusion of the tissue by releasing the LAD ligation (Vasilyev and McConnell). This protocol will focus on assessment of the infarct size and the area-at-risk (AAR) by Evan's blue dye and triphenyl tetrazolium chloride (TTC) following 4-hours of reperfusion; additional comments toward the evaluation of cardiac function and remodeling by modifying the duration of reperfusion, is also presented. Overall, this AMI rat animal model is useful for studying the consequence of a myocardial infarction on cardiac pathophysiological and physiological function.

The rat model of acute myocardial infarction (AMI) is useful to study the consequence of a MI on cardiac pathophysiological and physiological function.

Sıçanlarda Akut Miyokard Enfarktüsü

With heart failure leading the cause of death in the USA (Hunt), biomedical research is fundamental to advance medical treatments for cardiovascular ...

Tıp

MRI and PET in Mouse Models of Myocardial Infarction

Myocardial infarction is one of the leading causes of death in the Western world. The similarity of the mouse heart to the human heart has made it an ideal model for testing novel therapeutic strategies.
In vivo magnetic resonance imaging (MRI) gives excellent views of the heart noninvasively with clear anatomical detail, which can be used for accurate functional assessment. Contrast agents can provide basic measures of tissue viability but these are nonspecific. Positron emission tomography (PET) is a complementary technique that is highly specific for molecular imaging, but lacks the anatomical detail of MRI. Used together, these techniques offer a sensitive, specific and quantitative tool for the assessment of the heart in disease and recovery following treatment.
In this paper we explain how these methods are carried out in mouse models of acute myocardial infarction. The procedures described here were designed for the assessment of putative protective drug treatments. We used MRI to measure systolic function and infarct size with late gadolinium enhancement, and PET with fluorodeoxyglucose (FDG) to assess metabolic function in the infarcted region. The paper focuses on practical aspects such as slice planning, accurate gating, drug delivery, segmentation of images, and multimodal coregistration. The methods presented here achieve good repeatability and accuracy maintaining a high throughput.

We describe how to perform MRI and PET imaging of the mouse heart. The protocol is tailored to assess treatment efficacy in models of myocardial infarction and heart failure.

Myocardial infarction is one of the leading causes of death in the Western world. The similarity of the mouse heart to the human heart has made it an ...

Myocardial Infarction and Functional Outcome Assessment in Pigs

Introduction of newly discovered cardiovascular therapeutics into first-in-man trials depends on a strictly regulated ethical and legal roadmap. One important prerequisite is a good understanding of all safety and efficacy aspects obtained in a large animal model that validly reflect the human scenario of myocardial infarction (MI). Pigs are widely used in this regard since their cardiac size, hemodynamics, and coronary anatomy are close to that of humans. Here, we present an effective protocol for using the porcine MI model using a closed-chest coronary balloon occlusion of the left anterior descending artery (LAD), followed by reperfusion. This approach is based on 90 min of myocardial ischemia, inducing large left ventricle infarction of the anterior, septal and inferoseptal walls. Furthermore, we present protocols for various measures of outcome that provide a wide range of information on the heart, such as cardiac systolic and diastolic function, hemodynamics, coronary flow velocity, microvascular resistance, and infarct size. This protocol can be easily tailored to meet study specific requirements for the validation of novel cardioregenerative biologics at different stages (i.e. directly after the acute ischemic insult, in the subacute setting or even in the chronic MI once scar formation has been completed). This model therefore provides a useful translational tool to study MI, subsequent adverse remodeling, and the potential of novel cardioregenerative agents.

This protocol describes the porcine myocardial infarction (MI) model using a 90 min closed-chest coronary balloon occlusion of the left anterior descending artery (LAD), followed by reperfusion. Furthermore, the protocol for several outcome parameters, such as cardiac function, hemodynamics, microvascular resistance, and infarct size, are also presented.

Domuzlar miyokard enfarktüsü ve Fonksiyonel Sonuç Değerlendirmesi

Introduction of newly discovered cardiovascular therapeutics into first-in-man trials depends on a strictly regulated ethical and legal roadmap. One ...

Minimal Invasive Surgical Procedure of Inducing Myocardial Infarction in Mice

Myocardial infarction still remains the main cause of death in western countries, despite considerable progress in the stent development area in the last decades. For clarification of the underlying mechanisms and the development of new therapeutic strategies, the availability of valid animal models are mandatory. Since we need new insights into pathomechanisms of cardiovascular diseases under in vivo conditions to combat myocardial infarction, the validity of the animal model is a crucial aspect. However, protection of animals are highly relevant in this context. Therefore, we establish a minimally invasive and simple model of myocardial infarction in mice, which assures a high reproducibility and survival rate of animals. Thus, this models fulfils the requirements of the 3R principle (Replacement, Refinement and Reduction) for animal experiments and assure the scientific information needed for further developing of therapeutical strategies for cardiovascular diseases.

A highly reproducible model for myocardial infarction in mice with minimal invasive manipulations is described. The model can be easily performed, resulting in a high reproducibility and survival rate. Thus, the described model will reduce the number of required animals as requested by the 3R principle (Replacement, Refinement and Reduction).

Farelerde Miyokard İnfarktüsü Oluşturan Minimal İnvaziv Cerrahi Prosedür

Myocardial infarction still remains the main cause of death in western countries, despite considerable progress in the stent development area in the last ...

Primary Outcome Assessment in a Pig Model of Acute Myocardial Infarction

Mortality after acute myocardial infarction remains substantial and is associated with significant morbidity, like heart failure. Novel therapeutics are therefore required to confine cardiac damage, promote survival and reduce the disease burden of heart failure. Large animal experiments are an essential part in the translational process from experimental to clinical therapies. To optimize clinical translation, robust and representative outcome measures are mandatory. The present manuscript aims to address this need by describing the assessment of three clinically relevant outcome modalities in a pig acute myocardial infarction (AMI) model: infarct size in relation to area at risk (IS/AAR) staining, 3-dimensional transesophageal echocardiography (TEE) and admittance-based pressure-volume (PV) loops. Infarct size is the main determinant driving the transition from AMI to heart failure and can be quantified by IS/AAR staining. Echocardiography is a reliable and robust tool in the assessment of global and regional cardiac function in clinical cardiology. Here, a method for three-dimensional transesophageal echocardiography (3D-TEE) in pigs is provided. Extensive insight into cardiac performance can be obtained by admittance-based pressure-volume (PV) loops, including intrinsic parameters of myocardial function that are pre- and afterload independent. Combined with a clinically feasible experimental study protocol, these outcome measures provide researchers with essential information to determine whether novel therapeutic strategies could yield promising targets for future testing in clinical studies.

Reliable and accurate outcome assessment is the key for translation of preclinical therapies into clinical treatment. The current paper describes how to assess three clinically relevant primary outcome parameters of cardiac performance and damage in a pig acute myocardial infarction model.

Akut Miyokard İnfarktüsü bir Domuz Modeli İlköğretim Sonuç Değerlendirmesi

Mortality after acute myocardial infarction remains substantial and is associated with significant morbidity, like heart failure. Novel therapeutics are ...

Myocardial Infarction in Neonatal Mice, A Model of Cardiac Regeneration

Myocardial infarction induced by coronary artery ligation has been used in many animal models as a tool to study the mechanisms of cardiac repair and regeneration, and to define new targets for therapeutics. For decades, models of complete heart regeneration existed in amphibians and fish, but a mammalian counterpart was not available. The recent discovery of a postnatal window during which mice possess regenerative capabilities has led to the establishment of a mammalian model of cardiac regeneration. A surgical model of mammalian cardiac regeneration in the neonatal mouse is presented herein. Briefly, postnatal day 1 (P1) mice are anesthetized by isoflurane and placed on an ice pad to induce hypothermia. After the chest is opened, and the left anterior descending coronary artery (LAD) is visualized, a suture is placed around the LAD to inflict myocardial ischemia in the left ventricle. The surgical procedure takes 10-15 min. Visualizing the coronary artery is crucial for accurate suture placement and reproducibility. Myocardial infarction and cardiac dysfunction are confirmed by triphenyl-tetrazolium chloride (TTC) staining and echocardiography, respectively. Complete regeneration 21 days post myocardial infarction is verified by histology. This protocol can be used to as a tool to elucidate mechanisms of mammalian cardiac regeneration after myocardial infarction.

This protocol describes a highly reproducible model of cardiac regeneration by surgical induction of myocardial infarction in the left ventricle of postnatal day 1 mice. The method involves induction of hypothermic anesthesia and ligation of the left anterior descending coronary artery.

Yenidoğan Farelerde Miyokard Enfarktüsü, Kalp Rejenerasyon Bir Model

Myocardial infarction induced by coronary artery ligation has been used in many animal models as a tool to study the mechanisms of cardiac repair and ...

Real-time Pressure-volume Analysis of Acute Myocardial Infarction in Mice

Acute myocardial infarction can lead to acute heart failure and cardiogenic shock. The evaluation of hemodynamics is critical for the evaluation of any potential therapeutic approach directed against acute left ventricular (LV) dysfunction. Current imaging modalities (e.g., echocardiography and magnetic resonance imaging) have several limitations since data on LV pressure cannot directly be measured. LV catheterization in mice undergoing coronary artery occlusion could serve as a novel method for a real-time evaluation of LV function.
At the beginning of the procedure, mice were anesthetized followed by endotracheal intubation. For LV catheterization, the right carotid artery was exposed via middle-neck incision. The catheter was introduced and placed into the LV cavity. Left thoracotomy was conducted and the left main coronary artery (LCA) was ligated. To induce reperfusion, the suture was released after 45 min. Pressure-volume data was recorded at all times.
Ligation of the LCA caused a decrease in LV systolic function as evidenced by a 30% reduction in stroke volume, LV ejection fraction (EF), and cardiac output. Maximum dP/dt as a parameter for LV contractility was also significantly reduced and diastolic function was severely impaired (minimum dP/dt -40%). Reperfusion over a period of 20 min did not lead to a complete recovery of LV function.
Real-time pressure-volume analysis served as a valid procedure for monitoring cardiac function during acute myocardial infarction in mice. Maintaining stable anesthesia and a standardized surgical approach was crucial to ensure valid results. As the early phase of acute myocardial infarction is critical for morbidity and mortality, the delineated method could be beneficial for preclinical evaluation of new strategies for cardioprotection.

Acute myocardial infarction in mice induces acute but incompletely characterized changes in left ventricular (LV) function. LV catheterization in mice undergoing coronary artery occlusion serves as a novel method for a real-time evaluation of LV function.

Akut miyokard infarktüsünde farelerde gerçek zamanlı basınç-hacim Analizi

Acute myocardial infarction can lead to acute heart failure and cardiogenic shock. The evaluation of hemodynamics is critical for the evaluation of any ...

Digital PCR for Quantifying Circulating MicroRNAs in Acute Myocardial Infarction and Cardiovascular Disease

Circulating serum microRNAs (miRNAs) have shown promise as biomarkers for the cardiovascular disease and acute myocardial infarction (AMI), being released from the cardiovascular cells into the circulation. Circulating miRNAs are highly stable and can be quantified. The quantitative expression of specific miRNAs can be linked to the pathology, and some miRNAs show high tissue and disease specificity. Finding novel biomarkers for cardiovascular diseases is of importance for medical research. Quite recently, digital polymerase chain reaction (dPCR) has been invented. dPCR, combined with fluorescent hydrolysis probes, enables specific direct absolute quantification. dPCR exhibits superior technical qualities, including a low variability, high linearity, and high sensitivity compared to the quantitative polymerase chain reaction (qPCR). Thus, dPCR is a more accurate and reproducible method for directly quantifying miRNAs, particularly for the use in large multi-center cardiovascular clinical trials. In this publication, we describe how to effectively perform digital PCR in order to assess the absolute copy number in serum samples.

Circulating microRNAs have shown promise as biomarkers for cardiovascular diseases and acute myocardial infarctions. In this study, we describe a protocol for miRNA extraction, reverse transcription, and digital PCR for the absolute quantification of miRNAs in the serum of patients with cardiovascular disease.

Akut miyokard infarktüsü ve kardiyovasküler hastalık mikroRNA'lar dolaşan miktarının için dijital PCR

Circulating serum microRNAs (miRNAs) have shown promise as biomarkers for the cardiovascular disease and acute myocardial infarction (AMI), being released ...

Murine Myocardial Infarction Model using Permanent Ligation of Left Anterior Descending Coronary Artery

Myocardial infarction (MI) and acute coronary diseases are among the most prominent causes of death in population with western lifestyle. The murine models of MI with permanent ligation of left-anterior descending (LAD) coronary artery closely mimics MI in humans. Murine models benefit from the extensive genetic engineering available nowadays. Here we propose a reproducible murine surgical model of myocardial infarction by permanent LAD coronary ligation. Our technique comprises anesthesia with ketamine/xylazine that can be rapidly reversed by administration of an antagonist, intubation without tracheotomy for mechanical-assisted ventilation, ventilation with application of extrinsic positive end-expiratory pressure (PEEP) to avoid alveolar collapse, a thoracotomy method limiting to the minimum surgical lesions made to skeletal muscles, and lung inflation without thoracentesis. This method is sparsely invasive, reproducible and reduces post-surgery mortality and complications.

Herein we describe a surgical procedure showing how to achieve permanent ligation of the left-anterior descending coronary artery in mice. This model is of high relevance to investigate the pathophysiology of myocardial infarction and the concomitant biological processes.

Sol Anterior İnen Koroner Arterin Kalıcı Ligasyonu ile Murine Miyokard Enfarktüsü Modeli

Myocardial infarction (MI) and acute coronary diseases are among the most prominent causes of death in population with western lifestyle. The murine ...

A Cryoinjury Model to Study Myocardial Infarction in the Mouse

The use of animal models is essential for developing new therapeutic strategies for acute coronary syndrome and its complications. In this article, we demonstrate a murine cryoinjury infarct model that generates precise infarct sizes with high reproducibility and replicability. In brief, after intubation and sternotomy of the animal, the heart is lifted from the thorax. The probe of a handheld liquid nitrogen delivery system is applied onto the myocardial wall to induce cryoinjury. Impaired ventricular function and electrical conduction can be monitored with echocardiography or optical mapping. Transmural myocardial remodeling of the infarcted area is characterized by collagen deposition and loss of cardiomyocytes. Compared to other models (e.g., LAD-ligation), this model utilizes a handheld liquid nitrogen delivery system to generate more uniform infarct sizes.

This article demonstrates a model to study cardiac remodeling after myocardial cryoinjury in mice.

Farede Miyokard Enfarktüsü Çalışması İçin Kriyoyaralanma Modeli

The use of animal models is essential for developing new therapeutic strategies for acute coronary syndrome and its complications. In this article, we ...