Finanziato dalla NSF (0.854.551).

1. Pre-sperimentali Preparazioni <ol><li> Preparare sei soluzioni (cfr. tabella 1 per le composizioni): (a) 100 ml NZR (normale zebrafish Ringer), (b) 50 ml NZR + Tricaine (MS222), (c) 10 ml NZR + BSA, (d) 100 Locas ml (partire Ca 2 + soluzione), (e) 10 ml + Locas papaina, (f) 100 ml K +-soluzione interna. Soluzioni (a), (b), (d) e (f) può essere conservato fino ad un mese a 4 ° C. Soluzioni (c) e (e) deve essere preparato il giorno di sperimentazione. Tutte le soluzioni devono essere a temperatura ambiente prima di iniziare esperimenti. </li><li> Etichetta e riempire quattro 35 millimetri Petri circa metà con soluzioni (a), (c), (d) ed (e). </li><li> Fai un piatto dissezione compilando un piatto 60 millimetri Petri con Sylgard (Dow Corning, Midland, MI) e poi tagliando una cavità in esso che permetterà un pesce per poter stare seduti senza ribaltarsi. </li><li> Preparare almeno due utensili di isolamento delle cellule mediante incollaggio alla fine di un follicolo capelli cane alla fine di un vetroPipetta Pasteur con supercolla, permettendo al capello di estendersi oltre l&#39;estremità della pipetta di circa 0,5 cm. I peli di soft-pelo cani come i Labrador Retriever e Weimaraners funzionano bene. </li></ol> 2. Isolamento di uditivo e del labirinto vestibolare <ol><li> Sacrifica uno zebrafish adulto per immersione in un recipiente contenente NZR + Tricaine. Monitorare visivamente le branchie fino a quando tutti i movimenti opercolari sono cessate. Attende altri dieci minuti prima di togliere i pesci e risciacquo con NZR fresco. Queste procedure sono state approvate dalla cura degli animali e uso Comitato Istituzionale (IACUC) della Pepperdine University ma l&#39;approvazione dovrebbe essere ottenuto dal proprio istituto. </li><li> Pin il pesce alla dissezione lato dorsale piatto fino inserendo un pin standard cucitura diritta (circa 2,5 cm) in ciascuna cavità oculare e un terzo perno attraverso il dorso-ventrale asse circa un terzo alla metà della distanza dalla testa alla coda come illustrato inFigura 1A. </li><li> Sotto uno zoom (0.62-5x) stereo microscopio da dissezione dotato di oculari 10x, usare le forbici a molla (arti Scienza catalogo Strumenti numero 15000-02) per esporre il cervello e un breve segmento del midollo spinale, eliminando il tetto cranio da un punto a circa 0,5 centimetri caudale al livello delle branchie avanti con il naso del pesce. Tagliare il midollo spinale e sollevare il cervello con una pinza sottile (Fine Scienza catalogo Strumenti numero 11251-30), mentre il taglio dei nervi spinali e altri accessori, rimuovere il cervello ed eliminare (Figura 1B). </li><li> La metà ventrale della capsula cranio che rimane forma una &quot;ciotola&quot; che contiene gli organi dell&#39;orecchio interno. Rispettare le prominenti, bianchi, opachi otoliti nelle lagenas e sacculi situati simmetricamente alla fine caudale di ciascun orecchio interno e gli otoliti utricolo posizionate lateralmente più rostrale (figure 1C e 4A). </li><li> Rimuovere la vaschetta di osso, tagliando tutti i attachmen ventrali e lateralits mentre delicatamente sollevando fuori della testa con una pinza sottile. Inserire nella scatola di Petri contenente Locas (Figure 1D e 4B). </li><li> Utilizzando due coppie di pinze sottili, a parte rompere la ciotola nella linea mediana da una afferrando i bordi laterali del tessuto osseo e Separandoli o alternativamente, separando le metà destra e sinistra inserendo i punti della pinza del centro e le metà indiscreti a parte. Rimuovere i due labirinti dalle ossa con una pinza sottile (Figura 2). </li><li> Controllare i labirinti per identificare il uditivo e vestibolare finali organi: i canali semicircolari, otricoli, sacculi e lagenas (Figura 4C). Le aree rosato sotto ogni otoliti sono macule contenente le cellule ciliate. Allo stesso modo, una striscia di colore rosa all&#39;interno del ampolle dei canali semicircolari identifica la cupola in cui si trovano le cellule ciliate. </li><li> Rimuovere con cautela le otoliti dal lagena e utricolo utilizzando le pinza sottile ( <strong&gt; figure 2 e 4c). Non è necessario rimuovere il otoliti dal sacculo in quanto ciò potrebbe danneggiare le cellule ciliate sacculari. </li></ol> 3. Capelli cella di isolamento <ol><li> Utilizzando una pipetta di plastica trasferimento (numero di catalogo Fisher Scientific 13-711-09:00), spostare gli organi terminali al piatto contenente Locas + papaina minimizzare il volume di fluido trasferito. </li><li> Incubare queste strutture in questa soluzione per 30 minuti a temperatura ambiente. </li><li> Al termine del periodo di incubazione, spostare le strutture al piatto contenente NZR + BSA e incubare in questa soluzione per almeno 30 minuti. Le cellule dei capelli rimarrà sano in questa soluzione per un massimo di quattro ore, ma si deteriora dopo 1-2 ore dopo l&#39;isolamento (vedere i passi successivi). </li><li> In preparazione per l&#39;isolamento delle cellule, spostare uno dei finali organi al piatto contenente NZR. </li><li> Per i lagenas e otricoli, utilizzare un peli di cane per sollevare delicatamente al largo delle macule-fogli di rosa ti epitelialeUMERO che contengono le cellule dei capelli (Figura 3A). Il macule può essere scavato (con un pelo di cane), da sotto le otoliti del sacculi, e il cupulae dalle posizioni all&#39;interno del ampolle dei canali semicircolari. </li><li> Utilizzando strumenti cella due isolamento preparati nel passo 1,4, triturare una macula o cupula per generare un campo di detriti che contiene le cellule dei capelli (Figura 3B). Permettere alle cellule di almeno cinque minuti per risolvere sul fondo del piatto prima di spostarlo. </li><li> Spostare il piatto alla fase di un microscopio invertito dotato di ottica di contrasto di fase. Osservare le cellule sotto ingrandimento 40X e notare la diversità nella morfologia. Molte cellule sono a forma di avocado, mentre altri sono lunghi e sottili. La presenza di fasci di capelli apicali li identifica come cellule cigliate e fase-luminosità assicura la loro salute. Microfotografie di cellule isolate capelli sono mostrati in Figura 5. </li></ol> 4. Patch di serraggio cellule ciliate zebrafish <ol><li> In preparazione per la perfonominale 5,6 patch di registrazioni, preparare amfotericina contenente soluzione interna come segue: posto 5 mg amfotericina B (Sigma A4888) in una provetta da 1,5 ml microcentrifuga e riempire con 100 microlitri di DMSO. Immediatamente vortex questa soluzione per 10-20 secondi finché tutti i amfotericina è disciolto. Poi, pipetta 625 microlitri + K-interno soluzione in una provetta secondo. Aggiungere 10 ml della soluzione di amfotericina al K +-soluzione interna e vortice come sopra. La soluzione amfotericina magazzino durerà diverse ore, ma scartare la soluzione finale dopo un&#39;ora. </li><li> Realizzare pipette di patch da BF 150-86-10 vetro borosilicato (Sutter Instruments) con un estrattore a più stadi (Sutter P-1000). Pipette dovuto consigliato diametri di circa 2 micron e hanno resistenze di 1-3 MW con le soluzioni in Tabella 1. Le impostazioni della estrattore che funzionano bene sono i seguenti: calore = Rampa minus10, Pull = 0, Velocità = 18, Delay = 1, pressione = 600. La forma dila punta di una pipetta buona è evidente dalla fotografia in c riquadro di figura 5. Blunt &quot;proiettile a forma di&quot; pipette sono da preferire in quanto offrono la resistenza almeno l&#39;accesso durante le registrazioni elettrofisiologiche. </li><li> Utilizzare un calibro 28 ago della siringa Microfil (MF28G-5; Strumenti di precisione del Mondo) per riempire un elettrodo di registrazione a metà con l&#39;amfotericina contenente K +-interno soluzione. </li><li> Apporre l&#39;elettrodo al headstage di un amplificatore di patch clamp. Applicare -10 mV, 10 ms gradini di tensione a 10 Hz e mantenere una pressione positiva in quanto l&#39;elettrodo viene manovrato in aria / soluzione di interfaccia e fino al fondo del piatto registrazione vicino alle cellule. </li><li> Posizionare l&#39;elettrodo ortogonalmente ad una cella sano. Quando l&#39;elettrodo è abbastanza vicino alla cella in modo che inizi allontana dal fuori-fluente soluzione, invertire rapidamente la pressione, applicando una leggera depressione sull&#39;elettrodo fino alla cella &quot;salta&quot; su di esso. Cessare immediatamente di aspirazione su °e elettrodo e applicare un potenziale di mantenimento di -70 mV all&#39;interno dell&#39;elettrodo. Nel giro di pochi secondi un sigillo gigaohm formerà. </li><li> Osservare i transitori capacitivi attualmente in corso a l&#39;inizio e la cessazione delle misure di tensione che appaiono subito dopo la formazione del sigillo. Continuare a monitorare la perforazione della membrana sotto l&#39;elettrodo dal amfotericina osservando i transitori crescono in grandezza a loro dimensione massima (in circa dieci minuti). </li><li> Per confermare la creazione di cellule intere (perforata) configurazione in una cellula sana, suscitare esteriori K + correnti applicando iperpolarizzante depolarizzanti e fasi di tensione. Maggior parte delle cellule dei capelli sono importanti correnti verso l&#39;esterno (vedi figura 6). </li></ol> 5. Risultati rappresentativi La figura 4 mostra immagini scattate durante le fasi di isolamento cellulare. Nel pannello A, le otoliti associati ai lagenas, saccluli e otricoli può essere visto through lo strato sottile di osso che li ricopre. Queste strutture opache forniscono punti di riferimento comodo per aiutare nella rimozione sicura degli organi finali di l&#39;animale durante le fasi successive della dissezione. Pannello B mostra la &quot;ciotola&quot; di osso che contiene i labirinti intatti e gli otoliti eminenti, le lagenas otricoli e sacculi. Pannello C illustra un labirinto che è stata rimossa dal tessuto osseo. Si noti il ​​otoliti grande con il bordo smerlato in lagena, il ghiacciolo a forma di otoliti nel sacculo e la forma di fagiolo otoliti nel utricolo. Alcune delle diversità in dimensione e morfologia visto in cellule isolate dal lagena è illustrato in figura 5. Una cellula sana è facilmente identificato come fase luminosa, con un perimetro tagliente. Forme delle celle possono essere suddivise in due classi: a forma di avocado (AVO) e lungo e sottile (THN), anche se le dimensioni delle celle all&#39;interno di ogni gruppo può variare notevolmente (cfr. ad esempio avo 1 e avo 3). Un inserto presenta un grappolo ditre celle che non sono state completamente isolate l&#39;una dall&#39;altra. Il colore nero e granuloso della cella in b riquadro identifica prontamente questa cella come morto. C inserto mostra la punta di una pipetta di patch che illustra la forma e le dimensioni appropriate per la registrazione da queste cellule. Le tracce corrente mostrati in Figura 6 sono stati ottenuti in risposta a iperpolarizzazione e depolarizzante passi di potenziale imposti una cella lagena simile alla AVO 2 illustrato nella Figura 5. Attuali risposte in cellule di diverse dimensioni e forme possono variare ampiamente suggerendo diversità nel complemento di canali voltaggio-dipendenti. Figure 1-3: Cartoni animati che illustrano fasi l&#39;isolamento delle cellule ciliate. <img alt="Figura 1" src="/files/ftp_upload/4281/4281fig1.jpg" /> Figura 1. Rimozione della capsu craniole contenente i labirinti dell&#39;orecchio interno di zebrafish. A. Pin sacrificato zebrafish lato dorsale fino a dissezione piatto. B. Cranio aperto, rimuovere ed eliminare il cervello. C. Osservare otoliti in otricoli, lagenas e sacculi. D. Rimuovere parte ventrale della capsula cranio contenente i labirinti. <img alt="Figura 2" src="/files/ftp_upload/4281/4281fig2.jpg" /> Figura 2. Rimozione di labirinti di capsula cranio. A. Crack a parte capsula cranio alla sua linea mediana. B. Rimuovere labirinti dalle ossa. C. Rimuovere le otoliti dalle lagenas e otricoli con una pinzetta. <img alt="Figura 3" src="/files/ftp_upload/4281/4281fig3.jpg" /> Figura 3. Isolamento di cellule ciliate di labirinti. A. Sollevare delicatamente fuori maculae con i capelli cane. B. Triturare macule con due peli di cane. C. Utilizzare cellule ciliate isolate per patch clamp. <img alt="Figura 4" src="/files/ftp_upload/4281/4281fig4.jpg" /> Immagini Figura 4. Presa durante passaggi l&#39;isolamento di singole cellule. A. Dopo la rimozione del cervello, le otoliti associati alle due lagenas e sacculi (frecce) e otricoli (frecce) possono essere visualizzati. B. Dopo la rimozione del ventrale porzione della capsula cranio che contiene gli organi dell&#39;orecchio interno dalla animale. Il fumetto nella parte destra di B identifica le posizioni della sinistra utricolo, lagena e sacculo. La linea tratteggiata indica la posizione approssimativa del labirinto sinistra. C. Labirinto destro (vista mediale) D: disegno del fumetto che illustra porzioni chiave del labirinto in C. a: semi anteriorecircolare canale, b: canale orizzontale, c: canale posteriore, d: utricolari otoliti, e: sacculare otoliti, f: lagenal otoliti. Barra della scala in D rappresenta 1 mm per A e B, 0,5 mm per C e D. <img alt="Figura 5" src="/files/ftp_upload/4281/4281fig5.jpg" /> Figura 5 isolati, le cellule sane dal lagena illustra la diversità di morfologia; avo:. Cellule a forma di avocado; thn: lunghe, sottili cellule. Inserite un: gruppo di tre celle non completamente isolate; riquadro b: cellule morte, c riquadro: punta dell&#39;elettrodo cerotto usato a registrazioni elettrofisiologiche di cellule ciliate zebrafish. Barra di scala = 20 micron si applica alla figura principale e tutti inserti. <img alt="Figura 6" src="/files/ftp_upload/4281/4281fig6.jpg" /> Correnti Figura 6. Registrati in una patch bloccato cella capelli. Risposte mediate in una cella (t similio avo 2 in Figura 5) per tre presentazioni di gradini di tensione applicati in incrementi di 10 mV da -140 mV a +70 mV da un potenziale di mantenimento di -70 mV. Nota la corrente di inattivazione che appare da più potenziali depolarizzata. Grandezze gradino di tensione sono indicati accanto ad alcune delle tracce.

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	<li>Lewis, R. S., Hudspeth, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Voltage-+and+ion-dependent+conductances+in+solitary+vertebrate+hair+cells.">Voltage- and ion-dependent conductances in solitary vertebrate hair cells.</a> Nature. 304, 538-5341 (1983).</li><li>Art, J. J., Fettiplace, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Variation+of+membrane+properties+in+hair+cells+isolated+from+the+turtle+cochlea.">Variation of membrane properties in hair cells isolated from the turtle cochlea.</a> J. Physiol. 385, 207-242 (1987).</li><li>Sugihara, I., Furukawa, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Morphological+and+functional+aspects+of+two+different+types+of+hair+cells+in+the+goldfish+sacculus.">Morphological and functional aspects of two different types of hair cells in the goldfish sacculus.</a> J. Neurophysiol. 62, 1330-1343 (1989).</li><li>Lee, S., Briklin, O., Hiel, H., Fuchs, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Calcium-dependent+inactivation+of+calcium+channels+in+cochlear+hair+cells+of+the+chicken.">Calcium-dependent inactivation of calcium channels in cochlear hair cells of the chicken.</a> J. Physiol. 583, 909-922 (2007).</li><li>Horn, R., Marty, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Muscarinic+activation+of+ionic+currents+measured+by+a+new+whole-cell+recording+method.">Muscarinic activation of ionic currents measured by a new whole-cell recording method.</a> J. Gen. Physiol. 92, 145-159 (1988).</li><li>Rae, J. R., Cooper, K., Gates, P., Watsky, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Low+access+perforated+patch+recordings+using+amphotericin+B.">Low access perforated patch recordings using amphotericin B.</a> J. Neurosci. Meth. 37, 15-26 (1991).</li><li>Lumpkin, E. A., Hudspeth, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Detection+of+Ca2++entry+through+mechanosensitive+channels+localizes+the+site+of+mechanoelectrical+transduction+in+hair+cells.">Detection of Ca2+ entry through mechanosensitive channels localizes the site of mechanoelectrical transduction in hair cells.</a> Proc. Natl Acad. Sci. U.S.A. 92, 10297-10301 (1995).</li><li>Liang, J., Burgess, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gross+and+fine+dissection+of+inner+ear+sensory+epithelia+in+adult+zebrafish+(Danio+rerio).">Gross and fine dissection of inner ear sensory epithelia in adult zebrafish (Danio rerio).</a> J. Vis Exp. 27, e1211 (2009).</li><li>Hudspeth, A. J., Lewis, R. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Kinetic+analysis+of+voltage-+and+ion-dependent+conductances+in+saccular+hair+cells+of+the+bull-frog,+Rana+catesbeiana.">Kinetic analysis of voltage- and ion-dependent conductances in saccular hair cells of the bull-frog, Rana catesbeiana.</a> J. Physiol. 400, 237-274 (1988).</li><li>Hudspeth, A. J., Lewis, R. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+model+for+electrical+resonance+and+frequency+tuning+in+saccular+hair+cells+of+the+bull-frog,+Rana+catesbeiana.">A model for electrical resonance and frequency tuning in saccular hair cells of the bull-frog, Rana catesbeiana.</a> J. Physiol. 400, 275-297 (1988).</li><li>Parsons, T. D., Lenzi, D., Almer, W., Roberts, W. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Calcium-triggered+exocytosis+in+an+isolated+presynaptic+cell:+capacitance+measurements+in+saccular+hair+cells.">Calcium-triggered exocytosis in an isolated presynaptic cell: capacitance measurements in saccular hair cells.</a> Neuron. 13, 875-883 (1994).</li><li>Kim, M. -. H., Vickers, E., von Gersdorff, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Patch-clamp+capacitance+measurements+and+Ca2++imaging+at+single+nerve+terminals+in+retinal+slices.">Patch-clamp capacitance measurements and Ca2+ imaging at single nerve terminals in retinal slices.</a> J. Vis Exp. 59, e3345 (2012).</li><li>Housley, G. D., Ashmore, J. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Direct+measurement+of+the+action+of+acetylcholine+on+isolated+outer+hair+cells+of+the+guinea+pig+cochlea.">Direct measurement of the action of acetylcholine on isolated outer hair cells of the guinea pig cochlea.</a> Proc. R. Soc. Lond. B. 244, 161-167 (1991).</li><li>Nicolson, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+genetics+of+hearing+and+balance+in+zebrafish.">The genetics of hearing and balance in zebrafish.</a> Ann. Rev. Genetics. 39, 9-22 (2005).</li></ol>

Nessun conflitto di interessi dichiarati.

Un&#39;attenta dissezione degli organi terminali e trattamento delicato delle cellule è critico per il successo di isolamento cellule sane capelli intatti e fisiologicamente attiva. Attenersi ai seguenti suggerimenti assicurare il successo: <ol><li> E &#39;più facile ottenere cellule sane da pesci più piccoli (2-2,5 cm di lunghezza). I pesci più grandi hanno molti più goccioline di grasso che oscura di visualizzazione durante il processo di dissezione. </li><li> Bisogna fare attenzione quando si rimuove la otoliti, che si sovrappongono le cellule ciliate. Evitare di toccare le cellule quando afferrando le otoliti con una pinza. </li><li> I migliori risultati si ottengono quando il maculae e cupulae sono sollevati in fogli e le cellule sgranato dall&#39;epitelio. </li><li> Troviamo l&#39;uso di un capello cane per triturare cellule di essere superiore ad altri metodi, compreso l&#39;utilizzo di ciglia umani 7 che non sono rastremate e meno flessibile. </li><li> Durante patch di bloccaggio, l&#39;applicazione di pressione positiva per tegli elettrodo che passa attraverso l&#39;aria / soluzione interfaccia è importante per mantenere la punta pulita. Il rilascio della pressione positiva per consentire la cella di &quot;saltare&quot; sull&#39;elettrodo è importante. Questo metodo cancella un piccolo volume di soluzione contenente amfotericina lontano dalla punta, aumentando così la probabilità di formare una tenuta gigaohm con la cella. Nei nostri esperimenti usiamo il perforato tecnica di registrazione cerotto al posto del più tradizionale configurazione whole-cell a causa della fragilità delle cellule. Il tentativo di &quot;andare a cellula intera&quot; si traduce spesso nella perdita del sigillo gigaohm. </li></ol> Il metodo qui descritto produrrà centinaia di cellule dei capelli sani per animale. La tecnica può essere eseguita a temperatura ambiente e non richiede particolari attrezzature di là di un microscopio da dissezione. Un rapporto precedente JoVE descrive la dissezione dell&#39;orecchio interno in zebrafish con un approccio ventrale 8. Questi autori dimostrano la diffuction di interi, paraformaldeide-fissi organi dell&#39;orecchio interno. Invitiamo il lettore a guardare questo video per il confronto con i nostri metodi. Un vantaggio dei metodi presentati qui è l&#39;ottenimento di cellule vive utili per le indagini fisiologiche. Oltre al loro uso negli esperimenti patch clamp per studiare i canali voltaggio-dipendenti (come qui mostrato) l&#39;uso di queste cellule può essere esteso per studiare risonanza cella 9,10, monitor rilascio di neurotrasmettitore effettuando misurazioni di capacità 11,12, indagare neuromodulazione indotta da l&#39;attivazione di canali ligando gated 13 e sfruttare la ricchezza di informazioni che possono essere raccolte da utilizzare mutanti che influenzano sia l&#39;udito e l&#39;equilibrio 14.

<table border="1"><tbody><tr><td> Soluzione Nome </td><td> Ricetta </td></tr><tr><td> (A) NZR (Normal Zebrafish Ringer) (in mM) </td><td> 116 NaCl, KCl 2, 2 CaCl 2, 3 Glucosio, 5 Na +-HEPES, pH 7,35. </td></tr><tr><td> (B) + NZR Tricaine </td><td> NZR + 0,02% 3-aminobenzoico solfonato estere etilico metano (Sigma A5040). </td></tr><tr><td> (C) NZR + BSA </td><td> NZR + 0,4% di sieroalbumina bovina (Sigma A2153). </td></tr><tr><td> (D) Locas (Low Ca 2 Soluzione +) (in mM) </td><td> 100 NaCl, KCl 2, CaCl 2 0,05, 0,05 MgCl 2, 3 Glucosio, 30 Na +-HEPES, pH 7,35. </td></tr><tr><td> (E) Locas + papaina </td><td> Locas + 0.05% L-cisteina (Sigma C1276) papaina + 0,2% (Sigma P3375). </td></tr><tr><td> (F) K +-soluzione interna (in mM) </td><td> 52 K 2 SO 4,38 KCl, 1 K +-EGTA, 5 K +-HEPES, pH 7,3. </td></tr></tbody></table> Tabella 1. Solutions.

patch clamp recordings in inner ear hair cells isolated from zebrafish

Analisi di patch clamp dei canali voltaggio-dipendenti in cellule ciliari sensoriali isolate da una varietà di specie sono state descritte in precedenza, ma il video 1-4 rappresenta la prima applicazione di tali tecniche di cellule cigliate di zebrafish. Qui mostriamo un metodo per isolare le cellule ciliate sane, intatte da tutti gli interni dell&#39;orecchio finali organi: sacculo, lagena, utricolo e canali semicircolari. Inoltre, abbiamo dimostrato la diversità di taglia capelli e la morfologia cellulare e dare un esempio dei tipi di registrazioni patch clamp che può essere ottenuta. Il vantaggio dell&#39;utilizzo di questo sistema modello zebrafish sugli altri nasce dalla disponibilità di mutanti di zebrafish che colpiscono sia l&#39;udito e l&#39;equilibrio. In combinazione con l&#39;uso di linee transgeniche e altre tecniche che utilizzano analisi genetica e la manipolazione, l&#39;isolamento cellulare e metodi elettrofisiologici introdotto qui dovrebbe favorire una maggiore comprensione delle cellule cigliate ruoli pconsisteva nel mediare queste modalità sensoriali.

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Patch Clamp Recordings in Inner Ear Hair Cells Isolated from Zebrafish

Lo scopo di questo video è dimostrare procedure per ottenere cellule sane capelli intatte dagli organi dell&#39;orecchio interno di zebrafish adulti e poi li utilizzano per studi di patch clamp per caratterizzare le proprietà biofisiche di loro canali voltaggio-dipendenti.

Registrazioni patch clamp in cellule interne dell&#39;orecchio Capelli Isolato da Zebrafish

Patch  clamp analyses of the voltage-gated channels in sensory hair cells isolated  from a variety of species have been described previously1-4 but this  ...

patch-clamp-recordings-in-inner-ear-hair-cells-isolated-from-zebrafish

Research

JoVE Journal

Neuroscience

16.6K Views.  Pepperdine University. Lo scopo di questo video è dimostrare procedure per ottenere cellule sane capelli intatte dagli organi dell'orecchio interno di zebrafish adulti e poi li utilizzano per studi di patch clamp per caratterizzare le proprietà biofisiche di loro canali voltaggio-dipendenti.

Video: Patch Clamp Recordings in Inner Ear Hair Cells Isolated from Zebrafish

Patch Clamp Recordings from Mouse Retinal Neurons in a Dark-adapted Slice Preparation

Our visual experience is initiated when the visual pigment in our retinal photoreceptors absorbs photons of light energy and initiates a cascade of intracellular events that lead to closure of cyclic-nucleotide-gated channels in the cell membrane. The resulting change in membrane potential leads in turn to reductions in the amount of neurotransmitter release from both rod and cone synaptic terminals. To measure how the light-evoked change in photoreceptor membrane potential leads to downstream activity in the retina, scientists have made electrophysiological recordings from retinal slice preparations for decades1,2. In the past these slices have been cut manually with a razor blade on retinal tissue that is attached to filter paper; in recent years another method of slicing has been developed whereby retinal tissue is embedded in low gelling temperature agar and sliced in cool solution with a vibrating microtome3,4. This preparation produces retinal slices with less surface damage and very robust light-evoked responses. Here we document how this procedure can be done under infrared light to avoid bleaching the visual pigment.

Here we describe a procedure for generating dark-adapted slices of the mouse retina for electrophysiological recordings.

Bloccare Registrazioni patch da neuroni della retina del mouse in un Dark-adattato Preparazione Slice

Our visual experience is initiated when the visual pigment in our retinal photoreceptors absorbs photons of light energy and initiates a cascade of ...

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Neuroscienze

Paired Patch Clamp Recordings from Motor-neuron and Target Skeletal Muscle in Zebrafish

Larval zebrafish represent the first vertebrate model system to allow simultaneous patch clamp recording from a spinal motor-neuron and target muscle. This is a direct consequence of the accessibility to both cell types and ability to visually distinguish the single segmental CaP motor-neuron on the basis of morphology and location. This video demonstrates the microscopic methods used to identify a CaP motor-neuron and target muscle cells as well as the methodologies for recording from each cell type. Identification of the CaP motor-neuron type is confirmed by either dye filling or by the biophysical features such as action potential waveform and cell input resistance. Motor-neuron recordings routinely last for one hour permitting long-term recordings from multiple different target muscle cells. Control over the motor-neuron firing pattern enables measurements of the frequency-dependence of synaptic transmission at the neuromuscular junction. Owing to a large quantal size and the low noise provided by whole cell voltage clamp, all of the unitary events can be resolved in muscle. This feature permits study of basic synaptic properties such as release properties, vesicle recycling, as well as synaptic depression and facilitation. The advantages offered by this in vivo preparation eclipse previous neuromuscular model systems studied wherein the motor-neurons are usually stimulated by extracellular electrodes and the muscles are too large for whole cell patch clamp. The zebrafish preparation is amenable to combining electrophysiological analysis with a wide range of approaches including transgenic lines, morpholino knockdown, pharmacological intervention and in vivo imaging. These approaches, coupled with the growing number of neuromuscular disease models provided by mutant lines of zebrafish, open the door for new understanding of human neuromuscular disorders.

Larval zebrafish represent the first vertebrate model system to allow simultaneous patch clamp recording from a spinal motor-neuron and target skeletal muscle. This video demonstrates the microscopic methods used to identify a segmental CaP motor-neuron and target muscle cells as well as the methodologies for recording from each cell type.

Accoppiato a pinza registrazioni patch da Motor-neurone e muscolo scheletrico bersaglio in Zebrafish

Larval zebrafish represent the first vertebrate model system to allow simultaneous patch clamp recording from a spinal motor-neuron and target muscle.  ...

Postsynaptic Recordings at Afferent Dendrites Contacting Cochlear Inner Hair Cells: Monitoring Multivesicular Release at a Ribbon Synapse

The afferent synapse between the inner hair cell (IHC) and the auditory nerve fiber provides an electrophysiologically accessible site for recording the postsynaptic activity of a single ribbon synapse 1-4. Ribbon synapses of sensory cells release neurotransmitter continuously, the rate of which is modulated in response to graded changes in IHC membrane potential 5. Ribbon synapses have been shown to operate by multivesicular release, where multiple vesicles can be released simultaneously to evoke excitatory postsynaptic currents (EPSCs) of varying amplitudes 1, 4, 6-11. Neither the role of the presynaptic ribbon, nor the mechanism underlying multivesicular release is currently well understood.
The IHC is innervated by 10-20 auditory nerve fibers, and every fiber contacts the IHC with a unmyelinated single ending to form a single ribbon synapse. The small size of the afferent boutons contacting IHCs (approximately 1 &mu;m in diameter) enables recordings with exceptional temporal resolution to be made. Furthermore, the technique can be adapted to record from both pre- and postsynaptic cells simultaneously, allowing the transfer function at the synapse to be studied directly 2. This method therefore provides a means by which fundamental aspects of neurotransmission can be studied, from multivesicular release to the elusive function of the ribbon in sensory cells.

Whole-cell patch-clamp recordings from auditory nerve fiber dendrites at the inner hair cell ribbon synapse in the mammalian cochlea.

Registrazioni postsinaptica a dendriti afferenti contattare cocleari cellule ciliate interne: Release multivescicolari monitoraggio a Synapse Ribbon

The afferent synapse between the inner hair cell (IHC) and the auditory nerve fiber provides an electrophysiologically accessible site for recording the ...

Isolating LacZ-expressing Cells from Mouse Inner Ear Tissues using Flow Cytometry

Isolation of specific cell types allows one to analyze rare cell populations such as stem/progenitor cells. Such an approach to studying inner ear tissues presents a unique challenge because of the paucity of cells of interest and few transgenic reporter mouse models. Here, we describe a protocol using fluorescence-conjugated probes to selectively label LacZ-positive cells from the neonatal cochleae.
The most common underlying pathology of sensorineural hearing loss is the irreversible damage and loss of cochlear sensory hair cells, which are required to transduce sound waves to neural impulses. Recent evidence suggests that the murine auditory and vestibular organs harbor stem/progenitor cells that may have regenerative potential1,2. These findings warrant further investigation, including identifying specific cell types with stem/progenitor cell characteristics. The Wnt signaling pathway has been demonstrated to play a critical role in maintaining stem/progenitor cell populations in several organ systems3-7. We have recently identified Wnt-responsive Axin2-expressing cells in the neonatal cochlea, but their function is largely unknown8.
To better understand the behavior of these Wnt-responsive cells in vitro, we have developed a method of isolating Axin2-expressing cells from cochleae of Axin2-LacZ reporter mice9. Using flow cytometry to isolate Axin2-LacZ positive cells from the neonatal cochleae, we could in turn execute a variety of experiments on live cells to interrogate their behavior as stem/progenitor cells. Here, we describe in detail the steps for the microdissection of neonatal cochlea, dissociation of these tissues, labeling of the LacZ-positive cells using a fluorogenic substrate, and cell sorting. Techniques for dissociating cochleae into single cells and isolating cochlear cells via flow cytometry have been described2,10-12. We have made modifications to these techniques to establish a novel protocol to isolate LacZ-expressing cells from the neonatal cochlea.

Flow cytometry is a powerful tool allowing for the isolation and study of specific cell populations. This protocol describes steps for isolating LacZ-expressing cells from cochlear tissues from neonatal transgenic mice. Dissociated cochlear cells were labeled using fluorescent-conjugated substrates of &#946;-galactosidase prior to separation via flow cytometry.

Isolando LacZ cellule che esprimono da tessuti dell&#39;orecchio interno del mouse in citometria a flusso

Isolation of specific cell types allows one to analyze rare cell populations such as stem/progenitor cells. Such an approach to studying inner ear tissues ...

Gene Transfer to the Developing Mouse Inner Ear by In Vivo Electroporation

The mammalian inner ear has 6 distinct sensory epithelia: 3 cristae in the ampullae of the semicircular canals; maculae in the utricle and saccule; and the organ of Corti in the coiled cochlea. The cristae and maculae contain vestibular hair cells that transduce mechanical stimuli to subserve the special sense of balance, while auditory hair cells in the organ of Corti are the primary transducers for hearing 1. Cell fate specification in these sensory epithelia and morphogenesis of the semicircular canals and cochlea take place during the second week of gestation in the mouse and are largely completed before birth 2,3. Developmental studies of the mouse inner ear are routinely conducted by harvesting transgenic embryos at different embryonic or postnatal stages to gain insight into the molecular basis of cellular and/or morphological phenotypes 4,5. We hypothesize that gene transfer to the developing mouse inner ear in utero in the context of gain- and loss-of-function studies represents a complimentary approach to traditional mouse transgenesis for the interrogation of the genetic mechanisms underlying mammalian inner ear development6.
The experimental paradigm to conduct gene misexpression studies in the developing mouse inner ear demonstrated here resolves into three general steps: 1) ventral laparotomy; 2) transuterine microinjection; and 3) in vivo electroporation. Ventral laparotomy is a mouse survival surgical technique that permits externalization of the uterus to gain experimental access to the implanted embryos7. Transuterine microinjection is the use of beveled, glass capillary micropipettes to introduce expression plasmid into the lumen of the otic vesicle or otocyst. In vivo electroporation is the application of square wave, direct current pulses to drive expression plasmid into progenitor cells8-10. 
We previously described this electroporation-based gene transfer technique and included detailed notes on each step of the protocol11. Mouse experimental embryological techniques can be difficult to learn from prose and still images alone. In the present work, we demonstrate the 3 steps in the gene transfer procedure. Most critically, we deploy digital video microscopy to show precisely how to: 1) identify embryo orientation in utero; 2) reorient embryos for targeting injections to the otocyst; 3) microinject DNA mixed with tracer dye solution into the otocyst at embryonic days 11.5 and 12.5; 4) electroporate the injected otocyst; and 5) label electroporated embryos for postnatal selection at birth. We provide representative examples of successfully transfected inner ears; a pictorial guide to the most common causes of otocyst mistargeting; discuss how to avoid common methodological errors; and present guidelines for writing an in utero gene transfer animal care protocol.

Gene Transfer to the Developing Mouse Inner Ear by In Vivo Electroporation

The mouse inner ear is a placode-derived sensory organ whose developmental program is elaborated during gestation. We define an in utero gene transfer technique consisting of three steps: mouse ventral laparotomy, transuterine microinjection, and in vivo electroporation. We use digital video microscopy to demonstrate the critical experimental embryological techniques.

Gene Transfer per l&#39;orecchio del mouse Sviluppo Inner<em&gt; In Vivo</em&gt; Elettroporazione

The mammalian inner ear has 6 distinct sensory epithelia: 3 cristae in the ampullae of the semicircular canals; maculae in the utricle and saccule; and ...

Patch Clamp Recordings from Embryonic Zebrafish Mauthner Cells

Mauthner cells (M-cells) are large reticulospinal neurons located in the hindbrain of teleost fish. They are key neurons involved in a characteristic behavior known as the C-start or escape response that occurs when the organism perceives a threat. The M-cell has been extensively studied in adult goldfish where it has been shown to receive a wide range of excitatory, inhibitory and neuromodulatory signals1. We have been examining M-cell activity in embryonic zebrafish in order to study aspects of synaptic development in a vertebrate preparation. In the late 1990s Ali and colleagues developed a preparation for patch clamp recording from M-cells in zebrafish embryos, in which the CNS was largely intact2,3,4. The objective at that time was to record synaptic activity from hindbrain neurons, spinal cord neurons and trunk skeletal muscle while maintaining functional synaptic connections within an intact brain-spinal cord preparation. This preparation is still used in our laboratory today. To examine the mechanisms underlying developmental synaptic plasticity, we record excitatory (AMPA and NMDA-mediated)5,6 and inhibitory (GABA and glycine) synaptic currents from developing M-cells. Importantly, this unique preparation allows us to return to the same cell (M-cell) from preparation to preparation to carefully examine synaptic plasticity and neuro-development in an embryonic organism. The benefits provided by this preparation include 1) intact, functional synaptic connections onto the M-cell, 2) relatively inexpensive preparations, 3) a large supply of readily available embryos 4) the ability to return to the same cell type (i.e. M-cell) in every preparation, so that synaptic development at the level of an individual cell can be examined from fish to fish, and 5) imaging of whole preparations due to the transparent nature of the embryos.

We have developed an intact brain-spinal cord preparation to record and monitor electrical activity via patch clamp recording from the Mauthner neurons and other reticulospinal cells in zebrafish embryos. Thus, we are able to record excitatory and inhibitory synaptic currents, voltage-gated channel activity and action potentials from key neurons in a developing embryo.

Bloccare Registrazioni patch da cellule embrionali Zebrafish Mauthner

Mauthner cells (M-cells) are large  reticulospinal neurons located in the hindbrain of teleost fish. They are key  neurons involved in a characteristic ...

Whole-cell Patch-clamp Recordings from Morphologically- and Neurochemically-identified Hippocampal Interneurons

GABAergic inhibitory interneurons play a central role within neuronal circuits of the brain. Interneurons comprise a small subset of the neuronal population (10-20%), but show a high level of physiological, morphological, and neurochemical heterogeneity, reflecting their diverse functions. Therefore, investigation of interneurons provides important insights into the organization principles and function of neuronal circuits. This, however, requires an integrated physiological and neuroanatomical approach for the selection and identification of individual interneuron types. Whole-cell patch-clamp recording from acute brain slices of transgenic animals, expressing fluorescent proteins under the promoters of interneuron-specific markers, provides an efficient method to target and electrophysiologically characterize intrinsic and synaptic properties of specific interneuron types. Combined with intracellular dye labeling, this approach can be extended with post-hoc morphological and immunocytochemical analysis, enabling systematic identification of recorded neurons. These methods can be tailored to suit a broad range of scientific questions regarding functional properties of diverse types of cortical neurons.

Cortical networks are controlled by a small, but diverse set of inhibitory interneurons. Functional investigation of interneurons therefore requires targeted recording and rigorous identification. Described here is a combined approach involving whole-cell recordings from single or synaptically-coupled pairs of neurons with intracellular labeling, post-hoc morphological and immunocytochemical analysis.

Whole-cell patch-clamp registrazioni da Morphologically- e neurochimico-identificati interneuroni dell&#39;ippocampo

GABAergic inhibitory interneurons play a central role within neuronal circuits of the brain. Interneurons comprise a small subset of the neuronal ...

Electrophysiological and Morphological Characterization of Neuronal Microcircuits in Acute Brain Slices Using Paired Patch-Clamp Recordings

The combination of patch clamp recordings from two (or more) synaptically coupled neurons (paired recordings) in acute brain slice preparations with simultaneous intracellular biocytin filling allows a correlated analysis of their structural and functional properties. With this method it is possible to identify and characterize both pre- and postsynaptic neurons by their morphology and electrophysiological response pattern. Paired recordings allow studying the connectivity patterns between these neurons as well as the properties of both chemical and electrical synaptic transmission. Here, we give a step-by-step description of the procedures required to obtain reliable paired recordings together with an optimal recovery of the neuron morphology. We will describe how pairs of neurons connected via chemical synapses or gap junctions are identified in brain slice preparations. We will outline how neurons are reconstructed to obtain their 3D morphology of the dendritic and axonal domain and how synaptic contacts are identified and localized. We will also discuss the caveats and limitations of the paired recording technique, in particular those associated with dendritic and axonal truncations during the preparation of brain slices because these strongly affect connectivity estimates. However, because of the versatility of the paired recording approach it will remain a valuable tool in characterizing different aspects of synaptic transmission at identified neuronal microcircuits in the brain.

Patch-clamp recordings and simultaneous intracellular biocytin filling of synaptically coupled neurons in acute brain slices allow a correlated analysis of their structural and functional properties. The aim of this protocol is to describe the essential technical steps of electrophysiological recording from neuronal microcircuits and their subsequent morphological analysis.

Elettrofisiologici e morfologica Caratterizzazione neuronali Microcircuiti in Acute Fette cervello Utilizzando accoppiati di patch-clamp Recordings

The combination of patch clamp recordings from two (or more) synaptically coupled neurons (paired recordings) in acute brain slice preparations with ...

Whole-cell Patch-clamp Recordings in Brain Slices

Whole-cell patch-clamp recording is an electrophysiological technique that allows the study of the&#160;electrical properties of a substantial part of the neuron. In this configuration, the micropipette is in tight contact with the cell membrane, which prevents current leakage and thereby provides more accurate ionic current measurements than the previously used intracellular sharp electrode recording method. Classically, whole-cell recording can be performed on neurons in various types of preparations, including cell culture models, dissociated neurons, neurons in brain slices, and in intact anesthetized or awake animals. In summary, this technique has immensely contributed to the understanding of passive and active biophysical properties of excitable cells. A major advantage of this technique is that it provides information on how specific manipulations (e.g., pharmacological, experimenter-induced plasticity) may alter specific neuronal functions or channels in real-time. Additionally, significant opening of the plasma membrane allows the internal pipette solution to freely diffuse into the cytoplasm, providing means for introducing drugs, e.g., agonists or antagonists of specific intracellular proteins, and manipulating these targets without altering their functions in neighboring cells. This article will focus on whole-cell recording performed on neurons in brain slices,&#160;a preparation that has the advantage of recording neurons in relatively well preserved brain circuits, i.e., in a physiologically relevant context. In particular,&#160;when combined with appropriate pharmacology, this technique is a powerful tool allowing identification of specific neuroadaptations that occurred following any type of experiences, such as learning, exposure to drugs of abuse, and stress. In summary, whole-cell patch-clamp recordings in brain slices provide means to measure in ex vivo preparation long-lasting changes in neuronal functions that have developed in intact awake animals.

This protocol describes basic procedural steps for performing whole-cell patch-clamp recordings. This technique allows the study of&#160;the electrical behavior of neurons, and when performed in brain slices, allows the assessment of various neuronal functions from neurons that are still integrated in relatively well preserved brain circuits.

Registrazioni Whole-cell patch-clamp nel cervello fette

Whole-cell patch-clamp recording is an electrophysiological technique that allows the study of the&#160;electrical properties of a substantial part of the ...

Subcellular Patch-clamp Recordings from the Somatodendritic Domain of Nigral Dopamine Neurons

Dendrites of dopaminergic neurons receive and convey synaptic input, support action potential back-propagation and neurotransmitter release. Understanding these fundamental functions will shed light on the information transfer in these neurons. Dendritic patch-clamp recordings provide the possibility to directly examine the electrical properties of dendrites and underlying voltage-gated ion channels. However, these fine structures are not easily accessible to patch pipettes because of their small diameter. This report describes a step-by-step procedure to collect stable and reliable recordings from the dendrites of dopaminergic neurons in acute slices. Electrophysiological measurements are combined with post hoc recovery of cell morphology. Successful experiments rely on improved preparation of slices, solutions and pipettes, adequate adjustment of the optics and stability of the pipette in contact with the recorded structure. Standard principles of somatic patch-clamp recording are applied to dendrites but with a gentler approach of the pipette. These versatile techniques can be implemented to address various questions concerning the excitable properties of dendrites.

Subcellular patch-clamp recordings offer the possibility to investigate the functional properties of dendrites. However these fine structures are not easily accessible due to their small diameter. The protocol described here aims to facilitate the collection of stable and reliable recordings from the dendrites of dopamine neurons in slices in vitro.

Subcellulari patch-clamp dal dominio Somatodendritic di nigral dopamina neuroni

Dendrites of dopaminergic neurons receive and convey synaptic input, support action potential back-propagation and neurotransmitter release. Understanding ...