Notre laboratoire utilise Drosophila melanogaster pour identifier et caractériser les gènes et les voies qui régulent la fonction mitochondriale pendant le développement et l’homéostasie physiologique. Le protocole présenté ici utilise l’imagerie en direct avec l’ajout de peroxyde d’hydrogène pour visualiser les effets des dommages oxydatifs sur la localisation et la dynamique des structures subcellulaires dans l’ovaire adulte Drosophila. Nous utilisons fréquemment des protocoles d’imagerie pour étudier comment les mutations modifient la localisation et le mouvement mitochondriques normaux dans les cellules germinales femelles.
Au cours de nos études, nous avons constaté que le stress introduit par la dissection ou d’autres facteurs de stress cellulaire avait un impact profond sur la localisation mitochondriale. Comme un contrôle pour identifier si oui ou non le stress général, par opposition au traitement expérimental, est la cause de tout changement à la localisation ou le comportement des structures subcellulaires. Nous avons développé ce protocole pour introduire le stress de contrôle à l’aide du peroxyde d’hydrogène.
Dans cette vidéo, nous démontrerons comment les dommages oxydatifs induits par le peroxyde d’hydrogène modifient la distribution des mitochondries et du clu ribonucleoprotéine. Les médias les mieux adaptés à cette technique d’imagerie en direct contenaient les supports Drosophila de Schneider contenant 15 % de sérum bovin fœtal inactivé à chaleur, 0,6 X Pen-Strep et 200 microgrammes par insuline bovine microliter, appelée ci-après les médias complets de Schneider. Effectuer la préparation des médias dans des conditions stériles permettra de s’assurer qu’il ne soit pas contaminé.
Bien mélanger le contenu et le conserver toute la nuit à quatre degrés. L’insuline ne se dissout pas complètement dans les médias complets de Schneider et vous remarquerez un précipité s’installer dans le fond du tube. Faire des aliquots, en étant sûr de laisser ce précipité car il interférera avec l’imagerie.
Cette solution peut être utilisée pendant un mois si elle est stockée en aliquots à quatre degrés. Pour une imagerie optimale des cellules germinales féminines, préparez d’abord un flacon contenant une touche de pâte de levure humide qui est la consistance du beurre d’arachide. Cela garantit que les femelles sont bien nourries et produira tous les stades de développement follicule pour l’imagerie.
Pour des mouches en parfaite santé, recueillir de zéro à un jour les femelles et transférer avec les mâles dans un flacon de nourriture mouche contenant de la pâte de levure humide. Assurez-vous que les mouches endormies ne contactent pas la pâte de levure car elles peuvent s’y tenir. Nourrir les mouches de trois à sept jours, en changeant la pâte de levure tous les jours.
Assurez-vous que la pâte de levure entre en contact avec les aliments à la mouche, de sorte qu’elle ne se dessèche pas. Pour induire des dommages oxydatifs, nous utiliserons une solution de stock de peroxyde d’hydrogène à 30% et pour visualiser les mitochondries, nous utiliserons une solution de stock de 100 millimolar TMRE. Il est important de préparer les solutions médiatiques fraîches parce que le peroxyde d’hydrogène est sensible à l’oxydation et tmre se dégrade au fil du temps.
Juste avant la dissection, dans les médias complets de Schneider, préparer un aliquot frais de deux peroxyde d’hydrogène micromolaire, un aliquot frais de 46 nanomolaire TMRE, et un aliquot frais de 46 nanomolaire TMRE plus deux peroxyde d’hydrogène micromolaire. Pour la dissection des ovaires, vous aurez besoin de deux paires de forceps fins et d’une paire d’aiguilles de tungstène électrolytiquement aiguisées. Pour disséquer les ovaires remplir un verre de montre avec les médias complets de Schneider qui a été réchauffé à température ambiante, puis placer une seule mouche dans les médias à l’aide de forceps.
Saisissez doucement la mouche par le thorax à l’aide d’une paire de forceps fins. Avec les autres forceps, saisir le postérieur et tirer doucement pour enlever les ovaires. Enlevez toute cuticule ou tissu extraneous, puis transférez l’ovaire à un nouveau puits contenant des médias frais.
Les ovaires devraient encore se déplacer de la gaine musculaire environnante. À l’aide des aiguilles de tungstène aiguisées, taquiner doucement les ovarioles, en prenant soin d’enlever la gaine musculaire environnante. Si la gaine musculaire n’est pas enlevée, comme démontré ici, les ovaires trembleront, causant des problèmes avec l’acquisition d’image.
Une fois que les ovarioles ont été disséqués proprement, transférez-les dans une goutte de 100 microlitres de médias dans un plat MatTek si vous visualisez des structures étiquetées endogènement. Transférez les ovarioles dans une goutte de 100 microlitres de médias TMRE dans un plat MatTek si vous visualisez des mitochondries étiquetées avec TMRE. Les ovarioles descendront au fond de la gouttelette.
Il est important de pratiquer des dissections afin de commencer à imagerie du tissu aussi rapidement que possible. Une fois les ovarioles montés, placez le plat sur le microscope inversé et acquérez des images fixes ou de brèves vidéos comme enregistrement des conditions de prétraitement. Une fois cela fait, mettre en pause l’imagerie en direct, enlever le couvercle, et ajouter soigneusement 100 microlitres des deux micromolaires de peroxyde d’hydrogène préparé solution.
Évitez de briser la surface de la gouttelette multimédia existante ou d’ajouter la solution trop rapidement, afin de ne pas déplacer les ovarioles reposant sur le fond. Remplacer le couvercle du plat, déplacer et recentrer l’ovariole désiré et reprendre l’imagerie. Prenez soin de reprendre l’imagerie le plus rapidement possible, car le traitement expérimental est sensible au temps.
Montré ici sont encore des images d’un film, pris après le traitement du peroxyde d’hydrogène. Les mitochondries et les cellules germinales femelles sont dispersées dans tout le cytoplasme lorsque les mouches sont bien nourries et en bonne santé. Après l’ajout de peroxyde d’hydrogène, les dommages oxydatifs provoque des mitochondries à s’agglutiner, qui peut être vu aussi rapidement que 10 minutes après le traitement.
Après 20 minutes, les dommages provoquent la dissipation du potentiel de membrane mitochondrique. Ainsi, la majorité des mitochondries s’estompent. Dans ce film en direct du processus, les mitochondries peuvent être vus rapidement s’agglutiner et la majorité des mitochondries finissent par s’estomper.
Le clignotement pulsant dans le cytoplasme, particulièrement dans les cellules environnantes de follicule, semble caractéristique de l’addition de TMRE. Comme mentionné précédemment, l’imagerie doit avoir lieu rapidement après l’ajout de peroxyde d’hydrogène. Comme on le voit ici, si trop de temps s’écoule, le potentiel de la membrane mitochondriale est déjà perdu et l’étiquetage TMRE se dissipe, rendant les données impinterprétables.
Dans ces images fixes vidéo, les particules de Clu étiquetées endogènes GFP sont robustes et abondantes dans le germplasme des femelles bien nourries. Après ajout de peroxyde d’hydrogène, les particules de Clu se dispersent dans les 10 minutes. Cela est démontré dans la vidéo d’accompagnement.
Après l’ajout de peroxyde d’hydrogène, les particules clu bliss se dispersent rapidement. Nous avons trouvé ce protocole pour être un outil utile pour assurer l’imagerie précise de la localisation sauvage des particules de mitochondrie et de bonheur de Clu dans les cellules germinales femelles de Drosophila. Ce protocole devrait être applicable pour un large éventail d’études d’imagerie vivante et pourrait être utilisé pour traiter les tissus avant la fixation ainsi.
Les étapes les plus importantes sont d’isoler les ovarioles libres de la gaine musculaire, d’ajouter doucement le peroxyde d’hydrogène, afin de ne pas déloger les ovarioles, et d’image rapidement après l’ajout de peroxyde d’hydrogène. Nous espérons que vous trouverez cela un contrôle utile pour l’imagerie en direct une variété de structures subcellulaires. Merci d’avoir regardé et bonne chance avec vos expériences.
