Escherichia Coli est la bactérie gramnégative la plus courante causant la méningite néonatale. L’occurrence de la méningite bactérienne néonatale commence purement avec la bactériémie et puis les bactéries dans le sang pénètrent par la barrière de cerveau de sang pour causer la méningite. Les neutrophiles sont la première ligne de défense contre les infections bactériennes.
Pendant l’invasion bactérienne, les neutrophiles actifs libèrent ros. ROS représente les principaux mécanismes bactériocides des cellules hôtes pour détruire les pathogènes envahisseurs. Mesurer la production de ROS dans les neutrophiles est une méthode utile pour commencer la défense de l’hôte lors de l’interaction bactéries-hôte.
Prenez une seule colonie bactérienne de la plaque avec une pipette stérile et mettez-la dans un milieu d’infusion cerveau-coeur de cinq millilitres contenant de la Rifampicine dans un flacon concave. Incuber la culture bactérienne à 37 centigrades, avec 90 RPM pendant 17 heures dans le shaker d’incubation. Centrifuger les échantillons de sang périphériques à 2000 RPM pendant cinq minutes.
Après centrifugeuse, les échantillons de sang sont divisés en trois couches. Du bas vers le haut, la couche de globules rouges, la couche de globules blancs et la couche plasmatique. Aspirer la couche de globules blancs à un nouveau tube avec une pipette stérile.
Ajouter trois fois tampon de lyse de globule rouge. Bien mélanger le mélange et le placer à température ambiante pendant cinq minutes. Centrifuger le tube à 2000 RPM pendant cinq minutes.
Aspirer complètement le surnatant et jeter. Répétez la procédure de lyse des globules rouges une ou deux fois, jusqu’à ce que les sédiments deviennent blancs. Lavez les cellules en suspendant à nouveau les sédiments avec un PBS de deux millilitres.
Puis centrifuger le tube à 1000 RPM pendant cinq minutes. Resuspendez les sédiments avec un tampon de tri des cellules magnétiques précodé de 15 microlitres pour 15 millions de cellules. Ajouter 15 microlitres magnétiques et bien mélanger.
Incuber le mélange à quatre centigrades pendant 30 minutes. Dans des conditions normales, l’être humain adulte a environ 4 à 10 000 globules blancs par sang microlitre. Ainsi, le coût du total des globules blancs dans cinq millilitres de sang périphérique humain, près de 50 millions.
Et 50 perles magnétiques de microlitre dans le tampon magnétique de tri de 15 microlitres suffisent. Le pourcentage normal des neutrophiles est de 50 à 70% du total des globules blancs. Ainsi, environ 10 millions de neutrophiles peuvent être obtenus à partir de sang de cinq millilitres.
Lavez les cellules en ajoutant deux millilitres tampon de tri magnétique, par 10 millions de cellules au tube, et centrifugeuse à quatre centigrades, 1200 RPM pendant 10 minutes. Assembler la colonne magnétique et séparer l’étagère. Jetez complètement le supernatant et réutilisez les sédiments avec un tampon de tri magnétique de 500 microlitres pour un jusqu’à 100 millions de cellules.
Rincez la colonne avec un tampon de tri magnétique de trois millilitres. Appliquez la suspension cellulaire sur la colonne pour permettre aux neutrophiles étiquetés par les perles magnétiques, attachés à la colonne. Lavé les cellules spécifiques non spécifiques en ajoutant trois millilitres tampon pour trois fois, une fois que le réservoir de colonne est vide à chaque fois.
Retirez la colonne du séparateur magnétique et mettez-la dans un nouveau tube. Ajouter un tampon de tri magnétique de cinq millilitres dans la colonne. Poussez les cellules magnétiques étiquetées à l’aide d’un piston.
Centrifuger le tube à 1200 RPM pendant cinq minutes. Aspirez complètement le supernatant et réutilisez le sédiment avec un milieu de culture millilitre. Déterminez le numéro de cellule avec un compteur.
Ajusté la concentration cellulaire à 2 millions par millilitre dans le milieu de culture contenant la sonde de fluorescence DHE. Placez les neutrophiles dans l’incubateur pendant 30 minutes pour charger la sonde DHE. Allouer la suspension cellulaire à une microplaque noire de 96 puits avec 200 microlitres par puits.
Allumez le lecteur de microplaques. Réglez la température à 37 centigrades, choisissez le mode lecture fluorescence, le type de lecture cinétique, réglez la longueur d’onde de fluorescence. Choisissez le format de la plaque.
Déterminez la zone de lecture. Mesurez l’intensité de fluorescence toutes les cinq minutes pendant une heure. Secouez la plaque pendant trois secondes avant chaque lecture.
Sortez la microplaque de l’incubateur. Ajouter les souches PMA ou E44 avec trois répétitions. Mettez la plaque dans le lecteur de microplaque, appuyez sur le bouton de démarrage pour commencer l’analyse immédiatement.
Utilisant le contour de protocole dans cet article, les neutrophiles ont été isolés du sang périphérique humain, et chargés avec la sonde de fluorescence DHE. En ajoutant pma, ROS intracellulaire dans les neutrophiles, a montré une augmentation significative de 20 à 40 minutes, et a atteint le sommet à 60 minutes. Mais je pense que les souches E44, la production ros se produit immédiatement et augmente le temps dépendant.
L’expression du ROS causée par la souche E44 est similaire à celle causée par la PMA. La détection de la production de ROS dans les neutrophiles peut contribuer à la poursuite de l’étude des mécanismes bactériocides des neutrophiles. Dans ce protocole, nous fournissons un moyen plus facile de détecter la production ros dans les neutrophiles d’une manière en temps réel.
La méthode simple pourrait également être utilisée pour surveiller la production de ROS dans d’autres types de cellules hôtes lors des interactions hôte-bactéries.
