Ici, nous présentons un protocole détaillé pour isoler les cellules endocardiques et les cellules endothéliales coronaires séparément du cœur pour aider les gens à comprendre l’expression et la fonction génétiques spécifiques au type cellulaire. Les principaux avantages de cette méthode sont la pureté et la viabilité élevées des CEE et des CEC isolées et que les cellules maintiennent leurs propriétés physiologiques à l’isolement. Les CEC et les CEE diffèrent à bien des égards, de sorte que la capacité d’étudier indépendamment ces populations cellulaires permet l’exploration de mécanismes spécifiques aux types cellulaires dans diverses maladies cardiaques.
Cette méthode pourrait faciliter l’étude des facteurs transcriptonomiques et épigénétiques responsables de nombreuses maladies cardiaques d’une manière spécifique au type cellulaire. Les parties les plus délicates de cette méthode sont de déterminer les différentes parties du cœur et le moment de la digestion correctement pour éviter la contamination de type cellulaire. Yifei Miao, chercheur scientifique de mon laboratoire, démontrera la procédure.
Après avoir récolté des cœurs de six rats Sprague Dawley de 50 à 100 grammes, lavez les organes avec 50 millilitres de HBSS froid trois fois pour enlever tout excès de sang et placer un cœur sous un microscope disséquant. Placez le cœur sur son visage postérieur plus plat pour identifier les côtés gauche et droit du tissu et localiser l’artère pulmonaire. Utilisez des ciseaux pour couper l’artère pulmonaire jusqu’à la chambre ventriculaire droite et couper le long du septum jusqu’à ce que l’apex soit atteint.
Continuer à couper de l’apex jusqu’au côté postérieur du cœur le long du septum jusqu’à ce que la jonction de l’artère pulmonaire et la chambre ventriculaire droite est atteint. À partir de ce point, couper les côtés antérieurs et postérieurs du cœur perpendiculairement au point de dissection précédent et loin du septum jusqu’à ce que le mur libre ventriculaire droit soit libéré du reste du cœur. Placez ensuite le mur libre ventriculaire droit dans un tube de cinq millilitres de DMEM et localisez à nouveau l’aorte pour faciliter la collecte du mur libre ventriculaire gauche de la même manière que ce qui vient d’être démontré.
Lorsque tous les murs libres ventriculaires ont été collectés, transférer les échantillons de tissus dans un plat de culture de 60 centimètres avec leurs surfaces intérieures couchées face contre terre dans le plat. À l’aide d’une pointe de pipette d’un millilitre, ajouter 0,5 à un millilitre de tampon de digestion au plat directement sous les morceaux de tissu jusqu’à ce que seules les surfaces intérieures des tissus soient immergées. Pour éviter la contamination cellulaire non désirée, il est important que seule la surface intérieure du ventricule soit immergée dans le tampon de digestion et qu’elle soit digérée pendant exactement cinq minutes.
Après cinq minutes dans l’incubateur de culture cellulaire, arrêter la digestion avec cinq fois le volume de milieu cellulaire endothélial. Ensuite, utilisez une pipette d’un millilitre pour rincer la surface intérieure de chaque ventricule avec un milieu frais transférant le ruissellement à travers une passoire de 40 micromètres dans un tube de collecte de 50 millilitres sur la glace. Pour la digestion coronaire des cellules endothéliales, couper le long de la surface extérieure du ventricule gauche sans contamination de la couche interne et placer chaque fragment de tube dans un tube séparé de cinq millilitres contenant un millilitre de tampon de digestion.
Pour éviter la contamination par les CEE, il est important de ne couper que de la surface extérieure du ventricule. À l’aide de ciseaux de dissection, hacher la paroi ventriculaire en petits morceaux d’un millimètre cube et placer les tubes dans un bain d’eau de 37 degrés Celsius pendant 15 à 20 minutes avec vortex toutes les deux à trois minutes. Lorsque les morceaux hachés sont petits mais visibles, ajouter quatre millilitres de milieu cellulaire endothélial au tube et utiliser une pipette sérologique de cinq millilitres pour transférer tout le volume de solution à travers une passoire de 40 micromètres dans un tube de collecte de 50 millilitres sur la glace.
Pour isoler les populations de cellules CD31 positives après leur digestion, pelleter les cellules par centrifugation et aspirer les supernatants. Si des granulés sont rouges, resuspendez les cellules en un à deux millilitres de tampon de lyse de globule rouge par tube pour une incubation de cinq minutes dans un bain d’eau de 37 degrés Celsius. À la fin de l’incubation, arrêter la lyse avec 10 millilitres de PBS et recueillir les cellules avec une deuxième centrifugation.
Ensuite, ajoutez 90 microlitres de tampon de tri et 10 microlitres d’anticorps anti-CD31 PE à chaque tube de cellules. Après vortex, incuber les cellules pendant 10 minutes à quatre degrés Celsius. À la fin de l’incubation, ajouter 10 millilitres de tampon de tri aux tubes avec un mélange complet et recueillir les cellules par centrifugation.
Resuspendez les granulés dans 80 microlitres de tampon de tri par tube, suivi de l’ajout de 20 microlitres de microbilles anti-PE. Après le vortex, placez les tubes à quatre degrés Celsius pendant 15 minutes, puis lavez-les en tampon de tri de 10 millilitres par centrifugation comme nous venons de le démontrer. Resuspendez les granulés dans 500 microlitres de tampon de tri sur la glace et placez une colonne contenant des sphères super paramagnetic dans un séparateur magnétique.
Rincez la colonne avec trois millilitres de tampon de tri. Lorsque la colonne s’est vidée, ajouter 500 microlitres de la suspension endocardique des cellules endocardiques à la colonne, suivie de quatre lavages avec trois millilitres de tampon de tri par lavage. Après le dernier lavage, transférer la colonne dans un nouveau tube de collecte de 15 millilitres et utiliser le piston à colonne et cinq millilitres de milieu de cellule endothéliale fraîche pour rincer les cellules positives CD31 de la colonne dans le tube de collecte.
Puis recueillir la perle isolée cellules endothéliales par centrifugation. Comme prévu, le PCR quantitatif révèle que par rapport à la bêta-actine, les cellules endocardiques endocardiques ont exprimé des niveaux plus élevés des marqueurs endocardiaux Npr3, Hapln1 et Cdn11 par rapport aux cellules endothéliales coronaires. De même, les cellules endothéliales coronaires ont exprimé des niveaux plus élevés des marqueurs coronaires Fabp4, Mgll, et Cd36 comparés aux cellules endocardiales endocardiales endothéliales.
En outre, les deux types de cellules ont exprimé le gène marqueur de cellules pan-endothéliales Cdh5 avec des niveaux légèrement plus élevés observés dans les cellules endothéliales coronaires. Nous pouvons encore purifier les cellules à l’aide de FACS et d’anticorps spécifiques aux populations cellulaires. Par exemple, nous pouvons utiliser anti-Npr3 pour trier les CEE et les anti-Cd36 pour trier les CEC.
Cette technique a ouvert la voie aux chercheurs pour explorer le rôle des CEE et des CEC dans le développement cardiaque et la maladie d’une manière spécifique au type de cellule.
