Dans un vaisseau sanguin, le nombre de cellules endothéliales est très faible, ce qui rend difficile leur étude. Notre protocole élimine cette limitation et nous permet d’étudier de nouvelles voies moléculaires et thérapeutiques. Notre protocole nous permet d’obtenir des échantillons enrichis endothéliaux et d’étudier comment l’écoulement perturbé aigu et chronique affecte ce type de cellule.
La possibilité d’étudier plus en détail les cellules endothéliales permet de définir des gènes cibles, et donc des thérapies potentielles pour l’athérosclérose ciblant les cellules endothéliales. L’isolement de l’artère carotide est délicat et nécessite de la patience et de l’expérience. Pour commencer, préparez l’animal en injectant 0,05 milligramme par kilogramme de buprénorphine par voie sous-cutanée.
Stériliser la zone épilée en utilisant une solution de bétadine et d’isopropanol trois fois. Faites une incision médiane ventrale d’environ un centimètre dans la région du cou. Ensuite, exposez le point de branche de l’ACV par dissection contondante.
Libellez la carotide interne gauche, la carotide externe et les artères occipitales avec des sutures 6-0, laissant l’artère thyroïdienne supérieure intacte. Fermez l’incision avec de la colle ou des sutures de tissu. Transférez la souris dans une cage de récupération préchauffée maintenue à 37 degrés Celsius.
Placez la souris sur une serviette propre jusqu’à une heure pour éviter l’hypothermie post-chirurgicale. Insérez une aiguille de calibre 21 dans la ligne IV reliée par l’apex du cœur dans le ventricule gauche. Laisser perfusionner rétrograde pendant deux à trois minutes en utilisant une solution saline normale à température ambiante.
Maintenez un débit constant en appliquant une pression constante pendant l’injection ou l’utilisation d’une ligne intraveineuse et en maintenant le sac de solution saline à une hauteur de huit à neuf pieds. Retirez la peau de la région du cou avec toute la graisse, les muscles et les tissus conjonctifs pour exposer les artères carotides. Ensuite, retirez les tissus périadventiels autour des carotides en laissant la carotide attachée au corps.
Faites une incision sous le site de ligature dans l’ACL pour permettre la perfusion. Perfuser l’ACL à travers le ventricule gauche pendant une minute supplémentaire pour éliminer toute trace de sang. Lavez l’extérieur des artères carotides avec une solution saline normale pour éliminer toute trace de sang.
Utilisez une seringue à insuline avec une aiguille de calibre 29 pour injecter 50 microlitres de tampon de digestion dans la lumière de l’extrémité distale de l’artère carotide gauche. Utilisez un micro-clip pour serrer l’extrémité proximale de l’artère carotide remplie de tampon de digestion. Ajouter 15 à 20 microlitres de tampon de digestion dans la lumière et clipser l’extrémité distale pour éviter toute libération de tampon de digestion.
Transférer les artères carotides de la souris dans des boîtes de 35 millimètres contenant une solution saline tamponnée HEPES chaude à 37 degrés Celsius. Et les incuber pendant 45 minutes à 37 degrés Celsius avec un balancement intermittent. Retirez l’artère carotide avec les pinces de la capsule de 35 millimètres une fois la digestion enzymatique luminale terminée.
Détachez soigneusement les pinces afin que le tampon de digestion ne fuie pas. Tenez une extrémité de l’artère carotide au-dessus d’un tube microcentrifuge de 1,5 millilitre. Ajoutez 100 microlitres de tampon de digestion chaude à la lumière en insérant une aiguille de calibre 29 équipée d’une seringue à insuline.
Rincez rapidement la lumière de l’artère carotide dans le tube microcentrifugeux, puis ajoutez 0,3 microlitre de FBS dans le tube pour arrêter la réaction. Placez le tube de microcentrifugation sur de la glace. Centrifuger les cellules à 500 G pendant cinq minutes à quatre degrés Celsius, à l’aide d’une centrifugeuse équipée d’un rotor à angle fixe et jeter le surnageant.
Re-suspendre les cellules dans un tampon de digestion, contenant un réactif de dissociation cellulaire, et les incuber pendant cinq minutes à 37 degrés Celsius pour les séparer en cellules individuelles. Bloquez la réaction enzymatique en ajoutant 0,15 millilitre de FBS au tube de 0,5 millilitre et répétez la centrifugation. Jeter le surnageant et remettre les cellules en suspension dans 100 microlitres de solution glacée à 1% BSA dans du PBS dans un tube microcentrifuge de 0,2 millilitre.
Pour l’analyse d’une seule cellule, remettre en suspension la pastille avec 100 microlitres de 1% de BSA glacé dans du PBS dans un tube de 0,2 millilitre. Pour l’analyse d’un seul noyau, remettre en suspension la pastille de cellule dans 100 microlitres de 0,04% de BSA dans du PBS glacé et centrifuger la suspension unicellulaire à 500 G à quatre degrés Celsius pendant cinq minutes. Décomposez la suspension unicellulaire avec un tampon de lyse glacée et incuber pendant cinq minutes sur de la glace.
Mélanger le lysat avec une pipette P20 et incuber pendant encore 10 minutes. Ensuite, transférez le lysat dans un tube de 0,5 millilitre. Lavez les cellules avec 500 microlitres de tampon et mélangez-les à l’aide d’une pipette.
Répétez ensuite la centrifugation. Jeter le surnageant et remettre en suspension la pastille de noyaux dans 150 microlitres du tampon de noyaux dilués. Compter les préparations à noyau unique à l’aide d’un hémocytomètre.
À la suite de l’étude de séquençage des noyaux uniques, des cellules uniques et des noyaux simples ont été obtenus et visualisés par microscopie à fond clair et à contraste de phase. L’efficacité de la préparation de noyaux simples à partir de la suspension unicellulaire a également été démontrée. Après l’étude de séquençage de l’ARN unicellulaire, divers paramètres tels que la distribution des gènes par cellule, l’identifiant moléculaire unique par cellule, les lectures mitochondriales par cellule et les données de saturation de séquençage ont été obtenus.
Pour l’étude de séquence ATAC unicellulaire, la distribution de la taille de l’insert, y compris le diagramme de bandes nucléosomiques, a été observée. Le score normalisé d’enrichissement du TSS a également été observé. En outre, le fragment de pourcentage se lit dans les pics.
Les fragments de la région de pointe, le score d’enrichissement du SCT, le ratio des lectures dans les sites génomiques de la liste noire et le rapport du signal nucléosome ont été déterminés. La digestion enzymatique est un stress pour les cellules, il est donc crucial de maintenir les échantillons sur la glace et d’effectuer la procédure le plus rapidement possible. Nous pouvons utiliser cette méthode pour obtenir et plaquer des cellules endothéliales à partir de souris.
Nous pouvons également utiliser cette technique pour effectuer des études en vrac basées sur Omix. Cette technique a ouvert la voie à l’étude de l’effet du flux sanguin perturbé sur les cellules endothéliales in vivo d’une manière unicellulaire.
