이 방법은 폭발 상해 외상성 뇌 손상 의 분야에서 주요 질문에 대답하는 데 도움이 될 수 있으며 Vivo 모델에서 더 복잡한 사용하기 전에 신경 보호 약물을 검사하는 데 사용할 수 있습니다. 이 기술의 주요 장점은 실험실 악기를 사용하여 생체외 질량 뇌 조직에 노출되어 재현 가능한 손상을 생성할 수 있는 간단하고 높은 처리량 프로토콜을 사용하여 충격파에 노출된다는 것입니다. 먼저 멸균 맞춤 제작된 스테인리스 스틸 링을 6개의 웰 플레이트의 우물에 삽입합니다.
그런 다음 프로피듐 요오드를 함유한 사전 데운 세럼 없는 실험 매체를 우물에 추가하여 배지 수준이 링의 한 단계 위에 도달하지 못하도록 합니다. 조직 배양 삽입이 전달되기 전에 배지가 섭씨 37도에 있는지 확인하기 위해 플레이트를 인큐베이터로 1시간 동안 전송합니다. 한 시간 후, 6 개의 우물 접시의 링에 성장 접시에서 조직 배양 삽입을 전달합니다.
3시 위치에 인서트 테두리를 만들어 서판자를 원래 위치로 되돌리는 것을 용이하게 한 다음, 각 6개의 웰 플레이트에 고유한 이름과 날짜로 레이블을 지정하고 각 플레이트의 우물지도를 만들어 각 슬라이스에 각 슬라이스에 고유한 식별자가 되도록 합니다. 슬라이스가 이미징 직전에 섭씨 37도에 있는지 확인하기 위해 섭씨 37도에서 1시간 동안 배양합니다. 실험 매체로 옮김 한 시간 후, 각 슬라이스를 저전력하에서 개별적으로 순차적으로 빠르게 이미징하여 슬라이스 상태를 평가합니다.
어두운 방이나 희미한 빛이있는 방에서 이상적인 적절한 흥분 및 방출 필터가 장착 된 형광 현미경을 사용하십시오. 이미징 할 때 접시에 뚜껑을 유지합니다. 뚜껑 안쪽에 일부 응축이 발생할 수 있습니다.
이 경우 뚜껑 바깥쪽의 낮은 설정에 헤어드라이어를 짧게 사용하십시오. 이미징 조건이 다른 날과 실험 간에 동일한지 확인합니다. 기준선에서 건강한 슬라이스는 형광 염색이 거의 나타나지 않습니다.
조밀한 적색 염색 영역을 나타내는 슬라이스는 손상된 생존가능성을 나타내며 추가 분석에서 제외되어야 합니다. 비교를 위해, 72 시간에 폭발 부상 슬라이스에서 형광은 여기에 표시됩니다. 이미징 직후 6개의 웰 플레이트에서 하나의 조직 배양 삽입을 제거하고 95%의 산소와 5%의 이산화탄소로 버블링된 사전 데운 실험 매체 20밀리리터를 함유한 멸균 폴리에틸렌 백으로 조심스럽게 삽입을 전달합니다.
기포를 조심스럽게 제거하고 상단을 비틀고 플라스틱 클램프를 적용하여 멸균 가방을 밀봉하십시오. 각 멸균 가방이 플레이트와 잘 식별된 라벨이 부착되어 있는지 확인하십시오. 각 조직 배양 삽입을 개별 멸균 백으로 옮김한 후, 실험 배지가 있는 가방과 6개의 웰 플레이트를 섭씨 37도 인큐베이터에 넣습니다.
1시간 후, 멸균 봉투에 37도의 이온화된 물로 채워진 열 조절 상자 안에 플라스틱 상자에 조직 배양 삽입물을 조심스럽게 포장하십시오. 물은 충격파 노출 프로토콜을 통해 생리 온도에서 organotypic 조각을 유지해야합니다. 충격 튜브와 충격파 노출을 준비하는 동안 강철 토 보호 부츠, 실험실 코트 및 장갑을 착용하십시오.
블랭킹 로드를 사용하여 멸균 된 가방 홀더 프레임을 충격 튜브 단면 플랜지에 볼트하여 중앙 구멍이 충격 관 콘센트와 정렬되도록합니다. 센서 1, 압력 트랜스듀서, 구동 섹션의 중간 부분에 위치하고, 센서 2는 충격 관의 단면 플랜지에 있다. 이러한 압력 변환기를 현재 소스 전원 전원 장치를 통해 오실로스코프에 연결하고 오실로스코프를 켭니다.
충격관의 솔레노이드 밸브와 유량 제어가 닫혀 있는지 확인하고 외부 압축 공기 라인을 열고 솔레노이드 밸브를 2.5 bar로 충전합니다. 압축 공기 실린더 안전 밸브를 열고 압력 조절기를 천천히 열어 압력을 약 5bar로 증가시다. 다음으로, 23미크로닌 두께의 폴리에스테르 시트를 10-10센티미터 사각형으로 절단하여 다이어프램을 준비합니다.
오토클레이브 테이프에서 핸들을 준비하고 각 다이어프램의 상단과 하단에 고정합니다. 위반에 하나의 다이어프램을 배치하고 중앙에 배치합니다. 다음으로, 4개의 M24 볼트와 너트를 사용하여 다이어프램을 고정합니다.
다이어프램이 주름이 없는지 확인하면서 대각선대칭 방식으로 순차적으로 패션을 하세요. 멸균 백을 홀더 프레임상에 수직으로 고정하여 조직 배양의 표면이 조직 배양의 표면이 충격관 출구를 향하고 있고 조직 배양 삽입이 멸균 백 내부에 집중되도록 한다. 이중 다이어프램 구성의 경우 파열 압력은 드라이버와 이중 위반 챔버 간의 가스 압력 차동에 따라 달라집니다.
따라서 다이어프램이 제어된 방식으로 파열되기 위해 대상 압력에 도달하면 이중 파손 안전 밸브가 수동으로 열립니다. 귀 수비수와 안전 안경에 넣어 아직 착용하지 않은 경우. 솔레노이드 밸브를 닫습니다.
충격파 데이터를 얻기 위해 현재 소스 전원 장치를 켭다. 충격관 제어판의 유동 제어 노브를 조작하여 충격관의 운전자 부피 섹션을 단일 다이어프램 구성 또는 이중 다이어프램 구성을 위한 충격 튜브의 이중 위반 섹션모두에 대해 천천히 가압한다. 다이어프램이 파열되는 즉시, 유동 노브를 사용하여 압축 공기 흐름을 빠르게 닫고 솔레노이드 밸브를 엽니다.
충격파 매개 변수의 이상적인 조합은 조직 손상을 일으키는 원인이 되기위하여 충분해야 하지만 조직 배양 삽입 또는 멸균 가방 왜곡 또는 파열을 일으키는 원인이 되기 위하여 이렇게 높지 않아야 합니다. 각 슬라이스를 하나의 충격 튜브 웨이브에 노출한 후 열 조절 상자에 즉시 반환합니다. 그런 다음 상자에서 다음 멸균 가방을 가져 와서 홀더 프레임에 고정하십시오.
37 이하의 온도가 부상 발달을 방해할 수 있기 때문에 실험 매체의 냉각을 방지하기 위해 스위치를 원활하고 신속하게 수행합니다. 일단 모든 조직 배양 삽입충격파 또는 가짜 프로토콜에 노출되면, 조직 배양 삽입을 원래 6개의 웰 플레이트에 있는 그들의 우물에 반환하고 추가 화상 진찰이 될 때까지 인큐베이터로 돌아갑니다. 이 이미지는 55킬로파스칼 피크 과압으로 23미크론 두께의 폴리에스테르 필름을 사용하여 얻은 충격파의 대표적인 예입니다.
충격파 속도는 초당 440미터였습니다. 50 킬로파스칼 피크 과압 충격파는 모두 sham 단과 비교할 때 72 시간 프로토콜을 통해 개발된 중요한 상해를 일으켰습니다. 55킬로파스칼 피크 과압 파 노출로 인한 부상은 48시간 72시간 동안 50킬로파스칼 이후보다 현저히 높았으며, 부상의 발달은 충격파의 강도에 비례한다는 것을 입증했다.
이 이미지는 50킬로파스칼 폭발 후 72시간 동안 슬라이스를 보여줍니다. 높은 수준의 확산 부상이 표시됩니다. 부상은 55 킬로파스칼 피크 과압 폭발 후 더 두드러집니다.
이 프로피듐 요오드 형광 이미지는 가짜 실험에서 organotypic 조각을 보여줍니다. 가짜 슬라이스는 낮은 수준의 형광을 보여줍니다. 이 절차를 시도하는 동안 조직의 오염을 피하고 의도하지 않은 세포 손상을 피하기 위해 조직 배양을 신속하고 부드럽게 조작하기 위해 무균 기술을 유지하는 것이 중요합니다.
이 절차에 따라, 면역 형광 염색 과 같은 그밖 방법은 폭발 유도한 외상성 두뇌 상해에 관련시킨 세포 죽음의 기계장치가 무엇이다 와 같은 추가 질문에 대답하기 위하여 수행될 수 있습니까? 이 기술은 신경 보호 분야의 연구진을위한 높은 처리량 분석이 폭발 충격파에 노출 된 후 세포 죽음과 뇌 조직의 확산을 방지하기 위해 약물의 잠재력을 탐구 할 수 있습니다.
