この方法は、爆発傷害性外傷性脳損傷の分野での主要な質問に答えるのに役立ち、Vivoモデルでより複雑な使用の前に神経保護薬をスクリーニングするために使用することができる。この技術の主な利点は、再現性のある傷害の作成を可能にする単純で高いスループットプロトコルを使用して衝撃波にインビトロ質量脳組織を公開するために実験室の器具を使用することです。まず、滅菌カスタムメイドのステンレス製リングを6つのウェルプレートの井戸に挿入します。
次に、ヨウ化プロピジウムを含む事前温めた無血清実験培地をウェルに加え、培地のレベルがリングのノッチの上に達しないことを保証します。プレートをインキュベーターに1時間移し、組織培養インサートが移送される前に培地が摂氏37度であることを確認します。1時間後、組織培養物を成長皿から6つのウェルプレートのリングに挿入する。
3時位置のインサートリムに恒久的なマーカーペンを付けて、挿入物を元の位置に戻すことを容易にし、6つのウェルプレートに一意の名前と日付を付け、各プレートの井戸の地図を作成し、各スライスに数字を付けて各ウェルに名前を付けます。37°Cで1時間インキュベートし、イメージングの直前にスライスが摂氏37度であることを確認します。実験培地に移してから1時間後、各スライスを個別かつ逐次的に低電力で素早くイメージングしてスライスの健全性を評価します。
暗い部屋や薄暗い光を持つ部屋で、適切な励起および発光フィルターを取り付けた蛍光顕微鏡を使用してください。イメージを作成するときは、蓋をプレートに置いてください。蓋の内側に凝縮が生じる場合があります。
このような場合は、蓋の外側の低い設定でヘアドライヤーを簡単に使用してください。異なる日と実験の間に、イメージング条件が同一であることを確認します。ベースラインでは、健康なスライスは蛍光染色をほとんど示していません。
密な赤色染色の領域を示すスライスは、危険な生存率を示し、さらなる分析から除外する必要があります。比較のために、72時間での爆風負傷スライスからの蛍光をここに示す。イメージングの直後に、6つのウェルプレートから1つの組織培養インサートを取り除き、95%の酸素と5%の二酸化炭素で泡立てた20ミリリットルの事前温められた実験培地を含む滅菌ポリエチレンバッグに慎重に挿入物を移します。
気泡を慎重に取り除き、上部をねじってプラスチッククランプを適用して滅菌袋を密封します。各滅菌バッグがプレートとよく識別されたラベルが正しく付けられていることを確認します。各組織培養インサートを個々の滅菌袋に移した後、袋と実験培地付きの6つのウェルプレートを37°Cインキュベーターに入れます。
1時間後、37°Cのイオン化水で満たされた熱調節箱の中のプラスチックボックスに組織培養インサートを入れた滅菌袋を慎重に梱包します。水は衝撃波暴露プロトコル全体の生理学的温度で組織のスライスを保つべきである。衝撃管と衝撃波暴露の準備中に、スチールトーの保護ブーツ、実験室のコート、手袋を着用してください。
ブランキングロッドを使用して、無菌バッグホルダーフレームをショックチューブ遠位フランジにボルトで固定し、中央の穴がショックチューブの出口に合っていることを確認します。センサ1は、圧力トランスデューサ、駆動部の中央部に位置し、センサ2は衝撃管の遠位フランジにある。これらの圧力トランスデューサを現在の電源電源ユニットを介してオシロスコープに接続し、オシロスコープをオンにします。
ショック管のソレノイドバルブとフロー制御が閉じられていることを確認し、外部の圧縮空気ラインを開き、ソレノイドバルブを2.5バールに充電します。圧縮空気シリンダー安全弁を開き、圧力レギュレータをゆっくりと開けて圧力を約5つのバーに引き上げます。次に、厚さ23ミクロンのポリエステルシートを10~10センチメートルの正方形に切ってダイアフラムを準備します。
オートクレーブテープからハンドルを準備し、各ダイヤフラムの上部と下部に貼り付けます。違反に1つのダイヤフラムを配置し、中央に配置されていることを確認します。次に、4本のM24ボルトとナットを使用してダイヤフラムをクランプします。
ダイアフラムがしわのない状態であることを確認しながら、斜め対称の方法でそれらを順番にファッション。ホルダーフレームの垂直位置に滅菌バッグをクランプして、組織性海馬スライスを使用した組織培養挿入物の表面がショックチューブ出口に面しており、組織培養インサートが滅菌バッグの中を中心にしていることを確認します。二重ダイヤフラム構成では、破裂圧力は、ドライバと二重破断室間のガス圧力差に依存します。
従って、ダイアフラムが制御された方法で破裂するために、二重破断安全弁は目標圧力に達したら手動で開かれる。まだ着用していない場合は、耳のディフェンダーと安全眼鏡を着用してください。ソレノイドバルブを閉じます。
現在の電源電源ユニットの電源を入れ、衝撃波データを取得します。ショックチューブコントロールパネルのフロー制御ノブを操作して、ショックチューブのドライバーボリュームセクションを単一のダイヤフラム構成またはドライバーボリュームセクションと二重ダイヤフラム構成用のショックチューブの二重破断セクションの両方にゆっくりと加圧します。ダイヤフラムが破裂するとすぐに、フローノブを使用して圧縮空気の流れを素早く閉じ、ソレノイドバルブを開きます。
衝撃波パラメータの理想的な組み合わせは、組織損傷を引き起こすのに十分である必要がありますが、組織培養挿入物または滅菌バッグの歪みまたは破裂を引き起こすほど高くはありません。各スライスを単一の衝撃管波に当てはめた後、すぐに熱調節ボックスに戻します。次に箱から次の滅菌袋を取り出し、ホルダーフレームにクランプします。
37以下の温度が損傷の発生を妨げる可能性があるため、実験媒体の冷却を防止するために、スイッチをスムーズかつ迅速に実行します。すべての組織培養インサートが衝撃波または偽のプロトコルにさらされたら、組織培養インサートを元の6つのウェルプレートのウェルに戻し、さらなるイメージングまでインキュベーターに戻ります。この画像は、55キロパスカルピーク過圧を有する23ミクロン厚ポリエステルフィルムを用いて得られた衝撃波の代表例である。
衝撃波の速度は毎秒440メートルでした。50と55キロパスカルピーク過圧衝撃波の両方が、シャムグループと比較して72時間プロトコル全体で発症する重大な傷害を引き起こしました。55キロパスカルピーク過圧波暴露に起因する傷害は、48時間および72時間で50キロパスカル後よりも有意に高く、損傷の発症が衝撃波の強度に比例していることを示した。
この画像は、50キロパスカルブラストの72時間後のスライスを示しています。高レベルのびまん性損傷が見える。55キロパスカルピーク過圧爆発後の傷害はより顕著である。
このプロピジウムヨウ化蛍光画像は、偽の実験からのorganotypicスライスを示しています。シャムスライスは、蛍光の低レベルを示しています。この手順を試みる間、組織の汚染を避けるために、組織培養物を迅速かつ非常に穏やかに操作して、意図しない細胞損傷を避けるために、無菌技術を全体にわたって維持することが重要です。
この手順に従って、免疫蛍光染色のような他の方法は、爆発誘発性外傷性脳損傷に関与する細胞死のメカニズムが何であるかのような追加の質問に答えるために行うことができる?この技術は、神経保護の分野の研究者のための高スループットアッセイが爆発衝撃波にさらされた後の細胞死および脳組織の広がりを防ぐ薬物の可能性を探ることを可能にする。
