Bu yöntem patlama yaralanması travmatik beyin hasarı alanında anahtar sorulara cevap yardımcı olabilir ve Vivo modellerinde daha karmaşık kullanmadan önce nöroprotektif ilaçlar ın ekran için kullanılabilir. Bu tekniğin en büyük avantajı, tekrarlanabilir bir yaralanma yaratılmasına olanak sağlayan basit ve yüksek iş elde etme protokolünü kullanarak in Vitro kitle beyin dokusunu bir şok dalgasına maruz bırakmak için bir laboratuvar aleti kullanmasıdır. İlk olarak, altı kuyu plaka kuyularına steril özel yapılmış paslanmaz çelik halkalar takın.
Daha sonra, orta seviyesinin halkanın çentik yukarısına ulaşmamasını sağlayan kuyulara propidium iyodürlü önceden ısıtılmış serumsuz deneysel ortam ekleyin. Doku kültürü kesici uçlar transfer edilmeden önce ortamın 37 santigrat derecede olduğundan emin olmak için plakayı bir saat boyunca kuvöze aktarın. Bir saat sonra, transfer doku kültürü altı kuyu plaka halkaları üzerine büyüme yemekleri organotipik dilimler ile ekler.
Eklerin orijinal konumuna geri dönmesini kolaylaştırmak için saat üç konumundaki kesici kalemle kesici uç kenarına bir nokta yapın, ardından her altı kuyu plakasını benzersiz bir ad ve tarihle etiketleyin ve her bir plakanın kuyularının haritasını yapın, her bir kuyuyu bir harfle ve kuyudaki her dilime bir numarayla adlandırın, böylece her dilimde benzersiz bir tanımlayıcı bulun. Dilimlerin görüntülemeden hemen önce 37 derecede olduğundan emin olmak için bir saat boyunca 37 derecede kuluçkaya yatırın. Deneysel ortama geçtikten bir saat sonra, her dilimi tek tek ve sırayla düşük güç altında hızlı bir şekilde görüntüleyerek dilim sağlığını değerlendirin.
Koyu renkli bir odada veya loş ışıklı bir odada ideal bir uyarma ve emisyon filtresi ile donatılmış bir floresan mikroskobu kullanın. Görüntüleme yaparken kapağı plakanın üzerinde tutun. Kapağın iç tarafında bazı yoğuşmalar oluşabilir.
Bu durumda, kısaca kapağın dışında düşük ayarı üzerinde bir saç kurutma makinesi kullanın. Görüntüleme koşullarının farklı günlerde ve deneyler arasında aynı olduğundan emin olun. Temel olarak, sağlıklı dilimler çok az floresan boyama gösterir.
Yoğun kırmızı boyama alanları sergileyen dilimler, uzlaşmacı canlılığı gösterir ve daha fazla analizden çıkarılmalıdır. Karşılaştırma için, 72 saat içinde patlama yaralı dilim floresan burada gösterilmiştir. Görüntülemeden hemen sonra, altı kuyu plakasından bir doku kültürü kesici sini çıkarın ve kesici ucu %95 oksijen ve %5 karbondioksit le kabarmış 20 mililitre önceden ısıtılmış deneysel ortam içeren steril polietilen torbaya dikkatlice aktarın.
Dikkatlice herhangi bir hava kabarcıkları kaldırmak ve üst büküm ve plastik bir kelepçe uygulayarak steril çanta mühür. Her steril çantanın plaka ve iyi tanımlama ile doğru bir şekilde etiketlenmiş olduğundan emin olun. Her doku kültürü eklemek bireysel bir steril torbaya aktardıktan sonra, 37 derece Santigrat inkübatör içine deneysel orta ile çanta ve altı kuyu plakaları yerleştirin.
Bir saat sonra, steril torbaları, 37 santigrat derecede iyonize suyla dolu termal düzenlenmiş bir kutunun içindeki plastik kutulara doku kültürü ekler ekleyerek dikkatlice paketleyin. Su şok dalgası maruz kalma protokolü boyunca fizyolojik sıcaklıkta organotipik dilimleri tutmak gerekir. Şok tüpü ve şok dalgasına maruz kalma nın hazırlanması sırasında çelik burunlu koruyucu botlar, laboratuvar paltosu ve eldiven giyin.
Steril torba tutucu çerçeveyi şok tüpü distal flanşına sürtmek için bir boşluk çubuğu kullanın ve merkezi deliğin şok tüpü çıkışıyla hizalanmasını sağlar. Sensör bir, bir basınç dönüştürücü, tahrikli bölümün orta kısmında bulunan, ve sensör iki şok tüpdistal flanş bulunmaktadır. Bu basınç transdüserlerini mevcut bir kaynak güç ünitesi aracılığıyla bir osiloskopa bağlayın ve osiloskopu açın.
Şok tüpün solenoid valfinin ve akış kontrolünün kapalı olduğundan emin olun, ardından harici basınçlı hava hattını açın ve solenoid valfi 2,5 bar'a şarj edin. Basınçlı hava silindiri emniyet valfini açın ve basıncı yaklaşık beş bar'a çıkarmak için basınç regülatörü yavaşça açın. Daha sonra, 10 santimetre kareler içine 23 mikron kalınlığında polyester levhalar keserek diyafram hazırlamak.
Otoklav bandından tutamaçları hazırlayın ve her diyaframın üst ve altına yapıştırın. Bir diyaframı ihlale yerleştirin ve ortalandıklarından emin olun. Daha sonra, diyafram dört M24 cıvata ve somun kullanarak kelepçe.
Diyaframkırışıklıkücretsiz sağlarken çapraz simetrik bir şekilde sırayla moda. Doku kültürünün yüzeyinin organotipik hipokampal dilimlerle birlikte şok tüpü çıkışına ve doku kültürü kesici ucunun steril torbanın içine ortalanmasını sağlayan, tutucu çerçeveüzerinde dikey bir pozisyonda steril bir torbayı kenetleyin. Çift diyafram konfigürasyonu için, patlama basıncı sürücü ve çift gedik odası arasındaki gaz basıncı diferansiyel bağlıdır.
Bu nedenle, diyaframların kontrollü bir şekilde patlaması için, çift taraflı güvenlik valfi hedef basınçlarına ulaşıldıktan sonra manuel olarak açılır. Zaten giyilmemişse kulak koruyucularını ve güvenlik gözlüklerini takın. Solenoid valfi kapatın.
Shockwave verilerini elde etmek için geçerli kaynak güç ünitesini açın. Tek diyafram konfigürasyonu için şok tüpünün sürücü hacim bölümüne veya hem sürücü hacmi bölümüne hem de çift diyafram konfigürasyonu için şok tüpünün çift ihlal bölümüne ve şok tüpünün çift gedikli bölümüne yavaşça basmak için şok tüpü kontrol panelindeki akış kontrol tonuzunu manipüle edin. Diyafram yırtılır kırılmaz, akış topuzlarını kullanarak basınçlı hava akışını hızla kapatın ve solenoid valfi açın.
Shockwave parametrelerinin ideal kombinasyonu doku yaralanmasına neden olmak için yeterli olmalıdır, ancak doku kültürü eklemek veya steril torba bozulması veya rüptürü neden olacak kadar yüksek olmamalıdır. Her dilimi tek bir şok tüp dalgasına maruz kaldıktan sonra, hemen termal düzenlenmiş kutuya geri verin. Sonra kutudan bir sonraki steril çanta almak ve tutucu çerçeve üzerinde kenetleyin.
37'nin altındaki sıcaklıklar yaralanma gelişimini engellediğinden, deneysel ortamın soğumasını önlemek için anahtarı sorunsuz ve hızlı bir şekilde gerçekleştirin. Bir kez tüm doku kültürü ekler bir shockwave veya sahte protokol maruz kalmış, orijinal altı kuyu plaka kendi kuyularına doku kültürü ekler dönmek ve daha fazla görüntüleme kadar kuvöz dönmek. Bu görüntü, 55 kilopascal pik basınç ile 23 mikron kalınlığında polyester film kullanılarak elde edilen bir shockwave temsili bir örnektir.
Şok dalgasının hızı saniyede 440 metreydi. Hem 50 hem de 55 kilopascal pik basınç şok dalgaları, 72 saatlik protokol boyunca sham grubuyla karşılaştırıldığında gelişen önemli yaralanmalara neden oldu. 55 kilopascal pik aşırı basınç dalgası maruziyetinden kaynaklanan yaralanma, 48 saat 72 saat 50 kilopascal'dan önemli ölçüde daha yüksekti ve yaralanmanın gelişiminin şok dalgasının yoğunluğuyla orantılı olduğunu gösterdi.
Bu resim, 50 kilopascal patlamadan 72 saat sonra bir dilim gösteriyor. Yüksek düzeyde diffüz yaralanma görülebilir. Yaralanma daha 55 kilopascal pik aşırı basınç patlaması ndan sonra belirgindir.
Bu propidium iyodür floresan görüntü sahte bir deneyden bir organotipik dilim gösterir. Sahte dilim düşük floresan seviyelerini gösteriyor. Bu prosedürü denerken, doku kontaminasyonunu önlemek için boyunca bir aseptik tekniği korumak ve istenmeyen hücre hasarı önlemek için doku kültürlerini hızlı ama çok nazikçe manipüle etmek için hatırlamak önemlidir.
Bu prosedürü takiben, immünoresans boyama gibi diğer yöntemler patlamaya bağlı travmatik beyin hasarına bağlı hücre ölümü mekanizmaları nelerdir gibi ek soruları cevaplamak için yapılabilir? Bu teknik, nörokoruma alanında araştırmacılar için yüksek bir iş bölümü tonu patlama şok dalgalarımaruz kaldıktan sonra hücre ölümü ve beyin dokusunun yayılmasını önlemek için ilaçların potansiyelini keşfetmek için izin verir.
