Les animaux des cavernes fournissent un système convaincant pour étudier divers traits morphologiques, développementaux et comportementaux. Mais l’un des facteurs limitants dans l’établissement de ce système modèle est le manque d’outils génétiques qui nous permettraient de manipuler la fonction génétique. Ici, nous démontrons trois approches différentes pour manipuler la fonction génétique chez les poissons des cavernes mexicaines, Astyanax mexicanus.
Ces outils permettront d’étude des gènes sous-jacents aux variations naturelles entre les poissons de surface et les poissons des cavernes et de leur relation avec les phénotypes. Bethany Stahl, un postdoc talentueux dans mon laboratoire démontrera cette procédure. Avant de commencer la procédure, remplissez une boîte petri de 100 millilitres avec de l’agarose chaude de 3% dissoute dans l’eau du système de poisson et placez soigneusement un moule d’injection d’oeuf dans l’agarose à un angle de 45 degrés, avant d’abaisser lentement le moule dans l’agarose pour éviter de piéger l’air sous le moule.
Lorsque l’agarose s’est solidifiée, retirez soigneusement le moule puis stockez la plaque à quatre degrés Celsius jusqu’à une semaine. Puis tirez les aiguilles des capillaires en verre borosilicate et d’un tire-aiguille d’électrode selon les directives du fabricant. Le jour de l’injection, utiliser une pipette en verre pour transférer les œufs à cellule unique dans la plaque d’injection, remplissant jusqu’à cinq rangées de la plaque d’injection avec 30 à 40 œufs par rangée.
Gardez les œufs hydratés avec une petite quantité d’eau du système de poisson. Décongeler Morpholino sur la glace et préparer la solution d’injection de sorte que 400 picogrammes de Morpholino est injecté par œuf en utilisant une longue pointe de pipette Microloader ou en ajoutant un bolus de deux à quatre microlitres à la fin. Lorsque toutes les aiguilles ont été chargées, utilisez des forceps pour couper l’excès de longueur des extrémités de l’aiguille d’injection et monter la première aiguille dans un micromanipulateur relié à un microinjecteur picolitre.
Ensuite, placez le plat d’injection sous un microscope disséquant et utilisez le micromanipulateur pour pénétrer chaque œuf avec l’aiguille avant d’injecter un nanolitre de solution d’injection Morpholino directement dans le jaune. Pour l’injection CRISPR, mélanger 25 picogrammes d’ARN guide avec 300 picogrammes de protéine CRISPR associée 9 ARN messager et injecter deux nanolitres de la solution arn résultant dans chaque embryon comme démontré. Pour la transposase Tol2 et l’injection de plasmides flanqués Tol2, combinez 25 nanogrammes par microlitre d’ARN messager Tol2 avec 25 nanogrammes par microlitre de construction plasmide Tol2 et rouge phénol dans l’eau exempte de RNase.
Injectez ensuite un nanolitre de solution dans chaque embryon comme nous venons de le démontrer. Pour filtrer les animaux injectés par Morpholino à quatre jours après l’injection, selon le gène d’intérêt, visualisez les larves de poissons au microscope stéréo pour observer le phénotype des animaux injectés ou enregistrez vidéo pour mesurer le comportement. Pour dépister les indels CRISPR, transférez les embryons injectés crispr dans des tubes PCR et extrayez l’ADN selon les protocoles standard d’extraction de l’ADN pour la réaction en chaîne de polymése ou l’analyse PCR.
Pour évaluer la mutagenèse, exécutez cinq microlitres du produit PCR sur un gel d’agarose de 3% à 70 volts pendant trois heures. L’ADN non mutagenisé de type sauvage donnera lieu à une bande distincte, tandis que l’ADN mutant se traduira par une bande de frottis. Grotte Un mexicanus injecté avec un Morpholino de contrôle présente beaucoup plus d’activité locomotrice et réduit le sommeil sur une période de 24 heures, par rapport aux poissons de surface injectés avec un Morpholino brouillé.
L’injection de l’hypocrétine orexine Morpholino a peu d’effet sur le sommeil dans les poissons de surface par rapport aux poissons injectés par le contrôle. En revanche, le renversement d’hypocrétine ou d’exine par injection de Morpholino a un effet significatif sur le sommeil dans les poissons caverne-logement, fournissant un lien direct entre l’expression d’orexine d’hypocrétine et la perte de sommeil. La mutagenèse médiée par le CRPSR du gène albinisme OCA2 chez les poissons de surface entraîne chez certains individus homozygotes pour l’allèle positif OCA2 de type sauvage, et est associée à la pigmentation, tandis que les individus qui ont deux copies de l’allèle négatif CRISPR-mutated OCA2 sont albinos, fournissant un lien direct entre le gène mutant OCA2 et l’albinisme chez les poissons des cavernes.
Sélectionnez F0 positif pour le Transgène transmis Tol2 à revenir à travers le type sauvage pour générer des lignes stables F1. Cela permet l’imagerie en calcium en direct pour découvrir les différences dans l’activité neuronale, la médiation des changements comportementaux dans l’environnement des grottes, jetant les bases de l’expression de nombreux transgènes supplémentaires pour caractériser et manipuler la fonction génétique dans un mexicanus. Les choses les plus importantes à retenir sont de charger les oeufs étroitement sur la plaque, de couper l’aiguille correctement, et d’optimiser la microinjection.
Après un renversement génétique réussi, l’intégration transgénique, ou l’édition de gène CRISPR-médiée, ces poissons peuvent être utilisés pour des analyses développementales, comportementales, et d’activité de cerveau.
