Dreadds sont l’approche chimiogénétique la plus populaire pour la télécommande de l’activité neuronale. Ici, nous offrons de nouvelles alternatives pour le contrôle répétitif ou chronique dreadd, en mettant l’accent sur les méthodes d’administration moins invasives CNO. Nous décrivons deux stratégies pour la livraison prolongée de CNO chez les souris par des gouttes oculaires répétitives, ou chroniquement par l’eau potable de l’animal.
Les protocoles décrits ici sont des exemples d’options chroniques et non invasives pour la livraison de CNO qui peuvent être adaptées à une variété de conceptions expérimentales, y compris différentes variantes DREADD, tissus, ou même des espèces. Un problème clé pour une livraison de CNO est le stress et la douleur d’un animal. Ces protocoles minimisent ce problème et sont faciles à exécuter et à adapter aux différents paramètres expérimentaux.
Avant d’effectuer la chirurgie, nettoyez et stérilisez le cadre stéréotaxique et tous les instruments nécessaires. Lorsque le cadre est prêt, confirmer un manque de réponse au pincement des pieds dans un fond mixte anesthésié souris mâle de type sauvage, raser le haut de la tête, et fixer la tête de la souris au cadre. Appliquez ensuite un lubrifiant protecteur oculaire sur les yeux et, enfin, nettoyez la peau exposée avec de l’iode séquentiel de povidone et des gommages à 70 % d’éthanol.
Utilisez un scalpel stérile pour exposer le crâne et calibrer le cadre jusqu’au point de bregma. Forez à une coordonnée médialatérale de 2,9 millimètres, et une coordonnée postérieure antérieure de moins 2,7 millimètres pour cibler l’hippocampe. Lorsque le cerveau est exposé, utilisez un micro-injecteur et des pipettes microcapillaires tirées pour injecter unilatéralement 90 nanolitres du virus adénoassocié dans l’hippocampe à une profondeur ventrale dorsale de moins trois millimètres.
Ensuite, fermez l’incision avec des sutures de nylon, et retirez l’animal du cadre pour l’administration d’analgésie. Pour l’accouchement répétitif par CNO, à partir de quatre semaines après l’injection, acclimatez les animaux à la manipulation en débraillant chaque souris trois minutes par jour pendant trois à quatre jours avant l’administration des gouttes oculaires. Lorsque les souris se sont acclimatées à la manipulation, peser chaque souris pour déterminer la quantité appropriée de CNO à livrer pour atteindre un milligramme de CNO par kilogramme de concentration de poids corporel.
Deux heures avant l’arrêt des lumières pendant la phase inactive, chargez un à trois microlitres de la solution CNO préparée dans une micropipette P10 et immobilisez la souris par scruffing. Expulsez lentement la solution jusqu’à ce qu’une gouttelette stable se forme sur la pointe de la pipette et amenez soigneusement la gouttelette près de la cornée jusqu’à ce que la solution soit livrée sans toucher la pointe de la pipette à l’œil de la souris. Ensuite, retournez la souris dans sa cage avant d’appliquer la goutte oculaire CNO à l’œil de l’animal suivant.
Dans les cas où le CNO doit être livré pendant la phase active de la souris, assurer la présence d’une faible lumière rouge pour une manipulation adéquate des animaux et la livraison du CNO. Pour le traitement chronique par CNO, à partir de quatre semaines après l’injection et trois jours avant le début du traitement, remplacer les bouteilles d’eau régulières par de petites bouteilles arrêtées par des becs en caoutchouc et recouvertes de papier d’aluminium contenant 10 millilitres d’eau ordinaire. Fixer les cages avec du ruban adhésif pour permettre aux souris de s’acclimater aux bouteilles.
Mesurez la consommation quotidienne d’eau pour chaque souris et pesez chaque souris. Testez une gamme de concentrations de CNO pour déterminer la dose qui affiche l’efficacité maximale avec la concentration minimale de CNO. Remplissez ensuite chaque petite bouteille de huit millilitres d’eau ordinaire plus la quantité requise de CNO.
Pour un traitement restreint par CNO, commençant quatre semaines après l’injection et trois jours avant le début du traitement, placez une petite bouteille contenant 10 millilitres d’eau plus 1 % de saccharose sur la cage loin de la bouteille d’eau d’origine pendant la dernière partie de la phase active de l’animal. À la fin de l’exposition, retirez l’eau et les solutions de saccharose de chaque cage et mesurez la consommation d’eau saccharose pour chaque animal. Pour la livraison du CNO, remplissez les bouteilles de cinq millilitres d’eau plus 1 % de saccharose et un milligramme par kilogramme de CNO.
Placez la bouteille dans la même position que pendant la période d’acclimation de l’eau sucrée pendant la dernière partie de la phase active, en enlevant les bouteilles et en mesurant la quantité d’eau, de saccharose et de CNO consommée comme démontré. À la fin de l’expérience, récolter le cerveau animal traité en fixatif frais. Après 9 à 12 heures, cryoprotect le tissu cérébral dans une solution de saccharose de 30%.
Lorsque le cerveau coule, sectionner l’échantillon sur un cryostat. Lorsque toutes les sections du cerveau ont été obtenues et que la liaison non spécifique est bloquée, incuber les échantillons de tissus avec une solution anticorps anti-c-Fos à quatre degrés Celsius pendant la nuit avec agitation constante. Le lendemain matin, lavez les échantillons avec trois lavages de cinq minutes en PBS frais par lavage avant d’incuber les échantillons avec un anticorps secondaire conjugué à fluorescence approprié.
Après une heure à température ambiante et une agitation constante à l’abri de la lumière, obtenez des images numériques des sections de tissus étiquetés par microcroscopie confoccale de fluorescence. Après le chargement des images dans ImageJ, décrire à mesure les zones des cellules mCherry positives infectées associées à Adeno et quantifier le nombre de cellules C faussement positives dans cette région pour obtenir le nombre de cellules activées par zone. La livraison répétitive de CNO utilisant des gouttes d’oeil obtient une induction robuste de l’expression de cFos dans la plupart des neurones infectés démontrant que l’efficacité de la livraison de CNO est soutenue pendant l’exposition répétitive.
De plus, une induction significative de cFos est observée dans les échantillons prélevés deux heures après le traitement par CNO par rapport aux échantillons obtenus six heures après l’exposition au CNO, ce qui indique que les changements induits par le CNO dépendent du temps. La consommation quotidienne d’eau plus cno n’est pas significativement différente par rapport au volume total d’eau ordinaire consommée. De même, la quantité d’eau plus 1 % de saccharose consommée pendant la nuit n’est pas affectée par l’ajout de CNO, pas plus les différences dans la consommation quotidienne d’eau plus le CNO, et l’eau plus le saccharose plus le CNO observées sur une période expérimentale de cinq jours.
Semblable à l’application des gouttes oculaires de CNO, une induction robuste de cFos est observée après deux, mais pas six heures d’accès à l’eau potable de CNO. En outre, il y a un seuil clair d’efficacité pour CNO car une faible dose de CNO n’obtient pas l’activation de cFos comparée à un contrôle salin, tandis que des doses plus élevées induisent une induction robuste et semblable de cFos. Nous recommandons d’effectuer une analyse de la réponse à la dose pour définir la dose de CNO la plus faible qui ne réduit pas significativement l’activation neuronale, et en considérant l’utilisation de la clozapine comme ligand.
Ici nous avons démontré utilisant l’induction cfos CNO-médiée à la suite de l’activation neuronale. Cependant, ces protocoles peuvent être facilement adoptés à l’analyse électrophysiologique ou aux tests comportementaux. La technologie DREADD est un outil puissant pour la télécommande de l’activité neuronale, et la conception de stratégies alternatives pour la livraison de CNO.
Nous allons augmenter le spectre des options pour les milieux expérimentaux et les interventions cliniques potentielles.
