Les auteurs tiennent à remercier le Centre de l&#39;UC Riverside pour gliales neuronaux Interactions de discussion précieux des protocoles et des données mise à l&#39;échelle. Les auteurs souhaitent également donner un remerciement sincère à Abcam pour le parrainage de la publication de leurs travaux.

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	<li>Araque, A., Martin, E. D., Perea, G., Arellano, J. I., Buno, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Synaptically+released+acetylcholine+evokes+Ca2++elevations+in+astrocytes+in+hippocampal+slices.">Synaptically released acetylcholine evokes Ca2+ elevations in astrocytes in hippocampal slices.</a> J. Neurosci. 22, 2443-2450 (2002).</li><li>Navarrete, M., Araque, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Endocannabinoids+mediate+neuron-astrocyte+communication.">Endocannabinoids mediate neuron-astrocyte communication.</a> Neuron. 57, 883-893 (2008).</li><li>Bekar, L. 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A., Soriano, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neuronal+activity+regulates+correlated+network+properties+of+spontaneous+calcium+transients+in+astrocytes+in+situ.">Neuronal activity regulates correlated network properties of spontaneous calcium transients in astrocytes in situ.</a> J. Neurosci. 22, 9430-9444 (2002).</li><li>Takata, N., Hirase, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cortical+layer+1+and+layer+2/3+astrocytes+exhibit+distinct+calcium+dynamics+in+vivo.">Cortical layer 1 and layer 2/3 astrocytes exhibit distinct calcium dynamics in vivo.</a> PLoS ONE. 3, e2525 (2008).</li><li>Salahpour, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=BRET+biosensors+to+study+GPCR+biology,+pharmacology,+and+signal+transduction.">BRET biosensors to study GPCR biology, pharmacology, and signal transduction.</a> Front. Endocrinol. 3 (105), (2012).</li><li>Di Castro, M. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Local+Ca2++detection+and+modulation+of+synaptic+release+by+astrocytes.">Local Ca2+ detection and modulation of synaptic release by astrocytes.</a> Nat. Neurosci. 14, 1276-1284 (2011).</li><li>Sun, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Glutamate-dependent+neuroglial+calcium+signaling+differs+between+young+and+adult.">Glutamate-dependent neuroglial calcium signaling differs between young and adult.</a> Science. 339, 197-200 (2013).</li></ol>

Les auteurs tiennent à indiquer la tétrodotoxine utilisée dans ces études a été acheté chez Abcam. Abcam n&#39;était pas impliqué dans les hypothèses, la conception ou la collecte de données. Toute communication relative au parrainage de l&#39;œuvre par Abcam a eu lieu après le processus d&#39;examen par les pairs a été complète.

Les modèles d&#39;échelle décrites représentent des méthodes pratiques pour la recherche plasticité à long terme d&#39;un groupe astrocytaire je mGluR. Imagerie Ca 2 + événements spontanés et évoqués fournit un test sensible pour mesurer les changements dans l&#39;activité Gq GPCR astrocytes, comme preuve solide a été établi que astrocytes Ca 2 + élévations se produisent suite à la libération de la propriété intellectuelle 3 magasins de R-sensible en aval de l&#39;activation Gq GPCR 10, 12, 17, 18. Le pourcentage des astrocytes dans la population face au groupe I mGluR agoniste et le motif de ces Ca 2 + réponses signalent des changements dans le groupe I mGluR par les astrocytes. La technique spécifique utilisée pour charger les astrocytes Ca 2 + indicateur est une considération importante dans la conception d&#39;expériences pour chercher les changements dans l&#39;activité Gq GPCR astrocytes. Bolus chargement ou plusieurs astrocytes de chargement en vrac, ou patch-clamp chargement des astrocytes individuels peut être utilisé pour l&#39;image de Ca 2 + transitoires dans les astrocytes. Chaque approche offre des avantages et des inconvénients. Remplissant directement les astrocytes Ca 2 + indicateur via patch clamp permet l&#39;identification sans équivoque de la cellule comme un astrocyte sans nécessité d&#39;un marqueur secondaire tel que SR-101. Livraison de patch-clamp de l&#39;indicateur permet également l&#39;enregistrement de Ca 2 + activité de petits compartiments astrocytaires y compris les processus fines broussailleux, potentiellement plus profondes dans la tranche où les cellules sont en meilleure santé et avec des interactions plus intactes avec des synapses (en fonction de la puissance du laser disponible). Cependant, patch-clamp charge souffre d&#39;une faible débit que les données sont recueillies une cellule à la fois. Bulk-chargement, au contraire, permet à un grand nombre d&#39;astrocytes à être chargé avec du Ca 2 + et imager simultanément indicateur. Cependant, seulement astrocytes près de la surface (&lt;20 mm) de la tranche sont chargés, avec préoccupation associées sur la santé des cellules et synapses intactes. La contre-pression protocole bolus chargement présenté ici offre un terrain d&#39;entente, relativement à haut débit et la capacité de surveiller l&#39;activité Ca 2 + plus profondément dans la tranche (40-75 um). Une augmentation significative du pourcentage des astrocytes spontanément actifs en utilisant la technique bolus de chargement est observée par rapport à chargement en vrac, ce qui suggère que les liens entre les synapses neuronales et les processus astrocytaires sont plus complets 15. Avec une bonne charge, on peut souvent suivre Ca 2 + activité dans les principaux processus d&#39;astrocytes (données non présentées) ou peut-être même petits compartiments en utilisant la microscopie à 2 photons. Cependant, il devra être exercé dans l&#39;attribution des petits processus à un astrocyte particulier, que les limites se fondent dans le fond non spécifique coloration. Une inquiétude supplémentaire à l&#39;utilisation de procédures en vrac chargement ou bolus de chargement est la nécessité d&#39;un mar secondaireker pour l&#39;identification des astrocytes. Bien qu&#39;il ait connu depuis de nombreuses années que les astrocytes prennent préférentiellement jusqu&#39;à ester AM Ca 2 + indicateurs, le marqueur secondaire SR-101 est souvent utilisé pour vérifier les cellules chargées que les astrocytes. SR-101 peut, en soi, de modifier l&#39;excitabilité des neurones intrinsèques 29. L&#39;utilisation de SR-101 corrobore la nécessité d&#39;effectuer toutes les astrocytes Ca 2 + dans les mesures TTX pour limiter d&#39;éventuels effets SR-101 sur l&#39;excitabilité neuronale. En supposant que le groupe contrôle et expérimentaux comprennent SR-101, le marqueur en elle-même ne doit pas tenir compte des effets observés chez les astrocytes Ca 2 + signalisation suivants manipulation à long terme des potentiels d&#39;action neuronaux. SR-101 peut être plus préoccupant en haute K + expériences, cependant, car il peut réduire la différence entre 2,5 mM K + vs 5,0 mM de K +, si le taux d&#39;allumage de base n&#39;est pas modifiée proportionnellement. Une approche très prometteuse pour fournir Ca 2 + </sup&gt; Indicateur aux astrocytes est apparue récemment qui offre une alternative intéressante aux approches plus traditionnelles utilisant Ca 2 + colorants. Des progrès significatifs ont été accomplis au cours des dernières années avec des indicateurs de calcium génétiquement codés (GECIS) destinés aux astrocytes 30-32. GECIS est acheminé en astrocytes par micro-injection de vecteurs viraux adéno-associés in vivo dans une région du cerveau d&#39;intérêt telles que l&#39;hippocampe. Expression de GECIS est atteinte après environ deux semaines après l&#39;infection virale 32. Il existe de nombreux avantages présentés par l&#39;utilisation de GECIS dans les astrocytes. Tout d&#39;abord, les vecteurs sont ciblées sur les astrocytes en utilisant un promoteur spécifique des astrocytes, de sorte que les cellules marquées sont astrocytes 32. Deuxièmement, le rapport signal sur bruit, semble maintenant comparable à ce qui peut être obtenu en utilisant la livraison de patch-clamp de colorant, mais sans le caractère envahissant d&#39;avoir eu une pipette de patch sur la cellule 32. Troisièmement, les indicateurs peuvent être delivered et exprimée dans les tissus adultes, ce qui est problématique en utilisant des méthodes de livraison en vrac de chargement. En outre, l&#39;expression est en mosaïque, en offrant la possibilité de faire la différence entre de multiples astrocytes. Ainsi, plusieurs astrocytes peuvent potentiellement être visualisés simultanément, tout en enregistrant dans le soma et rameaux fins dans le même temps. Par conséquent, potentiellement une technique unique pourrait être utilisé à la place de trois techniques distinctes (chargement en vrac, bolus de chargement, et de patch-clamp chargement) pour enregistrer l&#39;activité des RCPG échelle Gq astrocytaires, augmentant considérablement l&#39;efficacité. Un inconvénient potentiel de l&#39;utilisation de la livraison à médiation virale de Ca 2 + indicateurs aux astrocytes est l&#39;effet possible sur la santé de la tranche 32. Les vecteurs viraux adéno-associés utilisés pour livrer les GECIS ont été précédemment montré pour causer gliose réactive des astrocytes 33. Préparation des tranches de cerveau en général initie probablement parmi les premiers stades de la pathologie dont la libération de inflammatory 10 molécules. Par conséquent, combiné avec les temps d&#39;incubation longs nécessaires pour induire l&#39;échelle des récepteurs astrocytaires, l&#39;utilisation de GECIS livré utilisant des vecteurs viraux aurait besoin de recevoir une contrepartie supplémentaire dans le contexte de la santé de la tranche dans ces types d&#39;expériences. Lors de l&#39;utilisation de ce protocole, il est important de garder à l&#39;esprit que le temps d&#39;application pour agoniste à produire une réponse variera en fonction de la disponibilité des récepteurs. Pour une concentration donnée de l&#39;agoniste, le temps d&#39;application devra être plus longue si les récepteurs sont mis à l&#39;échelle vers le bas, et la plus courte si les récepteurs sont mis à l&#39;échelle vers le haut, pour le médicament d&#39;atteindre une concentration suffisante dans les tissus pour activer les récepteurs suffisamment pour produire un rapport Ca 2 + réponse. Par conséquent, les temps d&#39;application du médicament, et éventuellement de leurs concentrations, peuvent devoir être ajustés en fonction de la direction prévue de la mise à l&#39;échelle. Par exemple, la concentration de l&#39;agoniste peut avoir besoin d&#39;être abaissé dans le case de TTX pour éviter de saturer les réponses, et a augmenté après l&#39;incubation des tranches en haute K + voir même une réponse. Plus précisément, la concentration DHPG a été déplacé de 5-15 uM après le traitement TTX 30-50 uM après traitement 5,0 mM K + afin d&#39;étudier les modèles de Ca 2 + de réponse, comme 5-15 uM était souvent trop faible pour produire des réponses fiables à astrocytes après révision à la baisse du groupe I mGluR. Enregistrement des astrocytes Ca 2 + activité fournit pas de preuve directe de l&#39;insertion ou de l&#39;internalisation du récepteur ou à partir de la membrane plasmique. Cependant, sur la base de la similitude remarquable des données avec des données provenant d&#39;études antérieures in vitro qui ont examiné la relation directe entre le niveau d&#39;expression Gq GPCR et spontanée et évoquaient Ca 2 + transitoires 21-24, l&#39;interprétation la plus logique des changements en Ca 2 + la signalisation est que les niveaux d&#39;expression des récepteurs de surface d&#39;astrocytes ontchangé. Une approche complémentaire peut être un facteur important si l&#39;on veut fournir des preuves supplémentaires sur le lieu de l&#39;effet sur ​​l&#39;activité Ca 2 +. Une stratégie que nous avons utilisé était d&#39;examiner l&#39;effet de TTX incubation sur des tranches d&#39;hippocampe de souris MrgA1R astrocytaires. Ces souris transgéniques expriment un Gq GPCR étrangère (MrgA1R) que dans les astrocytes. Parce que ce récepteur n&#39;est pas indigène au cerveau, il n&#39;y a pas neurotransmetteur endogène présent de modifier ses niveaux d&#39;activité. Des travaux antérieurs suggéré que ce récepteur engage le même que les molécules endogènes groupe I mGluR de signalisation dans les mêmes astrocytes 34 intracellulaire. Incubation après à long terme de tranches provenant de souris MrgA1R à la TTX, aucune différence dans les réponses MrgA1R agonistes évoqués par rapport au contrôle de la même portée incube les tranches ne fournissent la preuve que Ca 2 + activité de l&#39;effet sur ​​les astrocytes est due à des changements localisés au récepteur de la surface, en particulier si les réponses du groupe I mGluR sont encore Significantly renforcée dans les mêmes astrocytes. Une autre solution, bien que peut-être plus impliqué stratégie consisterait à isoler les astrocytes dans les tranches pour l&#39;analyse Western blot, aussi longtemps que la fraction membranaire pouvait être analysée pour les changements dans les niveaux d&#39;expression des récepteurs de surface. Cellulaire activé par fluorescence (FACS) ou la cytométrie en flux peut être utile ici. Les applications possibles de cette technique pour l&#39;étude des neurones, les astrocytes et les interactions neurones-astrocytes sont nombreux. Dans nos expériences, seul groupe DHPG évoqués Je mGluR Ca 2 + réponses astrocytaires ont été étudiés, dans les régions isolées des tranches d&#39;hippocampe de souris aigus mineurs. Cette préparation a non seulement les afférences intactes (des collatérales de Schaffer), mais aussi les neurones qui sont à leur origine (cellules pyramidaux CA3), ce qui permet de manipuler les taux de ces neurones glutamatergiques de tir sur les cellules post-synaptiques (cellules pyramidales CA1) et les astrocytes dans la strate radiatum dont les processus assoe avec ces synapses. La tranche de l&#39;hippocampe aiguë peut-être pas la meilleure préparation pour manipuler les taux d&#39;autres types de neurones de tir, cependant, que de nombreux afférents sont séparées des neurones qui leur donnent naissance. Néanmoins, il peut être possible dans certaines préparations de tranche d&#39;observer la plasticité des autres sous-types Gq GPCR astrocytaires. Par exemple, les tranches peuvent être préparées avec les neurones cholinergiques basales du cerveau antérieur et de leurs projections de l&#39;hippocampe intact. L&#39;incubation de ces tranches dans TTX ou K + élevée aurait une incidence sur les taux de mise à feu des neurones cholinergiques basaux, ce qui conduit à la mise à l&#39;échelle de mAchRs dans les astrocytes du stratum oriens, qui reçoivent une partie importante de l&#39;apport cholinergique 1. Une alternative encore d&#39;approche non testé à étudier l&#39;échelle des récepteurs astrocytes dans une zone spécifique du cerveau, avec toutes les connexions intacts tandis que l&#39;échelle se produit, pourrait être d&#39;utiliser un modèle in vivo où une libération prolongée de TTX est réalisé par l&#39;implantation d&#39;un plastic polymère Elvax 40W-dessus de la région d&#39;intérêt 35. Cette approche a été utilisée précédemment dans une étude de mise à l&#39;échelle des neurones, mais devrait également être applicable à l&#39;échelle des astrocytes. Enfin, la lecture correcte, les études futures pourraient examiner d&#39;autres familles de RCPG, y compris des changements dans l G ou G i RCPG. On pourrait prévoir des astrocytes GABA B G i GPCR d&#39;être affectés suite à l&#39;inhibition de tir à projeter localement interneurones GABA dans une préparation de tranche. Développement de nouveaux indicateurs visant d&#39;autres molécules de signalisation, comme un indicateur en temps réel de la deuxième camp de messager, serait d&#39;ouvrir un tout nouveau domaine de recherche sur la communication du récepteur des neurones-astrocytes à. Mise à l&#39;échelle bidirectionnel de mGluR astrocytaires en manipulant les taux basaux neurone de tir fournit une mesure de la sensibilité des astrocytes à libération médiée par AP de neurotransmetteur. Les astrocytes peuvent apparemment détecter les points d&#39;accès spontanés et glutamate de presse à Schaffer garantie-CA1 synapses des cellules pyramidales, même si K + extracellulaire est dans une gamme physiologique. Bien que l&#39;application de TTX aiguë ne réduit pas la fréquence spontanée des astrocytes activité de Ca 2 + 18, 36, 37, l&#39;activité de Ca 2 + chez les astrocytes dans la population devient décorrélés 36, fournissant la preuve que les récepteurs sont des détecteurs astrocytaires AP. Ceci suggère que les astrocytes détectent les points d&#39;accès neuronales spontanées avec aucun effet sur ​​leur activité globale de Ca 2 +. Il est largement admis que les concentrations intracellulaires d&#39;IP 3 doivent atteindre un niveau de seuil pour stimuler IP 3 Rs suffisamment pour entraîner une élévation de Ca 2 + détectable. AP neuronales spontanées pourraient activer GPCR astrocytaires sans produire mesurables Ca 2 + élévations? Les études futures pourraient utiliser Fluorescence Resonance Energy Transfer (FRET) ou un techn similaire<html> ique (comme BRET) pour examiner la relation entre G couplage de la protéine au récepteur (une mesure de l&#39;activation du récepteur) et Ca 2 + de presse dans les magasins internes. BRET a été largement utilisée in vitro pour détecter la protéine G à GPCR accouplement 38, même si elle peut être un certain temps avant que cette technologie sera disponible pour une utilisation dans des préparations de tissus intacts. Il est possible que les RCPG Gq astrocytaires sont activés beaucoup plus fréquemment que peuvent être enregistrées en utilisant les outils de Ca 2 + d&#39;imagerie actuellement disponibles. En plus de la détection des potentiels d&#39;action, GPCR Gq astrocytaires peuvent également être en mesure de détecter libération quantique miniature de neurotransmetteur tel que rapporté dans une étude récente 39. Procédé de mise à l&#39;échelle bidirectionnel décrit ici peut être utilisé dans des études ultérieures pour fournir une mesure de la mesure dans laquelle les GPCR astrocytaire Gq détecter la libération de neurotransmetteur vésiculaire quantique, en incluant la bafilomycine A1 dans le protocole d&#39;incubation. ntent &quot;&gt; Jusqu&#39;à présent, les protocoles d&#39;échelle ont été utilisé que dans des coupes d&#39;hippocampe de souris juvénile (p12-p18). Par conséquent, il est actuellement inconnu si l&#39;échelle de récepteur astrocytes pourrait aussi être induite dans les tissus obtenus à partir de souris adultes. Une étude convaincante récente suggère que le groupe expression je mGluR dans les astrocytes diminue considérablement après la première semaine de l&#39;âge et continue à diminuer jusqu&#39;à l&#39;âge adulte, avec de très faibles niveaux d&#39;expression des récepteurs dans les astrocytes adultes 40. Il serait donc intéressant de déterminer si mGluRs astrocytaires s&#39;adaptent à la suite de long l&#39;inhibition de la durée de la décharge neuronale dans adultes tranches d&#39;hippocampe de souris à des niveaux proches de ceux observés dans les astrocytes de souris juvéniles. Cette constatation suggère que l&#39;expression du récepteur astrocytes n&#39;est pas statique à un âge donné, mais peut changer rapidement en fonction des niveaux de l&#39;activité neuronale. Contrairement à réduction de l&#39;expression de groupe I mGluR chez la souris adulte, la preuve est en train d&#39;émerger que les récepteurs adrénergiques, y compris &amp; #945; 1A, 2A α, β et d&#39;une sous-types, sont principalement exprimés par les astrocytes dans le cerveau adulte 3, 4. L&#39;α 1A adrénergiques Gq GPCR peut être une cible intéressante pour de futures études de communication neurone à astrocyte, y compris si ces récepteurs sont sensibles aux variations de taux adrénergiques neurone de tir.

Les astrocytes répondent en quelques secondes à la stimulation des neurones ou axones neuronaux avec des augmentations de Ca 2 + cytoplasmique résultant presque exclusivement de l&#39;activation des RCPG Gq astrocytaires. Par exemple, les récepteurs muscariniques de l&#39;acétylcholine 1, les récepteurs cannabinoïdes 2, α 1A adrénergiques 3, 4, et le groupe I mGluR (voir ci-dessous) sont tous les sous-types astrocytaires Gq GPCR qui répondent aiguë de l&#39;activité neuronale. L&#39;activation du groupe I mGluR astrocytaire a été démontré plus largement, à la suite de la stimulation des afférences de neurones glutamatergiques in situ (tel que des coupes d&#39;hippocampe de courte durée) 5-7, ainsi que dans le cortex de souris adulte in vivo suite à une stimulation sensorielle 8. Le résultat de l&#39;activation des astrocytes Gq GPCR de signalisation sur la biologie et la physiologie des astrocytes, neurones, ou des interactions neurone-astrocyte a été un sujet de débat 9-12. Il sera some temps avant que la fonction de signalisation du récepteur neurone à astrocyte est pleinement apprécié. S&#39;il est clair que les neurones peuvent activer les récepteurs de astrocytaires en utilisant des protocoles expérimentaux, il ya des aspects de communication neurone à astrocyte récepteur qui restent mal compris. Tout d&#39;abord, le montant réel de l&#39;activité neuronale nécessaire pour activer les astrocytes Gq RCPG n&#39;est pas bien définie, et d&#39;autre part, la capacité des récepteurs astrocytaires exposer utilisation la plasticité a reçu peu d&#39;attention. Pour commencer à répondre à ces questions, nous avons récemment mis au point un protocole pour induire échelle bidirectionnel de groupe I mGluR astrocytes dans des coupes d&#39;hippocampe mineurs aiguë en réponse à des changements à long terme dans le potentiel d&#39;action des neurones (AP)-dépendantes activité synaptique. Similaire à ce qui a été découvert pour la plasticité homéostatique bidirectionnel de neurones récepteurs ionotropiques du glutamate 13, 14, groupe astrocytaire je mGluRs Scale Up following blocus des potentiels d&#39;action neuronaux et réduire lorsque l&#39;action neuronale fréquence potentiel est augmenté de 15. Ces changements compensatoires dans les récepteurs astrocytaires peuvent être mesurées en enregistrant spontanée et évoqués astrocytes Ca 2 + transitoires et en comparant les propriétés de ces événements à ceux des astrocytes dans les conditions témoins. Dans ce manuscrit, nous décrivons la méthodologie complète pour l&#39;utilisation de ce protocole, y compris la préparation de coupes d&#39;hippocampe, conditions d&#39;incubation de courte durée pour induire l&#39;échelle du récepteur de l&#39;astrocyte, astrocytes Ca 2 + colorant indicateur de chargement, Ca 2 + des techniques d&#39;imagerie par microscopie confocale, et les effets attendus sur l&#39;activité des astrocytes Gq GPCR. Effets prévisibles sur les astrocytes Ca 2 + propriétés de signalisation - qui correspondent à ceux enregistrés précédemment dans les cellules cultivées transfectées avec différents niveaux de GPCR Gq d&#39;expression - fournir une &quot;feuille de route&quot; qui peut être utilisé dans de futures études pour analyser les changements dans le plusexpression de GPCR trocytic. Les ramifications et les applications potentielles pour l&#39;utilisation de cette technique contribueront à notre compréhension des interactions entre les astrocytes neuronale dans le cerveau sain et malade.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="587">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="32">
			<td height="32" style="height:32px;width:163px;">Chamber Supplies</td>
			<td style="width:135px;"></td>
			<td style="width:131px;"></td>
			<td style="width:159px;"></td>
		</tr>
		<tr height="66">
			<td height="66" style="height:66px;width:163px;">Brinkmann pipette storage container</td>
			<td style="width:135px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:131px;">03-491</td>
			<td style="width:159px;">Use the drawer portion as the incubation chamber</td>
		</tr>
		<tr height="28">
			<td height="28" style="height:28px;width:163px;">Electrical drill</td>
			<td style="width:135px;"></td>
			<td style="width:131px;"></td>
			<td style="width:159px;"></td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;width:163px;">Flexible tubing</td>
			<td style="width:135px;">Tygon</td>
			<td style="width:131px;">R-3603</td>
			<td style="width:159px;"></td>
		</tr>
		<tr height="45">
			<td height="45" style="height:45px;width:163px;">Silicone seam sealant&#160;</td>
			<td style="width:135px;"></td>
			<td style="width:131px;"></td>
			<td style="width:159px;">Also called aquarium seam sealer</td>
		</tr>
		<tr height="45">
			<td height="45" style="height:45px;width:163px;">Gas tank</td>
			<td style="width:135px;"></td>
			<td style="width:131px;"></td>
			<td style="width:159px;">95% oxygen, 5% carbon dioxide</td>
		</tr>
		<tr height="46">
			<td height="46" style="height:46px;width:163px;">Natural beveled pipette tip</td>
			<td style="width:135px;">USA Scientific</td>
			<td style="width:131px;">1111-1000</td>
			<td style="width:159px;">Cut-to-fit to connect oxygenate lines</td>
		</tr>
		<tr height="46">
			<td height="46" style="height:46px;width:163px;">One-to-six lines manifold</td>
			<td style="width:135px;">Warner Instruments</td>
			<td style="width:131px;">64-0210 &#160;(MP-6)</td>
			<td style="width:159px;">For the microloader-manifold apparatus</td>
		</tr>
		<tr height="59">
			<td height="65" rowspan="2" style="height:65px;width:163px;">Eppendorf microloader</td>
			<td rowspan="2" style="width:135px;">Eppendorf</td>
			<td rowspan="2" style="width:131px;">5242 956.003</td>
			<td rowspan="2" style="width:159px;">For the microloader-manifold apparatus, cut-to-fit</td>
		</tr>
		<tr height="6">
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;width:163px;">Floating Bubble Rack</td>
			<td style="width:135px;">Bel Art Scienceware</td>
			<td style="width:131px;">F18875-0400</td>
			<td style="width:159px;">For slice holder</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:163px;">600 micron Sefar Nitex nylon mesh</td>
			<td style="width:135px;">ELKO filtering Co.</td>
			<td style="width:131px;">&#160;06-600/51</td>
			<td style="width:159px;">For slice holder</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:163px;">Krazy Glue</td>
			<td style="width:135px;"></td>
			<td style="width:131px;"></td>
			<td style="width:159px;">For slice holder</td>
		</tr>
		<tr height="32">
			<td height="32" style="height:32px;width:163px;">Reagent</td>
			<td style="width:135px;"></td>
			<td style="width:131px;"></td>
			<td style="width:159px;"></td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;width:163px;">Isoflurane</td>
			<td style="width:135px;">Baxter</td>
			<td style="width:131px;">1001936060</td>
			<td style="width:159px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:163px;">NaCl</td>
			<td style="width:135px;">Fisher</td>
			<td style="width:131px;">S271-3</td>
			<td style="width:159px;"></td>
		</tr>
		<tr height="23">
			<td height="23" style="height:23px;width:163px;">KCl</td>
			<td style="width:135px;">Fisher</td>
			<td style="width:131px;">P333-500</td>
			<td style="width:159px;"></td>
		</tr>
		<tr height="26">
			<td height="26" style="height:26px;width:163px;">CaCl2</td>
			<td style="width:135px;">Fisher</td>
			<td style="width:131px;">C79-500</td>
			<td style="width:159px;"></td>
		</tr>
		<tr height="26">
			<td height="26" style="height:26px;width:163px;">MgCl2</td>
			<td style="width:135px;">Fisher</td>
			<td style="width:131px;">M33-500</td>
			<td style="width:159px;"></td>
		</tr>
		<tr height="23">
			<td height="23" style="height:23px;width:163px;">NaH2PO4</td>
			<td style="width:135px;">Fisher</td>
			<td style="width:131px;">S369-500</td>
			<td style="width:159px;"></td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;width:163px;">NaHCO3</td>
			<td style="width:135px;">Fisher</td>
			<td style="width:131px;">S233-500</td>
			<td style="width:159px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:163px;">Glucose</td>
			<td style="width:135px;">Fisher</td>
			<td style="width:131px;">Fisher</td>
			<td style="width:159px;"></td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:163px;">(&#177;)-6-Hydroxy-2,5,7,8- tetramethylchromane-2-carboxylic acid (Trolox)</td>
			<td style="width:135px;">Acros Organics</td>
			<td style="width:131px;">53188-07-1</td>
			<td style="width:159px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:163px;">Ascorbic acid</td>
			<td style="width:135px;">Acros Organics</td>
			<td style="width:131px;">401471000</td>
			<td style="width:159px;"></td>
		</tr>
		<tr height="39">
			<td height="39" style="height:39px;width:163px;">Tetrodotoxin citrate (TTX)</td>
			<td style="width:135px;">Ascent Scientific</td>
			<td style="width:131px;">Asc-055</td>
			<td style="width:159px;"></td>
		</tr>
		<tr height="39">
			<td height="39" style="height:39px;width:163px;">Sulforhodamine 101 (SR-101)</td>
			<td style="width:135px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:131px;">284912</td>
			<td style="width:159px;"></td>
		</tr>
		<tr height="39">
			<td height="39" style="height:39px;width:163px;">Dimethyl Sulfoxide (DMSO)&#160;</td>
			<td style="width:135px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:131px;">D128-500</td>
			<td style="width:159px;"></td>
		</tr>
		<tr height="39">
			<td height="39" style="height:39px;width:163px;">Pluronic Acid F-127</td>
			<td style="width:135px;">Invitrogen, Molecular Probes</td>
			<td style="width:131px;">P6867</td>
			<td style="width:159px;"></td>
		</tr>
		<tr height="85">
			<td height="85" style="height:85px;width:163px;">Oregon Green 488 BAPTA-1 AM *cell permeant (special packaging)</td>
			<td style="width:135px;">Invitrogen, Molecular Probes</td>
			<td style="width:131px;">O6807</td>
			<td style="width:159px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:163px;">(RS)-3,5-DHPG</td>
			<td style="width:135px;">Ascent</td>
			<td style="width:131px;">Asc-020</td>
			<td style="width:159px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:163px;">Histamine</td>
			<td style="width:135px;">Sigma-Aldrich&#160;</td>
			<td style="width:131px;">H7125</td>
			<td style="width:159px;"></td>
		</tr>
		<tr height="46">
			<td height="46" style="height:46px;width:163px;">Carbamoylcholine chloride (Carbachol)</td>
			<td style="width:135px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:131px;">C4382</td>
			<td style="width:159px;"></td>
		</tr>
		<tr height="44">
			<td height="44" style="height:44px;width:163px;">Adenosine 5&#8217;-ATP disodium (Na-ATP)</td>
			<td style="width:135px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:131px;">A7699</td>
			<td style="width:159px;"></td>
		</tr>
		<tr height="32">
			<td height="32" style="height:32px;width:163px;">Dissection Tools</td>
			<td style="width:135px;"></td>
			<td style="width:131px;"></td>
			<td style="width:159px;"></td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;width:163px;">Single-edge razor blade&#160;</td>
			<td style="width:135px;">GEM</td>
			<td style="width:131px;">62-0161</td>
			<td style="width:159px;">For bisection&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="39">
			<td height="39" style="height:39px;width:163px;">Double edge razor blade</td>
			<td style="width:135px;">TED PELLA, INC.</td>
			<td style="width:131px;">121-6</td>
			<td style="width:159px;">For cutting slices</td>
		</tr>
		<tr height="39">
			<td height="39" style="height:39px;width:163px;">Mayo Scissors, supercut</td>
			<td style="width:135px;">WPI</td>
			<td style="width:131px;">14010-15</td>
			<td style="width:159px;">For decapitation</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:163px;">Fine iris scissors, straight</td>
			<td style="width:135px;">Fine Science Tools</td>
			<td style="width:131px;">14094-11</td>
			<td style="width:159px;">For cutting the skull</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:163px;">Iris forceps, curved</td>
			<td style="width:135px;">WPI</td>
			<td style="width:131px;">15915</td>
			<td style="width:159px;">To remove the skin and skull</td>
		</tr>
		<tr height="44">
			<td height="44" style="height:44px;width:163px;">Small spatula</td>
			<td style="width:135px;"></td>
			<td style="width:131px;"></td>
			<td style="width:159px;">To remove/transfer the brain</td>
		</tr>
		<tr height="45">
			<td height="45" style="height:45px;width:163px;">Dumostar Dumont #5 Biologie Tip forceps</td>
			<td style="width:135px;">Fine Science Tools</td>
			<td style="width:131px;">11295-10</td>
			<td style="width:159px;">For hippocampus dissection</td>
		</tr>
		<tr height="39">
			<td height="39" style="height:39px;width:163px;">Glass Pasteur pipette</td>
			<td style="width:135px;">Fisher</td>
			<td style="width:131px;">13-678-20B</td>
			<td style="width:159px;">For transferring brain slices</td>
		</tr>
		<tr height="39">
			<td height="39" style="height:39px;width:163px;">Pasteur pipette rubber bulb</td>
			<td style="width:135px;">Fisher</td>
			<td style="width:131px;">03-448-22</td>
			<td style="width:159px;">For transferring brain slices</td>
		</tr>
		<tr height="39">
			<td height="39" style="height:39px;width:163px;">Polystyrene 100-mm tissue culture dishes</td>
			<td style="width:135px;">Corning</td>
			<td style="width:131px;">25020</td>
			<td style="width:159px;"></td>
		</tr>
		<tr height="32">
			<td height="32" style="height:32px;width:163px;">Equipment</td>
			<td style="width:135px;"></td>
			<td style="width:131px;"></td>
			<td style="width:159px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:163px;">Vibratome</td>
			<td style="width:135px;">Leica</td>
			<td style="width:131px;">VT 1200S</td>
			<td style="width:159px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="23" rowspan="2" style="height:23px;width:163px;">Water bath</td>
			<td rowspan="2" style="width:135px;">Fisher</td>
			<td rowspan="2" style="width:131px;">ISOTEMP 210</td>
			<td rowspan="2" style="width:159px;">For warm incubation</td>
		</tr>
		<tr height="3">
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:163px;">Micropipette puller</td>
			<td style="width:135px;">Narishige</td>
			<td style="width:131px;">PC-10</td>
			<td style="width:159px;">For bolus-loading pipette</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:163px;">Confocal microscope</td>
			<td style="width:135px;">Olympus</td>
			<td style="width:131px;">Olympus Fluoview 1000</td>
			<td style="width:159px;"></td>
		</tr>
		<tr height="85">
			<td height="85" style="height:85px;width:163px;">Low Profile Open Diamond Bath Imaging Chamber with PM-1 platform</td>
			<td style="width:135px;">Warner Instruments</td>
			<td style="width:131px;">RC-26GLP</td>
			<td style="width:159px;">diamond bath with low profile</td>
		</tr>
		<tr height="45">
			<td height="45" style="height:45px;width:163px;">Borosilicate glass pipette</td>
			<td style="width:135px;">World Precision Instruments</td>
			<td style="width:131px;">TW150F-4</td>
			<td style="width:159px;">For bolus-loading pipette</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="25" rowspan="2" style="height:25px;width:163px;">Micromanipulator&#160;</td>
			<td rowspan="2" style="width:135px;">Sutter instrument</td>
			<td rowspan="2" style="width:131px;">ROE-200</td>
			<td rowspan="2" style="width:159px;">For bolus-loading pipette</td>
		</tr>
		<tr height="3">
		</tr>
		<tr height="64">
			<td height="64" style="height:64px;width:163px;">Spin-X centrifuge tube filter with 0.22 &#181;m cellulose acetate&#160;</td>
			<td style="width:135px;">Costar</td>
			<td style="width:131px;">8161</td>
			<td style="width:159px;"></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

inducing plasticity of astrocytic receptors by manipulation of neuronal firing rates

Près de deux décennies de recherche a établi que les astrocytes in situ et in vivo expriment de nombreuses G récepteurs couplés aux protéines (RCPG) qui peuvent être stimulées par l&#39;émetteur neuronale-publié. Cependant, la capacité des récepteurs astrocytaires à exposer la plasticité en réponse aux variations de l&#39;activité neuronale a reçu peu d&#39;attention. Ici, nous décrivons un système de modèle qui peut être utilisé à l&#39;échelle au niveau mondial haut ou le bas groupe astrocytaire je récepteurs de glutamate métabotropique (mGluR) dans des tranches de cerveau de courte durée. Inclus sont des méthodes sur la façon de préparer des coupes d&#39;hippocampe parasagittales, construire des chambres adaptées à long terme tranche incubation, manipuler bidirectionnelle d&#39;action neuronale fréquence potentiel, les astrocytes de charge et les processus d&#39;astrocytes avec fluorescent Ca 2 + indicateur, et mesurer les changements dans les astrocytes activité Gq GPCR par l&#39;enregistrement astrocytes spontanée et évoquée Ca 2 + événements en utilisant la microscopie confocale. En essence, un &quot;r calciumoadmap &quot;est prévue à la façon de mesurer la plasticité des RCPG Gq astrocytaires. Les applications de la technique pour l&#39;étude des astrocytes sont discutés. Avoir une compréhension de la façon dont la signalisation du récepteur astrocytaire est affecté par des changements dans l&#39;activité neuronale a des implications importantes tant pour la fonction synaptique normale ainsi que les processus sous-jacents des troubles neurologiques et des maladies neurodégénératives.

Les résultats représentatifs de la figure 3 montrent l&#39;effet de l&#39;incubation de courte durée des coupes d&#39;hippocampe de souris en TTX pour 4-6 heures sur astrocyte sr Ca 2 + de l&#39;activité. Les données comprennent les deux Ca 2 + transitoires spontanés et groupe DHPG évoqués Je mGluR Ca 2 + réponses, de tranches incubées en contrôle ACSF vs ACSF, plus TTX. Autres que les caractéristiques morphologiques caractéristiques de base, ensemble de processus stellaire et la petite taille de soma (~ 10 um), les astrocytes sont identifiés dans le sr par superposition de la Ca 2 + indicateur OGB-une heures avec le marqueur des astrocytes sélective SR-101 19, 20 ( Figure 3A). Les cases numérotées sur les corps cellulaires d&#39;astrocytes correspondent à la fluorescence numérotée sur traces de temps indiquées dans la figure 3B. Le groupe 1 mGluR agoniste (RS)-3.5-DHPG est appliquée pour déterminer les effets d&#39;échelle spécifiques sur le groupe 1 mGluR dans les astrocytes. Pour la distinction entre éducation physiqueiologie dans la spécificité de l&#39;effet de mise à l&#39;échelle à une mGluR de groupe par rapport à d&#39;autres GPCR Gq, un cocktail d&#39;agonistes est appliqué à la fin de chaque expérience. Ici, nous avons utilisé 10 uM chacun de GQ GPCR agonistes histamine, le chlorure de carbamylcholine (de carbachol) et adénosine 5&#39;-ATP disodique (Na-ATP). Le cocktail d&#39;agoniste sert aussi de témoin positif pour déterminer viables, des astrocytes réactifs dans les cas où les cellules ne répondent pas à DHPG, vraisemblablement parce que ces astrocytes notamment n&#39;expriment pas des quantités suffisantes du récepteur à induire une réponse de DHPG. Nous avons utilisé différentes concentrations de DHPG, dont 5 pM et 15 pM (figure 3B), ainsi que 30 pM et 50 pM (figure 4A) pour aider à révéler des changements dans le groupe astrocytaire je mGluR. La relation entre Ca 2 + réponses cellulaires et les niveaux d&#39;expression Gq GPCR a été préalablement examiné in vitro 21-24. Tout d&#39;abord, l&#39;seuil pour répondre à une concentration de l&#39;agoniste en particulier dépend de la densité des récepteurs exprimés par chaque cellule. Dans une population de cellules, les cellules répondent plus à une élévation de Ca 2 + à une concentration donnée d&#39;agoniste lorsque les cellules sont transfectées avec des densités plus élevées de récepteurs. Après incubation de tranches dans la TTX, le pourcentage de la population dans les astrocytes en réponse à une concentration fixe d&#39;agonistes augmente (figures 3B et 3C). Nous avons constaté que 5 pM et 15 pM DHPG révèlent des différences évidentes dans le pourcentage des astrocytes réactifs entre le contrôle et les cellules TTX traités, alors que 30 et 50 uM DHPG sont tenus de comparer les réponses groupe I mGluR dans 5,0 mM K + traités par rapport au témoin les cellules (figure 4A). La relation entre les modèles de Ca 2 + de réponse astrocytaires et la concentration de l&#39;agoniste a également été étudiée in situ. L&#39;augmentation de l&#39;agonisteconcentration décale le motif de la réponse + Ca2 dans les astrocytes de pointe unique Ca 2 + élévations pour du multi et plateau de Ca 2 + élévations 25-27. Sur la base de ces constatations antérieures, nous avons prédit que le modèle de réponse à une seule concentration de l&#39;agoniste se déplacer en cas de changements dans le niveau d&#39;expression du récepteur. Ainsi, en fonction de celui des deux modes de mise à l&#39;échelle est utilisée (inhibant la décharge neuronale ou aggraver), la concentration d&#39;agoniste nécessaire pour produire un profil de réponse particulière va augmenter ou diminuer. Par exemple, les astrocytes incubés dans TTX déplacer leur + modèle de réponse DHPG évoqués Ca 2 à plus plateau de type Ca 2 + élévations et de répondre à la baisse des concentrations d&#39;agoniste par rapport à contrôler les astrocytes (figure 3C). En tenant compte des études antérieures, ces observations suggèrent que la je mGluR niveaux d&#39;expression des récepteurs dans les astrocytes groupe a augmenté. Le temps de montée et le début (temps de latence) des élévations de Ca 2 + ont également été montré une corrélation directe à des changements dans les niveaux d&#39;expression Gq GPCR dans les cellules cultivées 22-24. Les niveaux d&#39;expression des récepteurs plus élevées donnent des latences de réponse plus courts et plus rapides temps de montée alors que la réduction de la densité des récepteurs produit l&#39;effet inverse. Pour les astrocytes incubés dans TTX, Ca 2 + transitoires évoquées par application de DHPG ont significativement plus rapide temps de montée par rapport aux astrocytes incubées en contrôle ACSF (figure 3D). Comme mentionné précédemment, les amplitudes des réponses Ca 2 + agonistes évoqués restent inchangées quelle que soit la concentration de l&#39;agoniste ou le modèle de mise à l&#39;échelle 15 (figure 3D). Outre les changements observés par le groupe activant directement je mGluRs avec DHPG, astrocytes spontanée Ca 2 + activité est également affectée de façon significative par cette manipulation. Nous observonsda augmentation de 2,26 fois dans le pourcentage d&#39;astrocytes spontanément actives incubées dans TTX par rapport au témoin. Cela représente une augmentation de 12,9% des astrocytes de contrôle présentant une activité spontanée dans le soma de 42,1% dans la TTX incubé astrocytes (figure 3E). Parce qu&#39;il est connu que l&#39;activité des GPCR exposition «intrinsèque» ou constitutive, en l&#39;absence d&#39;agoniste 21, 26, 28, et que le niveau de cette activité intrinsèque augmente avec l&#39;augmentation des niveaux d&#39;expression des récepteurs, ces données suggèrent que la densité de astrocytaires augmente Gq RCPG après réduction à long terme dans l&#39;action neuronale tir potentiel. Semblable à des réponses agonistes évoqués, les temps de montée des Ca 2 + élévations spontanées sont également augmenté (figure 3F). Des données représentatives à l&#39;aide du deuxième protocole, l&#39;incubation en potassium extracellulaire élevée (5,0 mM), est représenté dans Figure 4. Une augmentation de K + extracellulaire à partir des résultats 2,5-5,0 mM à une augmentation significative de l&#39;action des neurones CA3 fréquence basale potentiel 15. Des concentrations plus élevées de DHPG (30 pM et 50 pM) sont nécessaires afin d&#39;évoquer le groupe I mGluR Ca 2 + réponses des astrocytes incubées en haute potassium (figures 4A et 4B). Ceci est cohérent avec un niveau réduit de groupe I mGluR réactivité dans les astrocytes après une hausse à long terme de potentiels d&#39;action neuronaux. En outre, le profil de réponse évoquée à une concentration fixe de DHPG déplace à partir des réponses des plateaux en forme de réponses plus faibles mono-pointe (Figure 4B). Examinant le pourcentage des astrocytes spontanément actifs dans les deux conditions de potassium révèle que moins élevé dans les astrocytes incubées K + sont spontanément actifs par rapport à la condition contrôle (Figure 4C). Cet effet se trouve dans la oppositdirection de l&#39;e de TTX état ​​dans lequel le pourcentage d&#39;astrocytes présentant des élévations de Ca 2 + spontanées est augmentée. Enfin, à la fois évoquée et Ca 2 + élévations spontanées ont plus progressive dans les astrocytes incubées en haute K + par rapport à la condition de contrôle (figures 4C et 4D). Dans l&#39;ensemble, ces données suggèrent que les niveaux d&#39;expression astrocytaires Gq GPCR échelle bidirectionnelle en fonction du niveau d&#39;action neuronale activité potentielle sur une période de temps prolongée. <img alt="Figure 1" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51458/51458fig1highres.jpg" width="500" /> Figure 1. Fabrication de la chambre d&#39;incubation et de mettre en place une tranche. (A) Le passage de tiroir d&#39;un conteneur de stockage de pipette Brinkmann avec son couvercle étanche à l&#39;air est utilisé pour construire la tranche chambre d&#39;incubation. (B) Drill un trou dans le côté du récipient d&#39;environ 1 ¼ à partir du haut et dans ¼ du côté. Monter dans un morceau de tuyau flexible. (C) Branchez l&#39;appareil de microloader-collecteur à l&#39;extrémité intérieure du tube flexible. Remarque couper au montage pointe de la pipette 200 ul naturel (flèche blanche). (D) Six 20 pi microloaders Eppendorf sont coupées au montage à un collecteur d&#39;une ligne à six pour créer un appareil de microloader-collecteur. (E) Percez deux petits trous sur le couvercle. (F) Un rack de bulle flottant pour faire le support de tranche. (G) Les &quot;jambes&quot; du fond de l&#39;armoire de bulles flottantes sont retirées de telle sorte qu&#39;un morceau de matériau à mailles en nylon peut être collé au fond. (H) Remplir la chambre d&#39;incubation avec une quantité suffisante de l&#39;ACSF de sorte que les flotteurs de support de tranche. Réglez la longueur du tube de sorte que les pointes des microloaders peuvent se reposer dans un coin de plancher de la chambre. Lors du placement de la chambre d&#39;incubation enle bain d&#39;eau, le niveau d&#39;eau dans le bain doit être au même niveau que l&#39;ACSF dans la chambre. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51458/51458fig1highres.jpg" target="_blank">Cliquez ici pour agrandir l&#39;image.</a> <img alt="Figure 2" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51458/51458fig2highres.jpg" width="500" /> Figure 2. Estimation de la santé de la tranche. (A) Une tranche de l&#39;hippocampe saine à l&#39;aide d&#39;interférence différentiel (DIC) optique contraste. Tranches en bonne santé ont une apparence veloutée et un pourcentage élevé de neurones pyramidaux CA1 sains. Notez les dendrites apicales saillie dans la strate radiatum. Patch-clamp de neurones qui ressemblent à ceux présentés ici révèlent un potentiel de repos de membrane faible (-61 à -62 mV) en standard de 2,5 mM K + ACSF avec quelques potentiels d&#39;action spontanée. Les taux de potentiel de membrane et de cuisson varieront en fonction de l&#39;exextracellulaire de K + (Xie et al. 15). Les flèches indiquent les astrocytes putatifs. Abréviations: sr, la stratum radiatum; s.py., strate pyramidale. La barre d&#39;échelle, 10 um. (B) tranches malsaines auront un pourcentage élevé de morts neurones pyramidaux CA1, qui ont l&#39;apparence d&#39;œufs frits (flèches blanches indiquent les noyaux des neurones morts - le &quot;jaune&quot; de l&#39;oeuf sur le plat). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51458/51458fig2highres.jpg" target="_blank">Cliquez ici pour agrandir l&#39;image.</a> <img alt="Figure 3" fo:content-width="4.5in" src="/files/ftp_upload/51458/51458fig3highres.jpg" width="500" /> Figure 3. Enregistrement amplifié activité Gq GPCR et le groupe évoqué je mGluR Ca 2 + réponses après inhibition à long terme de points d&#39;accès neuronales par incubation dans TTX. (A) des images représentatives de cellules dans le domaine de l&#39;enregistrement incubées dans control conditions (panneaux supérieurs) ou dans TTX (panneaux inférieurs) qui ont pris Oregon Green BAPTA-une heures Ca 2 + colorant indicateur (panneaux de gauche) et SR-101 (panneaux intermédiaires). La barre d&#39;échelle est de 10 um. Superposition de deux signaux («fusionner») indique que les astrocytes charge avec Ca 2 + indicateur. Les boîtes sont établis sur personne soma des astrocytes à enregistrer l&#39;intensité de fluorescence au cours du temps dans le canal vert pour surveiller l&#39;activité Ca 2 + dans les astrocytes. (B) Exemples de traces provenant des caisses enregistreuses par A) de l&#39;activité de Ca 2 + dans les astrocytes. Astrocytes incubés dans TTX spectacle augmentation de l&#39;activité spontanée et le groupe évoqué plus robuste je mGluR Ca 2 + réponses comme en témoigne par des changements dans le modèle de réponse. Exemples de pointe unique (cercle), du multi (rectangle), et le plateau (rectangle pointillé) Ca 2 + transitoires sont présentés. (C) les changements dans les modes d&#39;intervention sont particulièrement évidents en utilisant concent différenterations du groupe I mGluR agoniste DHPG. Plus de réponses multi crête et de plateau sont évidents après incubation dans TTX par rapport au témoin à une concentration de l&#39;agoniste donné. (D) Hausse temps de Ca 2 + réponses DHPG-évoqués sont plus rapides dans les astrocytes incubés dans TTX par rapport au contrôle (panneau supérieur), tandis que les amplitudes ne changent pas (panneau inférieur), indicatif d&#39;amplitudes de réponse «tout ou rien», une fois le seuil de répondre a été atteinte. (E) Hausse temps de astrocyte spontanée Ca 2 + transitoires sont également plus rapides dans TTX incubé par rapport au témoin incubé astrocytes (panneau supérieur), tandis que le pourcentage des astrocytes dans la population présentant spontanées Gq GPCR Ca 2 + augmente l&#39;activité (panneau inférieur). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51458/51458fig3highres.jpg" target="_blank">Cliquez ici pour agrandir l&#39;image.</a> <img alt="Figure 4" fo:content-width = &quot;6 po&quot; src = &quot;/ files/ftp_upload/51458/51458fig4highres.jpg&quot; width = &quot;500&quot; /&gt; Figure 4. Enregistrement astrocytaire diminué activité Gq GPCR et groupes évoqués Je mGluR Ca 2 + réponses suivantes augmentation à long terme dans les points d&#39;accès neuronales par incubation en potassium extracellulaire élevée. (A) des traces représentatives des astrocytes Ca 2 + enregistrements de tranches incubées dans 5,0 mM K + ACSF à dépolariser les neurones et augmenter leur cadence de tir de base par rapport à contrôler ACSF (2,5 mM K + ACSF). Astrocytes incubées avec 5,0 mM K + ACSF exposition somatiques Ca 2 + transitoires de moins spontanées et plus faible DHPG évoqués réponses par rapport aux astrocytes incubées en contrôle ACSF. (B) Une comparaison des modèles de réponses évoquées à plusieurs concentrations de DHPG révèle types de réponse plus faibles après l&#39;augmentation à long terme dans les points d&#39;accès neuronales. (C) Une réduction du pourcentage des astrocytes dans la population présentant Ca 2 + activité spontanée est observée après incubation à long terme en K + élevé comparé à contrôler ACSF (panneau supérieur), tandis que les temps de montée de l&#39;activité spontanée deviennent plus lents (panneau inférieur). (D) Hausse temps de astrocyte évoqué Ca 2 + réponses à différentes concentrations de DHPG devenu plus lent suivant le traitement 5.0 mM K + par rapport aux astrocytes incubées en contrôle ACSF. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51458/51458fig4highres.jpg" target="_blank">Cliquez ici pour agrandir l&#39;image.</a>

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Inducing Plasticity of Astrocytic Receptors by Manipulation of Neuronal Firing Rates

Nous décrivons ici une adaptation des protocoles utilisés pour induire la plasticité homéostatique dans les neurones de l&#39;étude de la plasticité des G récepteurs couplés à la protéine astrocytaires. Récemment utilisé pour examiner les changements dans le groupe I mGluR astrocytes chez les souris jeunes, la méthode peut être appliquée pour mesurer l&#39;échelle des différents RCPG astrocytaires, dans les tissus de souris adultes in situ et in vivo, et d&#39;avoir une meilleure appréciation de la sensibilité des récepteurs astrocytaires aux variations de l&#39;activité neuronale.

Induire la plasticité de Astrocytic récepteurs neuronaux par manipulation des taux de combustion

Close to two decades of research has established that astrocytes in situ and in vivo express numerous G protein-coupled receptors (GPCRs) that can be ...

inducing-plasticity-astrocytic-receptors-manipulation-neuronal-firing

Research

JoVE Journal

Neuroscience

14.1K vues.  University of California Riverside.  Nous décrivons ici une adaptation des protocoles utilisés pour induire la plasticité homéostatique dans les neurones de l'étude de la plasticité des G récepteurs couplés à la protéine astrocytaires. Récemment utilisé pour examiner les changements dans le groupe I mGluR astrocytes chez les souris jeunes, la méthode peut être appliquée pour mesurer l'échelle des différents RCPG astrocytaires, dans les tissus de souris adultes in situ et 

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Preparation of Oligomeric &beta;-amyloid1-42 and Induction of Synaptic Plasticity Impairment on Hippocampal Slices

Impairment of synaptic connections is likely to underlie the subtle amnesic changes occurring at the early stages of Alzheimer s Disease (AD). &beta;-amyloid (A&beta;), a peptide produced in high amounts in AD, is known to reduce Long-Term Potentiation (LTP), a cellular correlate of learning and memory. Indeed, LTP impairment caused by A&beta; is a useful experimental paradigm for studying synaptic dysfunctions in AD models and for screening drugs capable of mitigating or reverting such synaptic impairments. Studies have shown that A&beta; produces the LTP disruption preferentially via its oligomeric form. Here we provide a detailed protocol for impairing LTP by perfusion of oligomerized synthetic A&beta;1-42 peptide onto acute hippocampal slices. In this video, we outline a step-by-step procedure for the preparation of oligomeric A&beta;1-42. Then, we follow an individual experiment in which LTP is reduced in hippocampal slices exposed to oligomerized A&beta;1-42 compared to slices in a control experiment where no A&beta;1-42 exposure had occurred.

Preparation of Oligomeric &amp;#946;-amyloid1-42 and Induction of Synaptic Plasticity Impairment on Hippocampal Slices

One feature of Alzheimer's Disease is the elevation of A&beta;1-42 peptide. Here we provide a protocol for preparing synthetic A&beta;1-42 oligomers, which impairs hippocampal Long-Term Potentiation, a cellular correlate of memory. This procedure is useful for investigating mechanisms of A&beta;-induced pathology and drug screening.

Préparation des oligomères β-amyloïde 1-42 Et induction de la plasticité synaptique Dépréciation sur les coupes d&#39;hippocampe

Impairment of synaptic connections is likely to underlie the subtle amnesic changes occurring at the early stages of Alzheimer s Disease (AD). ...

Recherche

Neurosciences

Mapping Inhibitory Neuronal Circuits by Laser Scanning Photostimulation

Inhibitory neurons are crucial to cortical function. They comprise about 20% of the entire cortical neuronal population and can be further subdivided into diverse subtypes based on their immunochemical, morphological, and physiological properties1-4. Although previous research has revealed much about intrinsic properties of individual types of inhibitory neurons, knowledge about their local circuit connections is still relatively limited3,5,6. Given that each individual neuron's function is shaped by its excitatory and inhibitory synaptic input within cortical circuits, we have been using laser scanning photostimulation (LSPS) to map local circuit connections to specific inhibitory cell types. Compared to conventional electrical stimulation or glutamate puff stimulation, LSPS has unique advantages allowing for extensive mapping and quantitative analysis of local functional inputs to individually recorded neurons3,7-9. Laser photostimulation via glutamate uncaging selectively activates neurons perisomatically, without activating axons of passage or distal dendrites, which ensures a sub-laminar mapping resolution. The sensitivity and efficiency of LSPS for mapping inputs from many stimulation sites over a large region are well suited for cortical circuit analysis.
Here we introduce the technique of LSPS combined with whole-cell patch clamping for local inhibitory circuit mapping. Targeted recordings of specific inhibitory cell types are facilitated by use of transgenic mice expressing green fluorescent proteins (GFP) in limited inhibitory neuron populations in the cortex3,10, which enables consistent sampling of the targeted cell types and unambiguous identification of the cell types recorded. As for LSPS mapping, we outline the system instrumentation, describe the experimental procedure and data acquisition, and present examples of circuit mapping in mouse primary somatosensory cortex. As illustrated in our experiments, caged glutamate is activated in a spatially restricted region of the brain slice by UV laser photolysis; simultaneous voltage-clamp recordings allow detection of photostimulation-evoked synaptic responses. Maps of either excitatory or inhibitory synaptic input to the targeted neuron are generated by scanning the laser beam to stimulate hundreds of potential presynaptic sites. Thus, LSPS enables the construction of detailed maps of synaptic inputs impinging onto specific types of inhibitory neurons through repeated experiments. Taken together, the photostimulation-based technique offers neuroscientists a powerful tool for determining the functional organization of local cortical circuits.

This paper introduces an approach of combining laser scanning photostimulation with whole cell recordings in transgenic mice expressing GFP in limited inhibitory neuron populations. The technique allows for extensive mapping and quantitative analysis of local synaptic circuits of specific inhibitory cortical neurons.

Cartographie inhibitrice circuits neuronaux par balayage laser photostimulation

Inhibitory neurons are crucial to cortical function. They comprise about 20% of the entire cortical neuronal population and can be further subdivided into ...

Lateral Diffusion and Exocytosis of Membrane Proteins in Cultured Neurons Assessed using Fluorescence Recovery and Fluorescence-loss Photobleaching

Membrane proteins such as receptors and ion channels undergo active trafficking in neurons, which are highly polarised and morphologically complex. This directed trafficking is of fundamental importance to deliver, maintain or remove synaptic proteins.
Super-ecliptic pHluorin (SEP) is a pH-sensitive derivative of eGFP that has been extensively used for live cell imaging of plasma membrane proteins1-2. At low pH, protonation of SEP decreases photon absorption and eliminates fluorescence emission. As most intracellular trafficking events occur in compartments with low pH, where SEP fluorescence is eclipsed, the fluorescence signal from SEP-tagged proteins is predominantly from the plasma membrane where the SEP is exposed to a neutral pH extracellular environment. When illuminated at high intensity SEP, like every fluorescent dye, is irreversibly photodamaged (photobleached)3-5. Importantly, because low pH quenches photon absorption, only surface expressed SEP can be photobleached whereas intracellular SEP is unaffected by the high intensity illumination6-10. 
FRAP (fluorescence recovery after photobleaching) of SEP-tagged proteins is a convenient and powerful technique for assessing protein dynamics at the plasma membrane. When fluorescently tagged proteins are photobleached in a region of interest (ROI) the recovery in fluorescence occurs due to the movement of unbleached SEP-tagged proteins into the bleached region. This can occur via lateral diffusion and/or from exocytosis of non-photobleached receptors supplied either by de novo synthesis or recycling (see Fig. 1). The fraction of immobile and mobile protein can be determined and the mobility and kinetics of the diffusible fraction can be interrogated under basal and stimulated conditions such as agonist application or neuronal activation stimuli such as NMDA or KCl application8,10. 
We describe photobleaching techniques designed to selectively visualize the recovery of fluorescence attributable to exocytosis. Briefly, an ROI is photobleached once as with standard FRAP protocols, followed, after a brief recovery, by repetitive bleaching of the flanking regions. This 'FRAP-FLIP' protocol, developed in our lab, has been used to characterize AMPA receptor trafficking at dendritic spines10, and is applicable to a wide range of trafficking studies to evaluate the intracellular trafficking and exocytosis.

This report describes the use of live cell imaging and photobleach techniques to determine the surface expression, transport pathways and trafficking kinetics of exogenously expressed, pH-sensitive GFP-tagged proteins at the plasma membrane of neurons.

Diffusion latérale et l&#39;exocytose des protéines membranaires dans des neurones en culture évaluée à l&#39;aide de récupération de fluorescence et de fluorescence de perte de photoblanchiment

Membrane proteins such as receptors and ion channels undergo active trafficking in neurons, which are highly polarised and morphologically complex. This ...

Simultaneous Electroencephalography, Real-time Measurement of Lactate Concentration and Optogenetic Manipulation of Neuronal Activity in the Rodent Cerebral Cortex

Although the brain represents less than 5% of the body by mass, it utilizes approximately one quarter of the glucose used by the body at rest1. The function of non rapid eye movement sleep (NREMS), the largest portion of sleep by time, is uncertain. However, one salient feature of NREMS is a significant reduction in the rate of cerebral glucose utilization relative to wakefulness2-4. This and other findings have led to the widely held belief that sleep serves a function related to cerebral metabolism. Yet, the mechanisms underlying the reduction in cerebral glucose metabolism during NREMS remain to be elucidated.
	One phenomenon associated with NREMS that might impact cerebral metabolic rate is the occurrence of slow waves, oscillations at frequencies less than 4 Hz, in the electroencephalogram5,6. These slow waves detected at the level of the skull or cerebral cortical surface reflect the oscillations of underlying neurons between a depolarized/up state and a hyperpolarized/down state7. During the down state, cells do not undergo action potentials for intervals of up to several hundred milliseconds. Restoration of ionic concentration gradients subsequent to action potentials represents a significant metabolic load on the cell8; absence of action potentials during down states associated with NREMS may contribute to reduced metabolism relative to wake.
	Two technical challenges had to be addressed in order for this hypothetical relationship to be tested. First, it was necessary to measure cerebral glycolytic metabolism with a temporal resolution reflective of the dynamics of the cerebral EEG (that is, over seconds rather than minutes). To do so, we measured the concentration of lactate, the product of aerobic glycolysis, and therefore a readout of the rate of glucose metabolism in the brains of mice. Lactate was measured using a lactate oxidase based real time sensor embedded in the frontal cortex. The sensing mechanism consists of a platinum-iridium electrode surrounded by a layer of lactate oxidase molecules. Metabolism of lactate by lactate oxidase produces hydrogen peroxide, which produces a current in the platinum-iridium electrode. So a ramping up of cerebral glycolysis provides an increase in the concentration of substrate for lactate oxidase, which then is reflected in increased current at the sensing electrode. It was additionally necessary to measure these variables while manipulating the excitability of the cerebral cortex, in order to isolate this variable from other facets of NREMS.
	We devised an experimental system for simultaneous measurement of neuronal activity via the elecetroencephalogram, measurement of glycolytic flux via a lactate biosensor, and manipulation of cerebral cortical neuronal activity via optogenetic activation of pyramidal neurons. We have utilized this system to document the relationship between sleep-related electroencephalographic waveforms and the moment-to-moment dynamics of lactate concentration in the cerebral cortex. The protocol may be useful for any individual interested in studying, in freely behaving rodents, the relationship between neuronal activity measured at the electroencephalographic level and cellular energetics within the brain.

A procedure is described for manipulating the activity of cerebral cortical pyramidal neurons optogenetically while the electroencephalogram, electromyogram, and cerebral lactate concentration are monitored. Experimental recordings are performed on cable-tethered mice while they undergo spontaneous sleep/wake cycles. Optogenetic equipment is assembled in our laboratory; recording equipment is commercially available.

Électroencéphalographie simultanée, en temps réel Mesure de la concentration de lactate et manipulation optogenetic de l&#39;activité neuronale dans le cortex cérébral des rongeurs

Although the brain represents less than 5% of the body  by mass, it utilizes approximately one quarter of the glucose used by the body  at rest1. The ...

Fast Micro-iontophoresis of Glutamate and GABA: A Useful Tool to Investigate Synaptic Integration

One of the fundamental interests in neuroscience is to understand the integration of excitatory and inhibitory inputs along the very complex structure of the dendritic tree, which eventually leads to neuronal output of action potentials at the axon. The influence of diverse spatial and temporal parameters of specific synaptic input on neuronal output is currently under investigation, e.g. the distance-dependent attenuation of dendritic inputs, the location-dependent interaction of spatially segregated inputs, the influence of GABAergig inhibition on excitatory integration, linear and non-linear integration modes, and many more.
With fast micro-iontophoresis of glutamate and GABA it is possible to precisely investigate the spatial and temporal integration of glutamatergic excitation and GABAergic inhibition. Critical technical requirements are either a triggered fluorescent lamp, light-emitting diode (LED), or a two-photon scanning microscope to visualize dendritic branches without introducing significant photo-damage of the tissue. Furthermore, it is very important to have a micro-iontophoresis amplifier that allows for fast capacitance compensation of high resistance pipettes. Another crucial point is that no transmitter is involuntarily released by the pipette during the experiment.
Once established, this technique will give reliable and reproducible signals with a high neurotransmitter and location specificity. Compared to glutamate and GABA uncaging, fast iontophoresis allows using both transmitters at the same time but at very distant locations without limitation to the field of view. There are also advantages compared to focal electrical stimulation of axons: with micro-iontophoresis the location of the input site is definitely known and it is sure that only the neurotransmitter of interest is released. However it has to be considered that with micro-iontophoresis only the postsynapse is activated and presynaptic aspects of neurotransmitter release are not resolved. In this article we demonstrate how to set up micro-iontophoresis in brain slice experiments.

In this article we introduce fast micro-iontophoresis of neurotransmitters as a technique to investigate integration of postsynaptic signals with high spatial and temporal precision.

Rapide Micro-iontophorèse de glutamate et le GABA: un outil utile d&#39;étudier l&#39;intégration synaptique

One of the fundamental interests in neuroscience is to understand the integration of excitatory and inhibitory inputs along the very complex structure of ...

Deriving the Time Course of Glutamate Clearance with a Deconvolution Analysis of Astrocytic Transporter Currents

The highest density of glutamate transporters in the brain is found in astrocytes. Glutamate transporters couple the movement of glutamate across the membrane with the co-transport of 3 Na+ and 1 H+ and the counter-transport of 1 K+. The stoichiometric current generated by the transport process can be monitored with whole-cell patch-clamp recordings from astrocytes. The time course of the recorded current is shaped by the time course of the glutamate concentration profile to which astrocytes are exposed, the kinetics of glutamate transporters, and the passive electrotonic properties of astrocytic membranes. Here we describe the experimental and analytical methods that can be used to record glutamate transporter currents in astrocytes and isolate the time course of glutamate clearance from all other factors that shape the waveform of astrocytic transporter currents. The methods described here can be used to estimate the lifetime of flash-uncaged and synaptically-released glutamate at astrocytic membranes in any region of the central nervous system during health and disease.

We describe an analytical method to estimate the lifetime of glutamate at astrocytic membranes from electrophysiological recordings of glutamate transporter currents in astrocytes.

Issu l&#39;évolution temporelle du glutamate Dégagement avec une analyse de déconvolution des courants de Transporteur ASTROCYTIQUES

The highest density of glutamate transporters in the brain is found in astrocytes. Glutamate transporters couple the movement of glutamate across the ...

Genetic Manipulation of Cerebellar Granule Neurons In Vitro and In Vivo to Study Neuronal Morphology and Migration

Developmental events in the brain including neuronal morphogenesis and migration are highly orchestrated processes. In vitro and in vivo analyses allow for an in-depth characterization to identify pathways involved in these events. Cerebellar granule neurons (CGNs) that are derived from the developing cerebellum are an ideal model system that allows for morphological analyses. Here, we describe a method of how to genetically manipulate CGNs and how to study axono- and dendritogenesis of individual neurons. With this method the effects of RNA interference, overexpression or small molecules can be compared to control neurons. In addition, the rodent cerebellar cortex is an easily accessible in vivo system owing to its predominant postnatal development. We also present an in vivo electroporation technique to genetically manipulate the developing cerebella and describe subsequent cerebellar analyses to assess neuronal morphology and migration.

Genetic Manipulation of Cerebellar Granule Neurons In Vitro and In Vivo to Study Neuronal Morphology and Migration

Neuronal morphogenesis and migration are crucial events underlying proper brain development. Here, we describe methods to genetically manipulate cultured cerebellar granule neurons and the developing cerebellum for the assessment of morphology and migratory characteristics of neurons.

Manipulation génétique des neurones du cervelet granules<em&gt; In Vitro</em&gt; Et<em&gt; In Vivo</em&gt; À étudier neuronale Morphologie et migration

Developmental events in the brain including neuronal morphogenesis and migration are highly orchestrated processes. In vitro and in vivo analyses allow ...

An In Vitro Adult Mouse Muscle-nerve Preparation for Studying the Firing Properties of Muscle Afferents

Muscle sensory neurons innervating muscle spindles and Golgi tendon organs encode length and force changes essential to proprioception. Additional afferent fibers monitor other characteristics of the muscle environment, including metabolite buildup, temperature, and nociceptive stimuli. Overall, abnormal activation of sensory neurons can lead to movement disorders or chronic pain syndromes. We describe the isolation of the extensor digitorum longus (EDL) muscle and nerve for in vitro study of stretch-evoked afferent responses in the adult mouse. Sensory activity is recorded from the nerve with a suction electrode and individual afferents can be analyzed using spike sorting software. In vitro preparations allow for well controlled studies on sensory afferents without the potential confounds of anesthesia or altered muscle perfusion. Here we describe a protocol to identify and test the response of muscle spindle afferents to stretch. Importantly, this preparation also supports the study of other subtypes of muscle afferents, response properties following drug application and the incorporation of powerful genetic approaches and disease models in mice.

An In Vitro Adult Mouse Muscle-nerve Preparation for Studying the Firing Properties of Muscle Afferents

Muscle sensory neurons are involved in proprioceptor signaling and also report on metabolic state and injury related events. We describe an adult mouse in vitro muscle-nerve preparation for studies on stretch-activated muscle afferents.

Un<em&gt; In Vitro</emMuscle-nerf&gt; Adult Souris Préparation pour étudier les propriétés de cuisson des afférences musculaires

Muscle sensory neurons innervating muscle spindles and Golgi tendon organs encode length and force changes essential to proprioception. Additional ...

Pentylenetetrazole-Induced Kindling Mouse Model

Pentylenetetrazole (PTZ) is a GABA-A receptor antagonist. An intraperitoneal injection of PTZ into an animal induces an acute, severe seizure at a high dose, whereas sequential injections of a subconvulsive dose have been used for the development of chemical kindling, an epilepsy model. A single low-dose injection of PTZ induces a mild seizure without convulsion. However, repetitive low-dose injections of PTZ decrease the threshold to evoke a convulsive seizure. Finally, continuous low-dose administration of PTZ induces a severe tonic-clonic seizure. This method is simple and widely applicable to investigate the pathophysiology of epilepsy, which is defined as a chronic disease that involves repetitive seizures. This chemical kindling protocol causes repetitive seizures in animals. With this method, vulnerability to PTZ-mediated seizures or the degree of aggravation of epileptic seizures was estimated. These advantages have led to the use of this method for screening anti-epileptic drugs and epilepsy-related genes. In addition, this method has been used to investigate neuronal damage after epileptic seizures because the histological changes observed in the brains of epileptic patients also appear in the brains of chemical-kindled animals. Thus, this protocol is useful for conveniently producing animal models of epilepsy.

This protocol describes a method of chemical kindling with pentylenetetrazole and provides a mouse model of epilepsy. This protocol can also be used to investigate vulnerability to seizure induction and pathogenesis after epileptic seizures in mice.

Modèle de souris de bois d’allumage induite par le pentylènetétrazole

Pentylenetetrazole (PTZ) is a GABA-A receptor antagonist. An intraperitoneal injection of PTZ into an animal induces an acute, severe seizure at a high ...

Non-invasive Strategies for Chronic Manipulation of DREADD-controlled Neuronal Activity

Chemogenetic strategies have emerged as reliable tools for remote control of neuronal activity. Among these, designer receptors exclusively activated by designer drugs (DREADDs) have become the most popular chemogenetic approach used in modern neuroscience. Most studies deliver the ligand clozapine-N-oxide (CNO) using a single intraperitoneal injection, which is suitable for the acute activation/inhibition of the targeted neuronal population. There are, however, only a few examples of strategies for chronic modulation of DREADD-controlled neurons, the majority of which rely on the use of delivery systems that require surgical intervention. Here, we expand on two non-invasive strategies for delivering the ligand CNO to chronically manipulate neural population in mice. CNO was administered either by using repetitive (daily) eye-drops, or chronically through the animal&#39;s drinking water. These non-invasive paradigms result in robust activation of the designer receptors that persisted throughout the CNO treatments. The methods described here offer alternatives for the chronic DREADD-mediated control of neuronal activity and may be useful for experiments designed to evaluate behavior in freely moving animals, focusing on less-invasive CNO delivery methods.

Here we describe two non-invasive methods to chronically control neuronal activity using chemogenetics in mice. Eye-drops were used to deliver clozapine-N-oxide (CNO) daily. We also describe two methods for prolonged administration of CNO in drinking water. These strategies for chronic neuronal control require minimal intervention reducing animals&#8217; stress.

Stratégies non invasives pour la manipulation chronique de l'activité neuronale contrôlée par DREADD

Chemogenetic strategies have emerged as reliable tools for remote control of neuronal activity. Among these, designer receptors exclusively activated by ...