Notre protocole peut être utilisé pour examiner les effets respiratoires de la leptine sur le corps carotide dans le contrôle respiratoire chemoreflex périphérique, et les réponses physiologiques à l’hypoxie. Nous pouvons également évaluer les effets de la perte et du gain de la fonction carotide de corps utilisant la dénervation chirurgicale et chimique et la transfection d’adénovirus respectivement. Avant de commencer l’intervention, mesurez la température à l’intérieur d’une chambre plasthemagrophy sur mesure et mesurez l’humidité relative du laboratoire.
Ensuite, mesurez le poids corporel et la température rectale de la souris expérimentale. Placez la souris à l’intérieur de la chambre et placez un collier d’oxymètre autour du cou rasé de l’animal. Et assurez-vous de sceller complètement la chambre pour éviter les fuites d’air.
Attendez environ 30 minutes jusqu’à ce que la souris soit silencieuse et que la chambre soit à volume constant. Avant de commencer à enregistrer les signaux respiratoires et la saturation périphérique en oxygène à la normoxie. Après 20 minutes de normoxie, exposer l’animal à un flux constant de gaz mixte de 10% d’oxygène et 3% de dioxyde de carbone.
Et commencer à enregistrer le premier cycle de l’hypoxie aiguë dans les signaux respiratoires et la saturation périphérique en oxygène. Pendant les 30 premières secondes de l’hypoxie, ouvrez les deux petits ports latéraux à la base de la chambre pour permettre les bouchons des gaz de mélange. Après les 30 premières secondes, fermer l’un des petits ports latéraux de la chambre et continuer à enregistrer à une hypoxie constante à 10% de la fraction de l’oxygène inspiré pendant cinq minutes.
À la fin du traitement par hypoxie, changer la source d’écoulement pour réexposer la souris à l’air de la pièce et permettre à l’animal de récupérer à la normoxie pendant au moins 30 minutes avant de commencer l’analyse suivante. À la fin de l’expérience, branchez une seringue dans l’un des petits ports latéraux à la base de la chambre et injectez trois fois un millilitre d’air de pièce dans la chambre de pléthysmographie de sang entier pour calibrer la chambre. Après la troisième chasse d’eau, mesurer la température dans la chambre avec l’animal encore à l’intérieur et la chambre encore fermée.
Ensuite, ouvrez la chambre et mesurez la température rectale de la souris avant de retourner l’animal dans sa cage d’origine. Pour la dénervation chirurgicale du nerf carotide de sinus, administrez l’analgésie à la souris d’anesthésie, et enlevez les cheveux à la région ventrale du cou. Désinfectez la peau exposée avec de la bétadine et de l’alcool et appliquez de l’onguent sur les yeux de l’animal.
Après avoir fait une incision médiane, enlever les tissus conjonctifs et adipeux pour exposer la bifurcation des artères carotides communes et identifier le nerf hypoglossal. Soulevez le nerf hypoglossal pour exposer le nerf glossopharyngeal immédiatement au-dessous et employer des ciseaux de micro-ressort pour disséquer bilatéralement les nerfs carotides de sinus. Lorsque les corps carotides ont été exposés, suspendre doucement un microlitre de l’adénovirus approprié dans quatre microlitres de matrice liquide Matrigel sur la glace, de chaque côté, et appliquer cinq microlitres de la suspension virale à la zone du corps carotide bilatéralement.
Attendez deux à trois minutes jusqu’à ce que la matrice liquide Matrigel se soit solidifiée avant de fermer l’incision avec une suture de soie 6-0 et d’administrer un millilitre de solution saline normale sous-cutanée. Ensuite, abritez la souris dans une chambre de récupération avec surveillance jusqu’à la récumbence sternale avant de retourner l’animal dans sa cage d’origine. L’infusion continue de leptin augmente de manière significative la réponse ventilatoire hypoxique chez les souris maigres de C57BL/6 tandis que la dissection carotide de nerf de sinus abolit cette augmentation induite par le leptin.
Comme prévu, aucun effet atténuant de la dissection carotide de nerf de sinus sur la réponse ventilatoire hypoxique n’est observé dans le groupe de chirurgie simulée après infusion de leptin. L’induction de l’expression isoforme longue de récepteur de leptin dans les corps carotides du récepteur de leptin de longues souris obèses déficientes db/db d’isoforme a comme conséquence une augmentation significative de la réponse ventilatoire hypoxique. Alors qu’après la transfection avec l’adénovirus lacz de contrôle, aucun changement n’est observé.
Ces techniques permettent d’analyser le rôle des corps carotides dans le chemoreflex périphérique et les effets de la leptine sur les corps carotides dans le contrôle des respirations.
