Ce protocole offre une méthode normalisée pour déterminer l’identité et la pureté des cellules immunitaires, et traite de la limitation de la cytométrie du débit, comme les besoins importants en échantillons, la variabilité élevée de l’utilisateur à l’utilisateur et l’analyse subjective des données. Cet essai inclut un modèle automatisé d’analyse de données qui permet aux utilisateurs d’évaluer objectivement l’identité et la pureté des cellules immunitaires. Ceci, avec les contrôles multiples d’essai offre une méthode clé en main, facilement normalisée pour évaluer l’identité et la pureté de cellules immunisées.
Jerry Guzman, scientifique dans notre laboratoire, démontrera cette technique. Après l’isolement de l’ADN génomique de l’échantillon de cellules hématopoïétiques d’intérêt, utilisez un microlitre de l’ADN génomique pour mesurer la pureté de l’échantillon sur un spectrophotomètre en obtenant la densité optique à 260, 280 et 230 nanomètres. Ensuite diluer 400 à 1200 nanogrammes d’échantillon d’ADN génomique à un volume final de 142 microlitres avec tampon d’élitution à partir d’une trousse d’isolement de l’ADN génomique.
Ajouter 75 microlitres du calibreur à 67 microlitres de tampon d’élitution. Et diluer 1200 nanogrammes de l’ADN génomique de référence à un volume total de 142 microlitres avec tampon d’élitution. Puis incuber les tubes pendant cinq minutes à 56 degrés Celsius et 900 révolutions par minute dans un mélangeur thermique.
Pour la conversion de la bisulfite, ajouter 270 microlitres d’ammonium bisulfite et 90 microlitres de THFA à tous les tubes. Et vortex les tubes pour assurer un mélange complet. Faites tourner brièvement les échantillons pour recueillir le liquide et placez les tubes dans le mélangeur thermique pendant 45 minutes à 80 degrés Celsius et 900 révolutions par minute.
Puis faites tourner brièvement les échantillons à nouveau et laissez-les refroidir à température ambiante pendant trois à cinq minutes. Pour la purification de l’ADN après la conversion de la bisulfite, vortex les perles paramagnetic d’isolement d’ADN pendant 30 secondes. Ajouter de l’éthanol et de l’isopropanol aux tampons de lavage en fonction des volumes indiqués sur les bouteilles.
Vortex à nouveau jusqu’à ce que les perles soient complètement résuspendues et à 870 microlitres de tampon liant la lyse et 105 microlitres des perles paramagnetic de liaison d’ADN à chaque tube. Vortex les tubes à mélanger avant de tourner brièvement vers le bas les échantillons. Ajouter 570 microlitres de 2 propanol à chaque tube et mélanger par vortex.
Incuber les tubes pendant sept minutes à température ambiante et 50 RPM par minute avant de tourner brièvement les tubes à nouveau et de les placer sur un support magnétique pendant cinq minutes. À la fin de l’incubation enlever le supernate sans déranger les perles. Laver l’échantillon avec le tampon 1 et vortex les tubes.
Après une brève centrifugation placer les tubes de retour dans la grille pendant trois minutes et enlever le superné sans déranger les perles. Lavez l’échantillon deux fois avec le tampon de lavage 2 et séchez les tubes à 65 degrés Celsius pendant 15 minutes. Ensuite, ajoutez 60 microlitres zone tampon d’évolution à chaque tube.
Après une incubation de sept minutes à température ambiante et 1400 rotations par minute, tournez brièvement les tubes et retournez les tubes à l’aimant pendant deux minutes. À la fin du transfert d’incubation, 55 microlitres de la bisulfite ont converti l’ADN contenant un nouveau tube sans déranger les perles. Pour exécuter le PCR quantitatif sur les échantillons, attribuez chaque norme à la norme de tâche dans le logiciel PCR quantitatif et spécifiez les numéros de copie finale selon le tableau.
Préparez des dilutions périodiques de l’ADN standard et préparez un cocktail de mélange quantitatif pcr master pour le type de cellule cible. Et un cocktail de mixage quantitatif PCR master pour GAPDH, selon le tableau. Chargez trois microlitres de l’ADN du modèle dans les puits appropriés d’une plaque inférieure bien arrondie de 96, suivie de sept microlitres de mélange principal.
Lorsque tous les puits ont été chargés sceller la plaque avec un film PCR quantitatif et tourner brièvement la plaque avant de la charger sur l’instrument PCR quantitatif. Ensuite, exécutez la réaction comme indiqué dans le tableau. À l’achèvement de la course, exportez les données quantitatives pcr sous forme de fichier txt ou xlsx.
Après avoir purifié l’ADN converti en bisulfite avec des battements paramagnetiques comme démontré, elute 25 microlitres de l’ADN. Transférer l’ADN converti en bisulfite en un nouveau tube et ajouter deux microlitres de l’échantillon en tubes à bande PCR individuels. Ajouter deux microlitres d’eau à un tube de commande sans modèle et préparer le mélange maître de préamplification pour tous les échantillons selon le tableau.
Ajouter 23 microlitres de mélange maître à chaque tube et bouchon, vortex, et tourner brièvement vers le bas les tubes. Ensuite, exécutez le protocole de préamplification sur un cycleur thermo à l’aide d’un couvercle chauffant. Une fois la course terminée, tournez brièvement les tubes et transférez-les vers des microlitres de l’ADN amplifié vers de nouveaux tubes.
Ensuite, diluer les échantillons avec 78 micro litres d’eau à une concentration d’un à 40 et exécuter un PCR quantitatif des échantillons comme démontré. Ici, les données représentatives d’un essai de cellule CD8+T obtenus de l’analyse du sang périphérique, des cellules mononucléaires, et des cellules de T de trois donateurs différents utilisant la cytométrie de flux et les analyses de méthylation sont montrées. Les tendances entre les deux méthodes chez tous les donneurs des deux types de cellules étaient similaires.
Ces données représentatives de l’analyse Treg montrent également des résultats similaires entre les méthodes. Cependant, dans tous les cas, cet essai de méthylation a donné des valeurs plus élevées dans des conditions stimulées et non simulées. La sensibilité et la spécificité de chaque analyse ont été démontrées par la limite des valeurs de blanc, de limite de détection et de limite de quantitation.
Parce que cet essai offre un modèle automatisé d’analyse de données, il améliore l’analyse objective et augmente les capacités de normalisation. Ceci est idéal pour la fabrication de thérapie cellulaire où les méthodes normalisées sont cruciales pour la création d’un produit de thérapie cellulaire cohérente.
