Le transport axonal est vital pour la santé neuronale et la viabilité. Notre protocole décrit une méthode élégante de surveillance et d’analyse du transport axonal. Et peut être adapté pour divers modèles de maladies neuronales.
L’utilisation de chambres microfluidiques permet un contrôle temporel spatial précis, ce qui est crucial pour l’étude de la biologie axonale. Des anomalies axonales de transport sont impliquées avec plusieurs maladies neurodégénératives telles que la SLA. La plate-forme microfluidique permet d’étudier les mécanismes de base ainsi que de tester des thérapies pour réparer les défauts de transport axonal.
La plate-forme de chambre microfluidique peut être facilement adaptée à différents aspects de la recherche axonale, y compris la croissance axonale et la dégénérescence de divers sous-types neuronaux. Cette méthode est complexe et généralement enseignée sur le bras. La démonstration visuelle augmentera l’accessibilité de cette procédure à tout scientifique intéressé à étudier le transport axonal.
Commencez par moulage PDMS dans les moules primaires. Utilisez de l’air pressurisé pour enlever toute saleté de la plate-forme de gaufrette, en vous assurant que les gaufrettes semblent lisses et claires avant de procéder. Ensuite, remplissez un récipient d’azote liquide et préparez une seringue de 10 millilitres à l’aide d’une aiguille de calibre 23.
Dans une hotte chimique, placer la plaquette contenant de la plaque dans un contenant étanche et remplir la seringue de deux millilitres d’azote liquide par plaquette contenant de la plaque. Ouvrir une bouteille de chlorotrimethylsilane. Percer le bouchon en caoutchouc avec la seringue et injecter l’azote dans la bouteille.
Sans retirer l’aiguille, retourner la bouteille à l’envers et réduire de deux millilitres de chlorotrimethylsilane pour chaque plaquette contenant de la plaque. Étendre le chlorotrimethylsilane dans le récipient, mais pas directement sur la plaque de gaufrette contenant de la plaque. Fermez le récipient.
Et l’incuber pendant cinq minutes par gaufrette. Ensuite peser 47,05 grammes de base PDMS dans un tube de 50 millilitres, et ajouter pdms agent de séchage à un rapport de 16 à 1 base à l’agent curateur pour un total de 50 grammes. Mélanger le PDMS pendant 10 minutes sur un rotateur à basse vitesse, puis le verser dans chaque plaquette contenant de la plaque à la hauteur désirée.
Placez les plaques à l’intérieur d’un dessiccateur sous vide pendant deux heures. Qui va enlever l’air emprisonné dans le PDMS, et former un moule uniforme clair. Ensuite, incuber les assiettes dans un four pendant trois heures ou toute la nuit à 70 Degrés Celsius.
Pour créer la chambre microfluidique ou MFC. Couper et enlever les moules PDMS de la plaque avec un scalpel, en s’assurant de ne pas forcer les moules parce qu’ils sont fragiles. Suivez les instructions dans le manuscrit du texte pour poinçonner et couper les chambres, en fonction de la configuration expérimentale.
Pour la culture d’explantation de moelle épinière, poinçonner deux puits de sept millimètres dans le côté distal d’un grand MFC, en s’assurant qu’ils se chevaucheront avec les bords du canal. Sur le côté proximal, poinçonner un puits de sept millimètres au milieu du canal avec un chevauchement minimal, de sorte qu’il reste suffisamment d’espace pour les explants. Perforer deux trous supplémentaires d’un millimètre dans les deux bords du canal proximal.
Et couper le PDMS en chambres simples. Tournez ensuite le MFC vers le haut et utilisez une aiguille de calibre 20 pour sculpter trois petites grottes d’explantation sur le puits perforé de sept millimètres. Pour la culture dissociée des motoneurones, poinçonner quatre puits de six millimètres, sur les bords des deux canaux d’un petit MFC et couper le PDMS en chambres simples.
Pour stériliser le MFC, étalez 50 centimètres de long bandes de ruban adhésif sur le banc. Appuyez ensuite sur les deux faces de la chambre sur la bande et tirez-la en arrière. Placez les chambres propres dans une nouvelle plaque et incubez-les en qualité analytique, de 70% d’éthanol pendant 10 minutes sur un shaker orbital.
Disposer de l’éthanol et sécher les chambres dans une hotte de culture tissulaire ou dans un four à 70 degrés Celsius. Placez ensuite la chambre au centre d’un fossé inférieur en verre de qualité culture tissulaire, et appliquez une force mineure sur les bords pour lier le PDMS au fond du plat. Incuber le plat pendant 10 minutes à 70 degrés Celsius.
Ensuite, appuyez sur les chambres pour renforcer l’adhésion. Incuber le plat sous UV pendant 10 minutes, puis procéder au codage du MFC. Ajouter 1,5 nanogramme par millilitre plo aux deux compartiments.
S’assurer que l’OLP traverse les canaux. En pipetant le supports de revêtement directement dans l’entrée du canal. Examinez le MFC au microscope léger, pour vérifier s’il y a des bulles.
Si des bulles d’air bloquent les micro rainures, placez le MFC dans un dessiccators sous vide pendant deux minutes. Retirez l’excès d’air des canaux MFC. Puis l’incuber toute la nuit avec l’OLP.
Remplacez l’OLP par de laminine et incubez le MFC pour une nuit supplémentaire. Avant le placage, laver la laminine avec le milieu de culture. Disséquer une souris enceinte de l’ICR E12.5 et séparer les embryons du sac amniotique.
Mettre l’embryon dans le plat de silicium HBSS. Retirez la tête et la queue et retournez-la sur son ventre. Peler délicatement la peau superficielle des embryons en arrière, exposant la moelle épinière.
Séparez la moelle épinière du corps de la tête à la queue, à l’aide d’une pince à épiler douce. Retirer les méninges, puis enlever les cornes dorsales et couper la moelle épinière en sections transversales d’un millimètre d’épaisseur. Disposer de tout milieu du compartiment proximal du MFC.
Ramasser une seule explantation de moelle épinière avec une pipette, dans un volume total de quatre microlitres. Et injectez-le le plus près possible de la grotte. Sortir tout excès de liquide du puits proximal par l’intermédiaire des prises latérales.
Répétez l’étape précédente deux fois de plus et assurez-vous que les explants sont intégrés dans le canal proximal. Ajouter lentement 150 microlitres de milieu SCEX au puits proximal. Un jour après le placage.
Remplacement du milieu SCEX dans le compartiment proximal et ajout d’un milieu SCEX riche au compartiment distal. Maintien d’un gradient de volume d’au moins 15 microlitres par puits entre les puits distals et proximaux. Après quatre à six jours, les axones doivent traverser vers le compartiment distal et être prêts pour l’imagerie axonale de transport.
Pour étiqueter les mitochondries et les compartiments acides, préparez un milieu SCEX frais avec 100 nanomolaires MitoTracker Deep Red FM et 100 nanomolaires LysoTracker Red. Et ajoutez-le aux chambres microfluidiques. Incubez-les pendant 30 à 60 minutes à 37 degrés Celsius.
Laver ensuite trois fois avec un milieu SCEX chaud. Procéder à l’imagerie en direct du transport axonal. Acquisition d’une série d’images de 100 time lapse à trois intervalles de seconde.
Avec un total de cinq minutes par film. Après sept jours dans les chambres microfluidiques. Souris embryonnaire HB9 GFP explants moelle épinière.
Nous sommes tachés de teintures MitoTracker Deep Red et LysoTracker Red. Pour étiqueter les mitochondries et les compartiments acides. Des axones dans les rainures distales ont été imaged et l’analyse de Kymograph a été employée pour déterminer la distribution générale de mouvement.
Ceci a indiqué un biais dans la direction rétrograde seulement dans les compartiments acides de ville, mais pas dans le transport mitochondrique. La densité des particules a également été quantifiée, révélant un plus grand nombre de particules mitochondriales par rapport aux compartiments acides dans les axones explantés de la moelle épinière HB9 GFP. Ensuite, une seule analyse du transport de particules a été effectuée à l’aide d’un logiciel semi-automatisé suivi d’un code interne.
Cette analyse a révélé que les composants acides et les mitochondries ont des vitesses de particules similaires. Mais seuls les compartiments acides affichent un biais vers le mouvement rétrograde. Isoler la moelle épinière embryonnaire peut être difficile au début.
Pratiquez cette procédure plusieurs fois, en vous assurant d’utiliser l’âge embryonnaire correct et les outils de dissection appropriés. L’utilisation de chambres microfluidiques modifie notre façon d’étudier la biologie axonale. Il nous permet de visualiser les processus axonals localisés, que nous sommes une fois supposés se produire uniquement dans le corps cellulaire.
