Des coupes de tissus organotypiques ont été générées à partir de divers tissus. En raison de l’intégrité préservée des tissus et du développement de techniques de culture, ils ont été adaptés à la modélisation de mécanismes physiologiques complexes. Les cultures de coupes organotypiques de carcinomes pancréatiques recalculent étroitement l’architecture multicellulaire de la tumeur et son microenvironnement ex vivo.
Ils peuvent être utilisés pour diverses applications en aval, telles que les tests de réponse aux médicaments. Ils peuvent être cultivés immédiatement après la résection chirurgicale de la tumeur, et sont peu coûteux et prennent moins de temps par rapport à la plupart des autres techniques de culture primaires. La démonstration de la procédure sera assurée par Olha Lapshyna, assistante technique de l’Université de Lübeck.
Pour commencer, préparez 100 millilitres d’agarose à 8 % à bas point de fusion en dissolvant huit grammes d’agarose dans 100 millilitres de solution de sonnerie préchauffée, et conservez-la à quatre degrés Celsius jusqu’à ce que vous en ayez besoin. À l’annonce de la résection de la tumeur, faites fondre l’agarose au micro-ondes. Placez l’agarose dans un bain-marie préchauffé, lui permettant de refroidir à des températures physiologiques avant la préparation.
Placez une lame de rasoir dans le support du Vibratome et effectuez un réglage automatique de l’angle selon les instructions du fabricant. Refroidissez l’enveloppe de la chambre de coupe à l’aide d’une unité de refroidissement ou de glace humide. Remplissez la chambre de coupe avec environ 100 millilitres de solution de sonnette, puis placez la lame de rasoir montée dans la solution de coupe pré-refroidie, en laissant la lame de rasoir refroidir.
Lavez l’échantillon de tissu avec du PBS refroidi et placez-le dans une grande boîte de Pétri de 14 centimètres sur de la glace. Retirez l’excès de tissu conjonctif visible macroscopiquement sur de la glace à l’aide d’un scalpel. Placez le mouchoir dans une petite boîte de Pétri.
Ajustez l’orientation du tissu, de sorte que le tissu conjonctif macroscopiquement visible ait la même orientation que la plaine du fond de la boîte de Pétri. Versez l’agarose à bas point de fusion préparée dans la petite boîte de Pétri, en réajustant l’orientation du tissu. Si nécessaire, à l’aide d’une pince, placez la boîte de Pétri sur de la glace humide pour un durcissement plus rapide de l’agarose.
Coupez soigneusement le tissu à l’aide d’un scalpel, en laissant au moins cinq millimètres d’agarose environnante de chaque côté du tissu. Ajoutez de la colle dans le porte-échantillon, étalez-la, transférez le tissu incrusté et collez-le sur le porte-échantillon à l’aide de superglue. Après quelques secondes, placez le porte-échantillon dans la chambre de coupe et ajustez l’orientation du tissu vers la lame de rasoir si nécessaire.
Définir les limites extérieures de la plage de coupe en fonction de la taille de l’échantillon de tissu. Ajustez la lame vers le haut du bloc de tissu. Réglez la vitesse de coupe à 0,04 millimètre par seconde, l’amplitude de coupe à un millimètre et l’épaisseur de la tranche à 300 micromètres.
Coupez soigneusement les premières tranches et transférez-les dans un récipient séparé avec une solution de sonnerie pré-réfrigérée sur de la glace humide. Préparez une plaque à six puits avec un millilitre du milieu de culture approprié par puits. Placez la plaque à six puits avec le milieu dans un incubateur, en laissant la température et le pH s’ajuster avant la culture.
Placez les tranches sur des inserts de culture cellulaire à l’aide d’un filtre de regard, puis retirez tout excès de solution de ringer en plaçant le filtre chargé sur un chiffon stérile. Placez le filtre chargé dans la plaque à six puits préparée sans ajouter de milieu supplémentaire à l’insert, puis placez la plaque à six puits dans un incubateur et changez de milieu tous les deux jours. Placez le filtre de culture avec la tranche montée sur une boîte de Pétri.
À l’aide d’un scalpel, découpez soigneusement la membrane filtrante avec la tranche de tissu montée. Transférez la membrane filtrante avec la tranche montée dans un sac en nylon de biopsie et placez-la dans une cassette d’enrobage. Par la suite, transférez les cassettes d’enrobage en plastique dans un récipient contenant du formol à 4,5 % pré-réfrigéré pendant au moins 24 heures ou jusqu’à ce qu’ils soient utilisés ultérieurement.
Rincez avec précaution la culture de tranches fixes de formol avec de l’eau courante du robinet pendant 1,5 heure. Déshydrater la tranche de tissu fixé au formol par incubation dans 70 % à 95 % et de l’éthanol absolu. Ensuite, nettoyez la tranche de tissu fixé au formol avec deux incubations de trois heures dans du xylène.
Plongez le mouchoir avec de la paraffine à 60 degrés Celsius pendant la nuit, puis à nouveau pendant deux heures. Incorporez le tissu dans un bloc de paraffine dans un moule d’enrobage de tissu et placez-le sur de la glace pour refroidir l’échantillon plus rapidement. Sectionnez le bloc de tissu incrusté de paraffine à quatre micromètres d’épaisseur avec un Microtome et dans un bain-marie à 40 degrés Celsius contenant de l’eau distillée.
Transférez les sections sur des lames de verre. Incuber des sections de paraffine pendant une heure à 60 degrés Celsius pour lier le tissu au verre. Ensuite, incubez les lames pendant la nuit à 37 degrés Celsius.
Déparaffiniser les sections par incubation dans du xylène trois fois pendant cinq minutes chacune. Ensuite, réhydrater par incubations successives dans de l’alcool absolu, 95% d’alcool, et 70% d’alcool. Techez les sections dans la solution d’hématoxyline Mayer pendant cinq minutes et rincez à l’eau courante du robinet pendant 10 minutes.
Contre-colorez dans une solution à 0,5 % ESN pendant 40 secondes et rincez à l’eau distillée, puis répétez la déshydratation dans de l’éthanol. Nettoyez le tissu en trois changements de xylène pendant quelques secondes chacun, puis placez une goutte de support de montage et couvrez les lames avec une lamelle. La morphologie macroscopique de chaque OTSC a diminué pendant la culture pendant six jours.
L’inviabilité est sauvegardée pour les OTSC à partir de deux tumeurs primaires représentatives dans deux milieux différents a montré une diminution de la viabilité après le jour zéro en raison de la procédure de sectionnement et de l’ajustement aux conditions de culture, ainsi qu’une augmentation de la viabilité de l’échantillon de tumeur dans le panneau de droite. Les coupes de coloration H&E ont montré que la structure globale du tissu a été préservée pendant toute la durée de la culture ex vivo, et qu’aucun changement flagrant de prolifération et d’apoptose n’a été détecté pendant la période de culture de six jours. L’évaluation histopathologique microscopique des coupes H&E n’a pas révélé d’augmentation substantielle de la nécrose de tous les tissus cultivés pendant la culture.
Il y a eu une augmentation des cellules caspase-3-positives clivées après la culture d’un adénocarcinome canalaire pancréatique primaire, ou PDAC, pendant 15 jours. L’histopathologie d’une métastase péritonéale d’un PDAC a mis en évidence une forte hétérogénéité intratumorale entre les coupes individuelles, ainsi qu’une apoptose naturelle mesurée par coloration à la caspase-3 clivée. La coloration H&E et la caractérisation immunohistologique de la cytokératine 7 dans une métastase PDAC de la paroi abdominale ont montré que les OTSC dérivés ne contenaient pas de cellules tumorales, mais seulement du tissu conjonctif, qui était partiellement nécrotique.
Chaque coupe cultivée peut être profilée individuellement, en fonction de la question de recherche spécifique, par exemple, par séquençage de l’ARN pour la transcriptomique ou imagerie légère pour la protéomique spatialement résolue. À l’avenir, la combinaison avec des méthodes analytiques non destructives a un grand potentiel pour prédire les réponses spécifiques des patients à différents régimes thérapeutiques.
