Le dénombrement des unités formant des colonies limitait la reproductibilité de la recherche dans le domaine des infections urinaires. L’imagerie par bioluminescence fera progresser la recherche in vivo sur les infections urinaires sur la physiologie de la vessie, la pathogenèse des infections urinaires et la susceptibilité. L’imagerie par bioluminescence permet un suivi longitudinal avec un aperçu en temps réel de l’évolution de l’infection.
De plus, il réduit considérablement le nombre d’animaux nécessaires. L’imagerie par bioluminescence facilite la recherche sur les infections récurrentes ou chroniques, qui sont fréquentes chez l’homme. De plus, les chercheurs peuvent identifier les infections ascendantes ou la dissémination dans le sang à l’aide de l’imagerie par bioluminescence.
Obtenir des colonies uniques en striant le stock de glycérol des bactéries avec une boucle d’inoculation sur des plaques LB complétées en sulfate de kanamycine et en cultivant pendant la nuit à 37 degrés Celsius. Remplissez un tube inférieur rond stérile en polystyrène de 14 millilitres, avec des bouchons à double position avec cinq millilitres de bouillon LB complétés par du sulfate de kanamycine. Choisissez une seule colonie bactérienne avec une boucle d’inoculation et ajoutez-la au bouillon LB.
Vortex pendant 10 secondes pour assurer un bon mélange. Culture statique avec le capuchon en position ouverte à 37 degrés Celsius pendant la nuit. Après l’incubation, vortex le tube pendant 10 secondes pour assurer une homogénéisation correcte de la culture bactérienne.
Faire une sous-culture dans l’Erlenmeyer en ajoutant 25 microlitres de la suspension bactérienne à 25 millilitres de milieu LB frais sans antibiotiques. Fermez l’Erlenmeyer et la culture statiquement pendant la nuit. Le jour de l’installation, versez la culture de l’Erlennmeyer dans un tube de culture de 50 millilitres et centrifugez.
Décantez le surnageant et remettez en suspension la pastille bactérienne dans 10 millilitres de PBS stérile. Vortex à nouveau le tube pendant 10 secondes. Choisissez la concentration expérimentale de l’inoculum et déterminez la DO correspondante à 600 nanomètres à l’aide de la courbe standard.
Ajouter un millilitre de la culture bactérienne remise en suspension dans neuf millilitres de PBS stérile et ajuster jusqu’à ce que le DO souhaité 600 nanomètres soit atteint. Montez une pointe d’angiocathéter stérile de calibre 24 sur une seringue de 100 microlitres. Remplissez la seringue avec la solution bactérienne préparée.
Placez un animal sur une surface de travail en position couchée et maintenez une anesthésie stable à l’isoflurane à l’aide d’un cône nasal pendant l’installation. Appliquez la pommade pour les yeux. Expulser l’urine résiduelle en appliquant une compression douce et en effectuant des mouvements circulaires sur la région sus-pubienne, puis nettoyer le bas-ventre avec de l’éthanol à 70%.
Lubrifiez l’extrémité du cathéter avec une solution saline normale. Placez l’index sur la main non dominante sur l’abdomen et poussez-le doucement vers le haut. Commencez le cathétérisme de l’urètre verticalement dans un angle de 90 degrés.
Une fois la résistance rencontrée, inclinez-la horizontalement avant de l’insérer davantage. Effectuer une installation lente de 50 microlitres de l’inoculum bactérien. Après l’installation, maintenez la seringue et le cathéter en place pendant quelques secondes de plus, puis rétractez-vous lentement pour éviter les fuites.
Utilisez un cathéter par groupe expérimental. Placez l’animal en position couchée dans le cône du nez pour le préparer à l’imagerie et préparez-le pour l’imagerie à l’aide d’un cathéter par groupe expérimental. Si nécessaire, administrer des antibiotiques ou des médicaments expérimentaux, comme mentionné dans le manuscrit du texte.
Ouvrez le logiciel d’acquisition BLI et cliquez sur Initialiser dans le dispositif d’imagerie pour tester la caméra et le système de contrôleur de scène et pour refroidir la caméra de l’appareil à couplage de charge à moins 90 degrés Celsius. Cliquez sur Acquisition, Enregistrement automatique vers.Sélectionnez Luminescence et Photographie. Vérifiez les paramètres luminescents par défaut en réglant le filtre d’excitation sur Bloquer et le filtre d’émission sur Ouvrir.
Réglez le temps d’exposition sur auto lors de la prise de la première image. Pour les mesures in vivo et les signaux lumineux, réglez le temps d’exposition à environ 30 secondes. Réduisez le temps d’exposition si un avertissement apparaît en raison d’une image saturée.
Sélectionnez le binning moyen, F/stop one, puis choisissez le champ de vision approprié. Réglez la hauteur du sujet sur un centimètre lors de l’imagerie de souris. Imagez jusqu’à cinq miles simultanément et séparez les animaux à l’aide du déflecteur de lumière pour empêcher la réflexion.
Fermez la porte et cliquez sur Acquérir pour démarrer la séquence d’imagerie, puis remplissez des informations détaillées sur l’expérience. Retirez les souris de la chambre d’imagerie et retournez-les dans leur cage. Vérifiez la récupération complète après l’anesthésie, puis retournez les cages dans les racks ventilés jusqu’au prochain cycle d’imagerie.
Démarrez le logiciel d’imagerie et chargez le fichier expérimental en cliquant sur Parcourir. Utilisez la palette d’outils pour ajuster l’échelle de couleurs de l’image. Utilisez les outils de retour sur investissement pour dessiner une région d’intérêt sur l’image, en vous assurant qu’elle est suffisamment grande pour couvrir toute la zone et en utilisant les mêmes dimensions pour toutes les images.
Cliquez ensuite sur Mesure du retour sur investissement pour quantifier l’intensité lumineuse. Des images ultérieures de souris obtenues immédiatement après l’installation ont montré qu’elles étaient solidement détectables au-dessus de 20 000 unités formant des colonies, et une corrélation linéaire entre les unités formant des colonies de l’inoculum et la bioluminescence in vivo a été établie. L’évolution naturelle d’une infection des voies urinaires a été étudiée dans un groupe témoin qui n’a reçu aucun traitement.
L’effet du traitement antibiotique sur la cinétique de l’infection a été visualisé en détail dans un groupe d’animaux traités aux antibiotiques. Une diminution immédiate de la charge bactérienne, mesurée par le flux total de photons, a été observée après la première dose d’enrofloxacine. Aucun des animaux traités n’a connu une augmentation ultérieure de la charge bactérienne.
La charge bactérienne globale de chaque animal a été calculée en utilisant l’aire sous la courbe du flux total de photons transformé logarithmique, montrant une différence significative entre les animaux traités avec De l’enrofloxacine et les animaux non traités sur une période de 10 jours. Ces résultats fournissent une preuve de concept que le BLI peut être utilisé pour évaluer les différences dans la cinétique de l’infection urinaire. L’imagerie par bioluminescence est une technique non invasive qui peut être combinée avec d’autres méthodes telles que la collecte régulière d’échantillons urinaires pour l’analyse bactérienne ou biochimique ou pour les expériences.
Ici, nous avons démontré que l’imagerie par bioluminescence est un outil puissant pour évaluer de nouvelles stratégies thérapeutiques sur l’évolution de la maladie des infections des voies urinaires.
