La lignée cellulaire O9-1 est un outil très utile pour étudier in vitro les cellules de crête neurale. Il a un grand potentiel d’utilisation dans un large éventail d’applications dans diverses utilisations de la recherche. Les cellules O9-1 ont des avantages évidents, tels qu’un accès facile, et l’obtention rapide de nombres cellulaires suffisants pour des expériences, ce qui en fait une méthode puissante complémentaire aux études in vitro des cellules de crête neurale.
Pour commencer, préparez les supports basaux pour la culture cellulaire O9-1, selon le protocole du texte. Filtrez ensuite le fond basal et enveloppez-le dans du papier d’aluminium pour le protéger de la lumière. Après cela, recueillir des supports basiques conditionnés à partir d’une cellule STO activée selon le protocole de texte.
Tout d’abord, décongeler un aliquot de matrice membranaire du sous-sol sur la glace pendant deux heures. Ensuite, diluer la matrice membranaire du sous-sol avec le DMEM stérilisé filtré avec 10%FBS à une concentration finale de 0,5 mg/ml. Enduire la plaque de la matrice membranaire du sous-sol à température ambiante pendant une heure.
Ensuite, aspirez la matrice membranaire du sous-sol tout en inclinant la plaque. Sécher les plaques à 30 degrés Celsius pendant 30 minutes. Lors de l’ajout de la matrice membranaire du sous-sol à la plaque, assurez-vous que la solution couvrait le puits uniformément pour maintenir les caractéristiques cellulaires et éviter les variations inutiles entre les expériences.
Récupérez les cellules O9-1 en plaçant un cryo-flacon dans un bain d’eau de 37 degrés Celsius. Faites pivoter lentement le flacon jusqu’à ce que la solution se transforme complètement en liquide. Après cela, transférez la solution cellulaire du cryo-flacon à un tube de centrifugeuse de 15ml.
Ajouter cinq volumes de DMEM avec 10%FBS au tube pour suspendre à nouveau les cellules. Centrifuger les cellules pendant trois minutes à 180 Gs.Then, aspirer le supernatent, en prenant soin de ne pas déranger la pastille. Ensuite, suspendez à nouveau la pastille dans des supports basaux conditionnés complétés par le FRV et le BFGF.
Ensemencer les cellules dans une plaque de six puits, et agiter la plaque pour ensemencer les cellules uniformément. Lorsque vous agitez la plaque, faites-le horizontalement et verticalement, car tourbillonner la plaque fera se concentrer les cellules vers le centre. Et permettre à ces cellules de s’attacher et de croître dans un incubateur standard de culture cellulaire pendant la nuit.
Assurez-vous que les cellules sont attachées avant de changer le média. Lorsque les cellules O9-1 atteignent 80 % de confluent, décongelent la matrice membranaire du sous-sol et préparent une plaque enduite de matrice membranaire du sous-sol comme décrit précédemment. Ajouter ensuite des supports basaux complétés par du LIF et du BFGF à la matrice membranaire.
Rincer délicatement les puits avec 2 ml de DPBS deux fois. Ensuite, dissocier les cellules avec 1ml de 0,05%trypsine EDTA à 37 degrés Celsius pendant trois minutes. Neutraliser la trypsine avec une quantité égale de DMEM avec 10%FBS en pipetting à plusieurs reprises le liquide sur toute la surface du puits.
Ensuite, transférez la solution cellulaire dans un tube de centrifugeuse. Et centrifugeuse pendant trois minutes à 180 Gs.Aspirate le supernatent sans déranger la pastille des cellules. Ensuite, resuspendez la pastille cellulaire en pippetting doucement les médias basaux conditionnés complétés avec LIF et BFGF.
Ensemencer les cellules à la plaque enduite comme décrit précédemment. Ensuite, laissez les cellules s’attacher et se développer dans un incubateur standard de culture cellulaire. Tout d’abord, préparer les supports de congélation 2X selon le protocole de texte.
Ensuite, filtrez-stérilisez les médias. Rincer les parois de la plaque avec DPBS deux fois, pipetting doucement pour éviter de perdre des cellules. Ensuite dissocier les cellules avec 0,05%trypsine EDTA à 37 degrés Celsius pendant trois minutes.
Neutraliser la trypsine avec une quantité égale de 10%FBS et DMEM. Transférer le contenu de la plaque dans un tube de centrifugeuse, et centrifugeuse pendant trois minutes à 180 Gs.Then, aspirer le supernatent et ajouter 2ml de PBS pour résuspendre la pastille. Centrifugeuse de la solution cellulaire une fois de plus et aspirer le supernatent.
Ajustez la quantité de supports basaux dans le tube au besoin et ajoutez une quantité égale de supports de congélation 2X. Ensuite, transférez les cellules sur les flacons cryo étiquetés. Placez les flacons cryo à l’intérieur d’une boîte en polystyrène avec un couvercle pour obtenir un taux de refroidissement lent à 80 degrés Celsius pendant au moins 24 heures.
Pour effectuer le knockdown SIRNA dans les cellules O9-1, récupérer et semer les cellules. Diluer les liposomes dans un volume approprié de médias sans sérum. Ensuite, diluer SIRNA dans des médias sans sérum selon le protocole du texte.
Après cela, ajouter le SIRNA dilué aux liposomes dilués, selon les instructions du fabricant. Mélanger la solution par pipetting, et incuber pendant cinq minutes à température ambiante. Ensuite, ajoutez un volume approprié de complexe lipidique SIRNA aux cellules.
Ensuite, incuber les cellules pendant 24 heures dans un incubateur standard de culture cellulaire. Les cellules O9-1 peuvent se différencier en différents types de cellules dans des conditions spécifiques de culture de différenciation. Pour différencier les cellules O9-1 en ostéoplastes, préparez des supports de différenciation ostéogénique selon le protocole du texte.
Enfin, détecter l’ostéocalcine marqueur ostéoplastique chez les ostéoplastes différenciés par coloration immuno. Différencier les cellules O9-1 en cellules musculaires lisses, les culture sous les supports de différenciation selon le protocole de texte, et évaluer la différenciation par la coloration immuno-actine lisse-muscle. Dans ce protocole, l’expérience knock out et knock down pour étudier la perte de fonction de Yap dans les cellules O9-1 ont été exécutées.
Dans des conditions de différenciation des cellules musculaires lisses, la plupart des cellules O9-1 de type sauvage ont donné lieu à des cellules musculaires lisses et lisses. Les cellules nulles de Yap n’ont toutefois généralement pas réussi à se différencier en cellules musculaires lisses positives de SMA. Ceci indique que Yap joue un rôle critique dans la différenciation des cellules de crête neurale en cellules lisses de muscle.
Tout en essayant cette procédure, il est important de se rappeler de manipuler la ligne de cellule O9-1 doucement et soigneusement pendant tout le processus. Assurez-vous de diluer et d’utiliser correctement la matrice de membrane basale, et utilisez de la trypsine à 0,05 % pour la dissociation cellulaire. N’oubliez pas que pendant la préparation à la culture cellulaire O9-1, travailler avec la mitomycine c peut être extrêmement dangereux, et des précautions telles que le port d’un manteau de laboratoire et des gants doivent toujours être prises lors de l’exécution de cette procédure.
