Étude du développement de cellules dendritiques par knockdown de gènes médiés par l’ARN en épingle à cheveux court dans une lignée cellulaire hématopoïétique et progénitrice in vitro

Les cellules dendritiques, ou DC, sont des cellules immunitaires clés reliant le système immunitaire inné et adaptatif. Bien que les DC soient hétérogènes, cette méthode nous aide à comprendre quels gènes, y compris les facteurs de transcription, peuvent réguler le développement des DC. Cette technique fournit un moyen simple et rapide d’identifier un gène qui contrôle le développement dc à partir de leur progéniteur in vitro.

Pour commencer, maintenez les cellules souches et progénitrices hématopoïétiques immortalisées ou iHSPC dans un milieu RPMI 1640 complet, complété par 100 nanogrammes par millilitre du ligand FLT3 et un bêta-estradiol micromolaire. Pour la transduction lentivirale, plaquer les iHSPC dans 12 plaques de puits à une densité d’une fois 10 à la cinquième cellule par puits et un millilitre de milieu complet contenant le ligand FLT3, le bêta-estradiol et le polybrene. Ensuite, ajoutez le lentivirus portant l’ARN court en épingle à cheveux dans chaque puits à une multiplicité d’infection de 100.

Ensuite, faites tourner la plaque à 1100 fois g et 37 degrés Celsius pendant 90 minutes, puis incubez les cellules infectées pendant la nuit à 37 degrés Celsius. Le lendemain, prélever le polybrene en recueillant les cellules dans des tubes de 15 millilitres en centrifugation, après avoir remplacé le milieu par un milieu frais complet contenant le ligand FLT3 et le bêta-estradiol. Après 24 heures supplémentaires, ajoutez six microgrammes par millilitre de puromycine au milieu pour sélectionner les cellules infectées.

Remplacez le milieu de sélection tous les trois jours et maintenez les cellules pendant au moins une semaine pour étendre les iHSPC transductés de manière stable. Générez et maintenez des iHSPC stables pour LacZ, Tcf4 et Id2 dans un milieu complet complété par le ligand FLT3 et le bêta-estradiol. Pour initier la différenciation in vitro, collectez les iHSPC indifférenciés dans des tubes de 15 millilitres et abattez les cellules par centrifugation.

Après centrifugation, jeter le surnageant et laver les cellules deux fois avec 10 millilitres de PBS. Après le deuxième lavage, remettez en suspension les cellules dans un milieu complet contenant uniquement le ligand FLT3, puis ensemencez-les à une densité de deux fois 10 à la cinquième vente par millilitre dans une plaque de 12 puits. Après trois jours, ajouter un millilitre de milieu frais complet contenant le ligand FLT3.

Après deux jours supplémentaires, procédez à l’analyse des cellules différenciées par cytométrie en flux. Pour l’analyse cytométrique en flux, pipettez les cellules de haut en bas deux à trois fois dans la plaque, puis collectez les cellules dans des tubes de 1,5 millilitre. Centrifugez les tubes et jetez le surnageant avant de réutiliser les cellules dans 50 microlitres de tampon de fax.

Ensuite, ajoutez 50 microlitres d’anti-CD16 par 32 surnageants d’hybridome et incubez pendant cinq à 10 minutes sur de la glace. Ensuite, ajoutez des anticorps conjugués à des colorants fluorescents directement dans les cellules et incubez pendant 15 minutes sur de la glace dans l’obscurité. Après l’incubation, lavez les cellules avec un millilitre de tampon de télécopie et centrifugez l’échantillon.

Après centrifugation, remettre les cellules en suspension dans 100 microlitres de tampon fax et analyser les échantillons par cytométrie en flux. Après une courte chute de LacZ, Tcf4 et Id2 par l’ARN en épingle à cheveux dans iHSPCS, la confirmation de l’efficacité de l’élimination par RTQ-PCR a montré que l’expression des iHSPC knockdown Tcf4 et Tcf4 était réduite par rapport à celle des iHSPC knockdown LacZ. Des résultats similaires ont été observés pour l’expression d’Id2 dans les iHSPC Knockdown Id2.

Après avoir cultivé lacZ knockdown iHSPC pendant cinq jours, la fréquence des cellules CD11c positives, qui représentent la population de cellules dendritiques, était d’environ 95%Cependant, l’élimination de Tcf4 ou Id2 a légèrement diminué la génération de cellules dendritiques CD11c positives. Une analyse plus approfondie des cellules dendritiques CD11c positives dérivées des iHSPC Knockdown lacZ a révélé que 70% étaient des cellules dendritiques conventionnelles tandis que 22% étaient des cellules dendritiques plasmacytoïdes. Les iHSPC knockdown Tcf4 ont généré un pourcentage significativement plus faible de cellules dendritiques plasmocytoïdes contrôlées par le Knockdown LacZ.

En revanche, les iHSPC Knockdown Id2 ont généré un pourcentage significativement plus faible de cellules dendritiques conventionnelles que les témoins LacZ knockdown, mais un pourcentage plus élevé de cellules dendritiques plasmacytoïdes. Les infections par spin augmentent l’efficacité de transduction de l’ARNh porteur de lentivirus dans les iHSPC. Cette technique aborde le rôle des facteurs de transcription et facilite l’étude d’autres gènes dans la transduction ou le métabolisme de la signalisation des cytokines, qui sont susceptibles d’être impliqués dans le développement des DC.