Ce protocole est utile pour effectuer des manipulations génétiques sur des bactéries symbiotiques, dans ce cas, en particulier sur Burkholderia, et identifier les gènes essentiels à la colonisation d’un insecte hôte. Le séquençage d’insertion de transposons est un outil puissant pour identifier simultanément un grand nombre de gènes conditionnellement essentiels dans une seule expérience. Commencez par inoculer une nouvelle culture de donneur d’E. coli dans 10 millilitres de milieu LB complété par de la kanamycine et du DAP sous une hotte stérile.
Cellules receveuses inoculées de burkholderia glaïe A dans cinq millilitres de milieu KB. Incuber les cultures à 30 degrés Celsius pendant la nuit sur un shaker à 250 RPM. Après une croissance nocturne, centrifuger quatre millilitres de chacune des cultures à 9 600 fois G pendant six minutes pour granuler les cellules et éliminer le surnageant.
Sous une hotte stérile, laver les cultures cellulaires en granulés dans un milieu KB contenant du DAP. Et enfin, resuspendez les cultures séparément en quatre millilitres de KB plus DAP medium. Dans un tube frais de 15 millilitres, mélanger 250 microlitres de cellules donneuses d’E. coli lavées avec un millilitre de cellules receveuses de glaïelet Burkholderia lavées.
Repérez 10 microlitres de ce mélange de cellules de conjugaison sur des plaques de gélose KB contenant du DAP. Laissez la plaque reposer sans être dérangée dans la hotte stérile à température ambiante pendant une heure. Incuber les plaques avec les taches de conjugaison à 30 degrés Celsius pendant 12 à 18 heures.
Après l’incubation, ajoutez deux à quatre millilitres de 1X PBS sur les plaques sous une hotte stérile et utilisez un grattoir cellulaire pour libérer les points de conjugaison bactérienne cultivés de la gélose. Ensuite, pipetez le mélange de cellules conjuguées dans deux tubes de microfuge millilitres. Ar coupez les cellules en les centrifugant à 9 600 fois G pendant deux minutes.
Jetez le surnageant et lavez la pastille deux fois dans un millilitre de 1X PBS en pipetant de haut en bas. Resuspendez la pastille finale en 1 200 microlitres de 1X PBS. Bien mélanger et étaler 100 microlitres du mélange cellulaire sur de grandes plaques de gélose KB complétées par de la kanamycine et incuber à 30 degrés Celsius pendant la nuit.
Compter le nombre total de colonies transconjugantes sur les trois plaques et extrapoler pour calculer le nombre approximatif de mutants obtenus dans toutes les plaques. Pour augmenter les chances d’obtenir une bibliothèque représentative, assurez-vous que le nombre total de colonies est plusieurs fois plus élevé que le nombre total de gènes dans le génome. Pour confirmer le succès de la conjugaison, effectuez une PCR ciblant la cassette d’insertion en utilisant 10 à 20 colonies d’échantillons comme décrit dans le manuscrit.
Sous une hotte stérile, grattez les colonies des plaques en ajoutant un à deux millilitres de PBS 1X sur la gélose. Regrouper le mélange de cellules gratté des plaques dans des tubes de 50 millilitres. Vortex la bibliothèque pour bien mélanger, puis diviser un millilitre de la bibliothèque mutante regroupée en plusieurs tubes cryogéniques.
Ajouter un millilitre de glycérol à 70% aux tubes et conserver à moins 80 degrés Celsius. Sélectionnez une couvée d’œufs L.villosa et comptez le nombre d’œufs qui continuent si la couvée contient plus de 100 œufs. Pour stériliser toute la couvée, ajoutez 200 microlitres d’éthanol à 70% et lavez doucement les œufs pendant cinq minutes, puis retirez l’éthanol et lavez les œufs deux fois avec de l’eau autoclavée.
Ajouter 200 microlitres d’eau de Javel à 12% et laver doucement les œufs pendant 30 secondes. Retirez immédiatement l’eau de Javel et lavez à nouveau les œufs trois fois avec 200 microlitres d’eau autoclavée. Infecter les œufs dans la couvée stérilisée en utilisant deux fois 10 à six cellules par microlitre de la bibliothèque mutante lavée dans PBS.
Deux jours après l’éclosion des larves de coléoptères infectées, recueillir 100 larves d’instar de seconde par tube de microfuge de 1,5 millilitre et les conserver à moins 80 degrés Celsius. Pour générer la bibliothèque de contrôle in vitro, inoculer 250 microlitres de deux fois 10 aux six cellules par microlitre de la bibliothèque mutante dans 10 millilitres de milieu KB contenant de la kanamycine. Après avoir extrait l’ADN des bibliothèques de mutants cultivées in vivo et in vitro, partagez l’ADN avec un ultrasonateur.
Pour vérifier si l’ADN a été cisaillé à la plage de taille souhaitée, chargez cinq microlitres de l’ADN non cisaillement et cisaillé après mélange avec un colorant à chargement de gel dans un rapport de un pour un sur un gel d’agarose à 1,6% à 250 volts pendant 40 minutes. Pour préparer les extrémités de fragment nécessaires à la ligature de l’adaptateur, commencez par ajouter trois microlitres du mélange enzymatique et sept microlitres de tampon de réaction à 50 microlitres de l’ADN cisaillé et mélangez bien par pipetage. Réglez un thermocycleur avec un couvercle chauffé à plus ou égal à 75 degrés Celsius et incubez les échantillons pendant 30 minutes à 20 degrés Celsius et 30 minutes à 65 degrés Celsius, puis maintenez la température à quatre degrés Celsius.
Pour la ligature de l’adaptateur, ajoutez 30 microlitres de mélange maître de ligature, un microlitre d’amplificateur de ligature et 2,5 microlitres d’adaptateur dilué aux produits de l’étape de préparation finale. Bien mélanger en pipetant et incuber l’échantillon pendant 15 minutes à 20 degrés Celsius dans le thermocycleur avec le couvercle chauffé enlevé. Après 15 minutes, ajoutez trois microlitres de l’enzyme.
Bien mélanger en pipetant et incuber l’échantillon pendant 15 minutes à 37 degrés Celsius dans un thermocycleur avec le couvercle chauffé à plus ou égal à 47 degrés Celsius. Pour sélectionner la taille de l’ADN ligaturé de l’adaptateur ciblant des fragments de 250 paires de bases, commencez par vortexer la solution de billes magnétiques et placez-la à température ambiante pendant 30 minutes avant utilisation. Ajouter 0,3 fois de perles à 96,5 microlitres du mélange d’ADN ligaturé et mélanger en pipetant soigneusement.
Incuber le mélange de perles pendant cinq minutes. Placez les tubes sur un support magnétique pour tirer les perles vers le bas et enlever les fragments d’ADN de taille indésirable. Laissez les perles se déposer pendant cinq minutes, puis transférez le surnageant clair dans un nouveau tube de microfuge.
Ajouter 0,15 fois de perles fraîches au surnageant et mélanger en faisant bien pipeter. Incuber le mélange de billes pendant cinq minutes, puis placer les tubes sur un support magnétique pour tirer vers le bas les perles liées à l’ADN cible. Attendez cinq minutes, puis jetez le surnageant en gardant les perles.
Avec les perles sur le support magnétique, ajoutez 200 microlitres d’éthanol à 80% fraîchement préparé et attendez 30 secondes avant de jeter l’éthanol sans déranger les perles. Retirez les tubes du support et ajoutez 17 microlitres de 0,1X TE ou Low TE, puis mélangez en pipetant 10 fois et incubez le mélange à température ambiante pendant deux minutes. Placez le tube sur le support magnétique et prenez 15 microlitres de l’ADN de taille sélectionnée pour la PCR-1.
Vortex de perles de streptavidine et placez-les à température ambiante pendant au moins 30 minutes. Prenez 32 microlitres de perles et lavez-les avec 500 microlitres de 1X liant et tampon de lavage. Ajouter 32 microlitres de tampon de liaison et de lavage 2X et resuspender les perles.
À cela, ajoutez 32 microlitres des produits PCR-1 nettoyés. Bien mélanger et incuber à température ambiante pendant 30 minutes. Placez le mélange d’ADN de perle sur un support magnétique pendant deux minutes.
Pipettez le surnageant car l’ADN marqué à la biotine contenant le bord d’insertion se lie à la streptavidine sur les perles. Lavez les perles avec 500 microlitres de liant 1X et tampon de lavage, puis lavez les perles avec 200 microlitres de Low TE. Ressuspendez les billes liées à l’ADN dans 17 microlitres de Low TE. L’ADN des bibliothèques de mutants in vivo et in vitro extraits et fragmentés dans un ultrasonateur a montré que la majorité des fragments s’étendent entre 100 et 400 paires de bases. L’emplacement des insertions médiées par transposon à travers les quatre replicons du génome A de burkholderia gladioli peut être observé dans la gousse.
Un résumé de la sortie de séquençage et du nombre d’insertions uniques et de gènes touchés dans les trois bibliothèques répliquées in vivo et in vitro peut être observé dans le tableau. La chose importante à retenir est de calculer la taille du goulot d’étranglement de la population pendant la colonisation de l’hôte pour obtenir une représentation appropriée de la bibliothèque pendant l’infection. En outre, ajustez pour un nombre compatible de générations bactériennes in vitro et dans l’hôte.
Après avoir généré la bibliothèque de mutants transposon, elle peut être filtrée sur des supports sélectifs pour récupérer les mutants en fonction des différences phénotypiques. Des gènes spécifiques importants pour une condition peuvent ainsi être identifiés.
