Le protocole illustre comment effectuer une microscopie in vivo à trois photons des tissus profonds dans le cerveau de souris et le poisson-zèbre adulte. Deux systèmes modèles importants dans les sciences de la vie. La microscopie à trois photons à longue longueur d’onde permet l’imagerie in vivo à haute résolution spatiale de tissus ou d’organes intacts à des profondeurs inaccessibles par la microscopie à deux photons.
Cette technique peut nous aider à comprendre les mécanismes sous-jacents des maladies neurologiques, telles que la maladie d’Alzheimer et l’autisme, où une compréhension complète de la façon dont la maladie affecte le cerveau fait défaut. Kibaek Choe, le chercheur postdoctoral de notre laboratoire, fera la démonstration de la procédure d’imagerie cérébrale du poisson-zèbre et la procédure d’imagerie cérébrale du poisson-zèbre sera Représentée par Kristine Kolkman, associée de recherche du laboratoire de recherche Fetcho. Pour commencer, allumez le laser et réglez la longueur d’onde centrale de la sortie de ralenti de l’amplificateur paramétrique optique non collinéaire à 1, 300 ou 1 700 nanomètres, puis placez des compresseurs d’impulsions sur le chemin de la lumière pour pré-gazouiller le laser femtoseconde et optimiser la durée de l’impulsion pour l’imagerie à trois photons.
Réglez l’angle entre la plaque de silicium et le chemin laser à l’angle de Brewster pour maximiser la transmittance laser, puis faites pivoter la plaque de silicium pour atteindre l’angle de Brewster en minimisant la réflexion. Ensuite, placez des miroirs à nageoires pour basculer facilement entre les lignes de faisceau de 1 300 et 1 700 nanomètres. Placez une demi-plaque d’onde montée sur un étage de rotation et un séparateur de faisceau polarisant pour contrôler l’intensité du laser, puis placez un bloqueur de faisceau dans le chemin de réflexion du séparateur de faisceau.
Préparez une boîte de Petri avec 0,5 centimètre de gélose à point de fusion élevé de 2%. Une fois que la gélose a refroidi et solidifié, coupez un trou rectangulaire dans la gélose plus long et légèrement plus large que le poisson. À l’aide de cire, fixez un tube mince à la boîte de Petri avec une extrémité dans le rectangle et un tube de plus grand diamètre au bord de la boîte de Pétri.
Ensuite, anesthésiez le poisson en le plaçant dans une solution de tricaïne de 0,2 milligramme par millilitre, puis placez le poisson anesthésié sur le côté sur une éponge humide, puis à l’aide d’un microsyringe, injectez rétro-orbitalement 3 microlitres de bromure de pancuronium pour paralyser le poisson et placez-le brièvement dans la solution de Hank pour vous assurer qu’il est complètement paralysé. Ensuite, placez le poisson dorsal dans la boîte de Pétri avec la tête vers le tube, puis à l’aide d’une pince, ouvrez doucement la bouche du poisson et faites glisser le tube dans la bouche. Faites glisser doucement le poisson vers le tube afin que le tube soit à l’arrière de la bouche du poisson.
Rapidement, mais doucement, séchez la gélose autour du poisson et retirez l’eau sur le dessus du poisson. Trempez un petit morceau de tissu de laboratoire dans de la colle de laboratoire et placez le tissu sur la gélose des deux côtés du poisson et sur le caudale arrière du poisson jusqu’aux branchies. Ensuite, anesthésiez la peau du poisson en plaçant une petite goutte de bupivacaïne directement sur la surface de la tête, puis apportez la boîte de Pétri avec le poisson au microscope.
Remplissez le plat avec de l’eau de l’installation de pêche et connectez-le au tube à une pompe à eau pour pomper l’eau du système dans la bouche du poisson. Assurez-vous que l’eau est oxygénée avec un barboteur et chauffée à 30 degrés Celsius avec un chauffe-aquarium. Pour l’imagerie, placez un objectif à faible grossissement sur le microscope à trois photons, puis placez la boîte de Petri contenant le poisson et les tubes sous le microscope et utilisez une source de lumière LED pour éclairer la boîte de Pétri.
À partir du logiciel d’acquisition d’images, ouvrez le mode Appareil photo, cliquez sur Live, choisissez le canal A sur le côté droit de l’écran et ajustez les paramètres de l’histogramme pour voir clairement l’image. Après avoir réglé le réglage du moteur sur le contrôleur du moteur sur la base, abaissez l’objectif jusqu’à ce que le poisson soit visible. Placez le centre de la tête du poisson au centre du champ de vision, puis déplacez l’objectif vers le haut et loin de la tête du poisson.
Remplacez l’objectif à faible grossissement par l’objectif à haute ouverture numérique pour l’imagerie à trois photons, puis rapprochez-le de la tête du poisson. Définissez les valeurs d’axe de tous les moteurs sur zéro. Abaissez lentement la lentille de l’objectif, en veillant à ce que l’objectif n’entre pas en contact physique avec la tête.
Dans le logiciel de la caméra CCD, arrêtez de déplacer l’objectif lorsque le haut de la tête est visible et réglez les emplacements X, Y et Z à zéro. Éteignez la source de lumière LED et fermez le rideau sombre autour du système, puis réglez le logiciel d’acquisition d’imagerie sur le mode multiphoton GG pour l’imagerie à trois photons et réglez la puissance sous l’objectif à moins d’un milliwatt. Cliquez sur le bouton Live dans le logiciel d’acquisition d’images.
Ouvrez les canaux PMT et ajustez le gain PMT et le niveau d’arrière-plan selon vos besoins. Remontez lentement la lentille de l’objectif pour localiser la surface de la tête en surveillant le canal THG des gros vaisseaux sanguins et de la surface vitrée de la fenêtre. Après avoir déplacé la lentille de l’objectif près de la fenêtre, appliquez de l’eau entre l’objectif et la fenêtre crânienne, puis réglez les valeurs d’axe de tous les moteurs à zéro.
Cliquez sur le bouton Live dans le logiciel d’acquisition d’images. Ouvrez les canaux PMT et ajustez le gain PMT et le niveau de fond au besoin, puis remontez lentement la lentille de l’objectif pour localiser la surface du glissement du couvercle en surveillant le canal THG des gros vaisseaux sanguins et de la surface vitrée. Ajustez l’orientation de la fenêtre si nécessaire, puis mettez à zéro les moteurs pour définir la surface du cerveau.
Effectuez une imagerie et ajustez le niveau de puissance en fonction de la profondeur d’imagerie. L’imagerie à haute résolution, non invasive et profonde des neurones génétiquement marqués dans le cerveau du poisson-zèbre adulte est réalisée à l’aide de la microscopie à trois photons. La distribution des couches cellulaires dans le tectum optique et le cervelet peut également être observée.
La fonction de caméra du microscope a été utilisée pour localiser le poisson. Le crâne est vu dans le canal THG, qui aide à naviguer dans le cerveau et à trouver la surface supérieure. Les neurones se distinguent par un rapport signal/arrière-plan élevé profondément dans le cerveau adulte.
Des images multicolores à trois photons de neurones marqués GCaMP6s et de vaisseaux sanguins marqués Texas Red ainsi que des signaux THG dans le cerveau de souris adultes sont montrées ici. Grâce à l’optimisation de la configuration, des images à contraste élevé ont été obtenues avec succès jusqu’à 1,2 millimètre de la surface du cerveau dans la région de l’hippocampe CA1. Les traces d’activité calcique des neurones marqués GCaMP6s à une profondeur de 750 micromètres pour une session d’enregistrement de 10 minutes ont montré une haute fidélité d’enregistrement.
Cette configuration peut aider à visualiser l’activité neuronale pour comprendre le fonctionnement du cerveau. Il peut également être utilisé pour suivre le mouvement des cellules dans les tissus biologiques afin de comprendre divers systèmes biologiques. De plus, la vitesse du flux sanguin peut également être mesurée pour surveiller la santé de l’animal.
