La chirurgie ventilée d’ischémie-reperfusion pulmonaire peut être utilisée pour étudier la physiopathologie spécifique du poumon de multiples processus, y compris la transplantation pulmonaire, l’embolie pulmonaire et les lésions pulmonaires à la suite d’un traumatisme hémorragique avec réanimation. Ce modèle minimise les contributions inflammatoires de l’atélectasie, de la ventilation mécanique et de l’hypoxie. Il maintient un système immunitaire circulatoire in vivo intact et permet des études à plus long terme.
Ce modèle pourrait donner un aperçu de la façon dont l’inflammation stérile est contrôlée et régulée dans les poumons. La technique microchirurgicale nécessite d’abord des heures de pratique. Une organisation et une planification minutieuses sont importantes avant de commencer.
En outre, il peut être initialement pratiqué par la souris euthanasiée sans la distraction de l’activité cardiaque et du mouvement qu’elle provoque. La stase sanguine dans la sonorisation gauche lui permet d’être plus facilement visualisée et manipulée. Pour commencer, placez délicatement la lumière flexible à fibre optique sur la trachée d’une souris anesthésiée, légèrement en dessous des cordes vocales.
Ajustez les niveaux d’éclairage de manière à ce que seul un champ sombre soit visible lorsque vous regardez dans le pharynx oral de la souris, à l’exception de la lumière rouge émanant de dessous les cordes vocales. Pour l’intubation, tenez la pince à épiler avec la main dominante et utilisez-les pour saisir doucement et tirer la langue hors de la cavité buccale. Ouvrez la mâchoire inférieure à l’aide d’une pince tenue par la main non dominante et poussez la pince dans le larynx pour soulever l’épiglotte.
À ce stade, libérez la langue de la pince à épiler. Observez les cordes vocales. Ils doivent s’ouvrir et se fermer en fonction de chaque respiration.
En tenant la canule avec le fil guide préchargé, insérez la pointe du fil à travers les cordes vocales. Ensuite, en faisant très attention à ne pas déplacer le fil en tenant une partie de celui-ci qui se trouve à l’extérieur de la canule mais juste au-dessus des cordes vocales, retirez la canule, en laissant juste le fil en place avec son extrémité distale dans la trachée. À ce stade, effectuez une deuxième visualisation des cordes vocales pour confirmer que l’extrémité distale du fil reste passée à travers les cordes vocales éclairées et dans la trachée, et n’est pas dans l’œsophage non éclairé.
Ensuite, tenez le fil à l’extérieur de la bouche avec les pinces incurvées de la main gauche stabilisées contre une surface dure et avancez prudemment le cathéter de calibre 20 avec des ailes de ruban adhésif sur le fil. Une fois que l’extrémité distale du fil émerge de l’extrémité arrière du cathéter ou du tube endotrachéal, tenez cette extrémité avec la pince incurvée et avancez doucement le cathéter dans la trachée. Ensuite, retirez soigneusement le fil de l’extrémité distale du cathéter avec la pince incurvée sans déloger l’emplacement du cathéter.
Ensuite, connectez brièvement le cathéter au ventilateur avant de le fixer pour confirmer le placement approprié dans la trachée et non dans l’œsophage. Confirmer la mise en place trachéale par l’observation des mouvements bilatéraux de la paroi thoracique dépendants de la ventilation mécanique et de l’absence de gonflage de l’estomac. Après l’intubation, connectez le cathéter au ventilateur réglé à un volume de titre de 0,2 à 0,225 millilitre et à une fréquence respiratoire de 120 à 150 respirations par minute pour confirmer le placement trachéal correct du tube orotrachéal.
Ensuite, déconnectez-vous avec la souris respirant spontanément à travers le tube orotrachéal. Rasez les poils de souris sur la région gauche du thorax jusqu’à l’omoplate gauche. Enlevez l’excès de poils rasés à l’aide de tampons imbibés d’alcool et désinfectez la zone chirurgicale.
Ensuite, placez la souris sur un coussin chauffant en position latérale gauche ou aux trois quarts tournés. Connectez le tube trachéal au ventilateur. Après avoir pratiqué l’incision cutanée, insérez trois rétracteurs stérilisés sous la couche musculaire.
Ensuite, identifiez le deuxième espace intercostal et tenez la deuxième côte avec la pince extra fine. Ensuite, en tirant la côte vers le haut, utilisez une lame de scalpel incurvée numéro 12 stérile pour entrer dans l’espace pluriel en séparant et en coupant les muscles intercostaux du deuxième au troisième espace. Envisagez de suspendre la ventilation pour réduire les blessures à l’apex du poumon gauche.
Utilisez le céphalade rétracteur le plus petit et le plus étroit le long de l’orientation des nervures, et le rétracteur de taille moyenne à gauche le long de la troisième côte, et le plus grand rétracteur à droite le long de la surface de la deuxième côte. Ouvrez la poitrine avec une rétraction lente et progressive à l’aide des cordons élastiques. Exposez et identifiez l’artère pulmonaire gauche, ou AP, en éloignant l’apex du poumon gauche à l’aide d’un coton-tige stérile ou d’une éponge chirurgicale.
Utilisez les micro forceps ultra fins dans la main droite et les pinces PA ou dilatatrices vasculaires dans la main gauche pour exposer doucement et créer le champ dans lequel le PA gauche et la bronche sont tous deux visibles. À l’aide de la pince PA, prenez la sonde gauche et tirez doucement mais fermement vers le haut et céphalade pour visualiser la bronche transparente ci-dessous. Augmentez le grossissement du microscope à dissection à quatre X.Tout en rétractant le PA loin de la bronche, passez soigneusement la pince ultra fine fermée à travers l’espace entre le PA gauche et la bronche.
Ensuite, utilisez ces forceps pour tenir et tirer un 7-0 ou 8-0 suture prolène à travers l’espace entre l’artère pulmonaire gauche au-dessus et la bronche en dessous. Ensuite, encerclez le PA gauche en nouant un nœud glissant pour créer une occlusion dans le PA. L’interruption du flux sanguin est facilement visualisée à ce stade, marquant l’initiation de la période ischémique. Externalisez l’extrémité libre du nœud à travers un point d’entrée différent dans le thorax gauche antérieur à l’aide d’une aiguille de calibre 24 à 28 et fixez l’extrémité de la suture avec un petit morceau de ruban adhésif pour une identification plus facile plus tard.
Ensuite, à l’aide d’une soupape de pression positive et expiratoire ou d’un tube sur le ventilateur pour rongeurs, regonflez le poumon pour expulser autant d’air que possible de la cavité thoracique. Ensuite, fermez la cage thoracique avec deux sutures en nylon 4-0 interrompues, suivies de la fermeture de la couche musculaire et cutanée et de l’application d’une anesthésie locale. Déconnectez la souris du ventilateur et placez-la soigneusement sur le coussin chauffant pour les soins postopératoires afin de maintenir la température corporelle pendant la récupération.
Assurez-vous que le nœud glissant externalisé est contrôlé et visualisé clairement pendant le mouvement de la souris. Tirez doucement le nœud glissant externalisé à la fin de la période ischémique. L’histologie des coupes pulmonaires chez les souris de type sauvage des souches C3H et C57 black six est présentée ici.
Après une ischémie d’une heure et une reperfusion de trois heures, une infiltration intense des neutrophiles dans le tissu gauche du poumon a été observée dans les deux souches. Cependant, la souche C3H a montré des niveaux d’inflammation nettement plus élevés par rapport au C57 black six. Des erreurs lors du passage du monofilament entre l’AP gauche et la bronche gauche peuvent entraîner une intervention chirurgicale non récupérée avec saignement catastrophique de l’AP gauche ou une blessure irréversible à la bronche gauche.
C’est l’étape qui est la plus difficile techniquement et nécessite une pratique répétée lors de l’apprentissage de cette procédure. Après la récupération de souris de la chirurgie d’ischémie-reperfusion pulmonaire environ une heure ou moins après la reperfusion, une instillation intratrachéale de bactéries vivantes peut être administrée trois heures ou 24 à 48 heures plus tard pour simuler une infection qui suit une lésion pulmonaire stérile causée par l’ischémie-reperfusion. L’installation intratrachéale d’autres agents pouvant moduler l’inflammation stérile peut également être effectuée de manière similaire après ischémie-reperfusion.
Cette technique a permis de découvrir et de confirmer le trafic et l’activation progressifs des neutrophiles en réponse à une blessure stérile et à une infection pulmonaire.
