Une accumulation élevée de fer dans le cerveau dans le BPAN est causée par un dysfonctionnement de la protéine d’autophagie. Mais les mécanismes moléculaires sous-jacents sont inconnus. Ce protocole fournit une évaluation de la dégradation de la ferritine lysosomale, comme la ferritinophagie.
Cette technique offre la méthode d’analyse quantitative, basée sur l’image, pour mesurer la dégradation de la ferritine lysosomale dans des cellules uniques. De manière pratique, l’approche multiplex peut être étendue en incluant des anticorps ou des colorants appropriés pour mesurer des paramètres cellulaires supplémentaires. Cette méthode permet d’identifier et de différencier les voies dépendantes et indépendantes de l’autophagie pour la dégradation de la ferritine lysosomale.
Il est important pour comprendre l’homéostasie du fer dysfonctionnelle dans le BPAN au niveau cellulaire. Notre doctorante, Carmen Pastor-Maldonado, fera la démonstration de la méthode d’analyse de la dégradation de la ferritine lysosomale, comme la ferritinophagie. Commencez l’auto-fixation en aspirant le milieu de traitement à partir des cellules de neurodégénérescence dérivées du patient, associées à la bêta-hélice, placées dans une plaque à fond de verre à 96 puits, et en les lavant deux fois avec la solution saline tamponnée au phosphate de Dulbecco, ou DPBS.
Ajoutez 100 microlitres de paraformaldéhyde à 3,7 %, ou PFA, par puits avant de fixer les cellules pendant 20 minutes à température ambiante dans l’obscurité. Après 20 minutes, retirez le PFA et lavez les cellules deux fois avec du PBST avant de bloquer les cellules du PBST contenant 1 % d’albumine sérique bovine, ou BSA, pendant une heure à quatre degrés Celsius. Ensuite, lavez les cellules deux fois avec du PBST avant d’appliquer 50 microlitres du mélange d’anticorps primaires préparé dans du PBST par puits.
Enveloppez les plaques de parafilm et incubez toute la nuit à quatre degrés Celsius. Le lendemain matin, préparez le mélange d’anticorps secondaires dans le PBST dans un rapport de un à 200. Après avoir lavé les cellules deux fois avec du PBST, appliquez 50 microlitres du mélange d’anticorps secondaires fraîchement préparé par puits.
Incuber les cellules à quatre degrés Celsius pendant une heure dans l’obscurité. Encore une fois, donnez deux lavages avec du PBST et ajoutez 100 microlitres de cinq microgrammes par microlitre de solution de 4'6-diamidino-2-phénylindole, ou DAPI, par puits et incubez la plaque. Donnez deux lavages PBS avant d’ajouter 50 microlitres de PBS dans chaque puits, puis incubez les plaques enveloppées à quatre degrés dans l’obscurité.
Pour l’imagerie automatisée des cellules, remplacez le PBS dans la plaque par 50 microlitres de PBS frais à température ambiante. Couvrez la plaque d’une feuille d’aluminium pour la transférer dans la salle de microscopie. Allumez le microscope confocal à balayage laser, placez un porte-échantillon pour les plaques à 96 puits sur la table du microscope et sélectionnez un objectif 40x.
Ajustez les paramètres d’imagerie en sélectionnant les lasers et les filtres dans Smart Setup, et en attribuant les pistes pour une qualité d’image et une vitesse optimales. Pour sélectionner le type d’expérience, cliquez sur Tuiles" pour activer l’option de sélection et enregistrer les positions XY déterminées sur la plaque. Dans le module « Configuration de l’imagerie », visualisez les voies d’acquisition, les pistes assignées et leurs longueurs d’onde d’excitation et d’émission.
Dans le module « Mode d’acquisition », sélectionnez Vitesse de balayage » comme six, Direction » comme bidirectionnelle, Moyenne » comme 2x et Bits par pixel » comme huit. Dans le module des canaux, ajustez la puissance laser, le sténopé et le gain principal pour chaque canal individuellement afin d’obtenir des images correctement exposées sans les sursaturer. Ensuite, cliquez sur le module Stratégie de mise au point et sélectionnez Combiner l’autofocus logiciel et la mise au point définitive.
Sous Couche de référence et décalages, sélectionnez la couche la plus stable et la plus lumineuse comme référence. Sous Répétitions et fréquence des événements de stabilisation, sélectionnez Standard. Dans le module Autofocus du logiciel, sélectionnez Mode"comme Intensité, Recherche"comme Intelligent, Echantillonnage"comme Fin » et Plage relative.
Ensuite, cliquez sur le module Tuiles. Sélectionnez des positions en tant que positions uniques. Sous Configuration avancée, naviguez dans la plaque, identifiez une position pour l’imagerie et cliquez sur le bouton sous l’onglet Configuration de la position.
Pour étiqueter chaque position avec des informations supplémentaires, ouvrez l’onglet « Propriétés » et cliquez sur l’icône de la roue à côté du menu déroulant des catégories, puis cliquez sur Nouveau"pour ouvrir une nouvelle boîte de dialogue pour entrer un nouveau nom de catégorie. Pour attribuer une catégorie à une certaine position, sélectionnez la position, cliquez sur l’onglet « Propriétés », allez dans le menu déroulant des catégories et sélectionnez l’étiquette correspondante. Sous Sample Carrier (Support d’échantillons), sélectionnez Multiwell 96 Cellvis glass bottom 0.
Cliquez sur Calibrer" pour calibrer le microscope à la surface de la plaque. Choisissez entre un étalonnage en un point ou en sept points en fonction des spécifications du système. Sous Options, sélectionnez un chevauchement de tuiles de 10 %Sous Déplacement dans les régions de mosaïque, sélectionnez Peigne » et cochez Utiliser la vitesse de l’étape à partir du contrôle de l’étape, Utiliser l’accélération de l’étape à partir du contrôle de l’étape » et Pyramide d’images lors de l’acquisition.
Une fois cela fait, exécutez l’acquisition d’images, enregistrez les résultats de l’image sous forme de fichier CZI et les métadonnées de l’image sous forme de fichiers CSV sur un disque dur portable. Exportez les images sous forme de fichiers TIF. Créez un fichier de feuille de calcul de métadonnées distinct pour l’analyse d’images à haut débit avec les colonnes position, well, condition, series et set.
Récupérez les données appropriées à partir du fichier de métadonnées d’origine provenant de la microscopie confocale à balayage laser et remplissez ces colonnes. Lancez CellProfiler 4.2.4 en double-cliquant et importez le pipeline CellProfiler par glisser-déposer. Avant d’adapter le pipeline CellProfiler, faites glisser et déposez des fichiers d’image CZI individuels, ou un dossier contenant plusieurs fichiers d’image CZI, dans le module d’image.
Dans le module NamesAndTypes, remplacez le code C1-C3 par un code qui permet au logiciel d’identifier et de trier les images monocanal à analyser. Pour optimiser les entrées numériques dans les modules, ajustez les paramètres de pipeline pour les modules IdentifyPrimaryObjects« et IdentifySecondaryObjects ». Pour suivre les ajustements, sélectionnez l’option du mode test en cliquant sur le bouton « Démarrer le mode de test », ou, alternativement, sur le bouton « Étape » entre les modules A.Cela se traduira par une fenêtre contextuelle montrant comment une image serait analysée avec ces paramètres.
Affinez les paramètres pour une reconnaissance optimale. Une fois le pipeline optimisé, terminez le mode test et exécutez l’analyse en activant le bouton Quitter le mode de test » avant de cliquer sur le bouton « Analyser les images ». Après l’analyse, vérifiez la précision de la détection des cellules et des points en comparant les images d’entrée avec les sorties de superposition générées par CellProfiler.
Si elles ne sont pas satisfaisantes, ajustez les valeurs numériques dans les différents modules jusqu’à ce que le résultat de l’analyse soit suffisamment précis. Cette technique a rendu possible la reconnaissance cellulaire par logiciel et la reconnaissance de la ferritine et de LAMP2. Lorsque la dégradation lysosomale de la ferritine a été bloquée par l’ajout de bafilomycine A1, la co-localisation de la ferritine endogène dans LAMP2 a augmenté.
L’augmentation était cohérente avec sa capacité à inhiber les enzymes lysosomales V-ATPase bloquant la ferritinophagie. Une immunocoloration de haute qualité est obligatoire pour analyser les images avec précision et automatiquement, il est donc conseillé de mener des expériences préliminaires pour tester des choses comme les dilutions d’anticorps et les densités cellulaires. Ce protocole peut être étendu pour effectuer des analyses corrélatives en microscopie optique et électronique.
Pour cela, des conclusions précises peuvent être tirées, mais le type de dégradation de la ferritine lysosomale, par exemple, via la ferritinophagie ou des voies indépendantes de l’autophagie. Ces stratégies sont testées pour déterminer si elles peuvent capturer le comportement cellulaire spécifique des cellules dérivées de patients BPAN, et la différence entre les cellules et les cellules où. N’est pas muté.
Cette méthode fait partie de ce développement.
