Nous remercions Bruce Fischl, du Massachusetts General Hospital, A.A. Martinos Center for Biomedical Imaging, Department of Radiology, d’avoir fourni les échantillons de cerveau humain analysés dans le cadre de cette étude. Ce projet a reçu un financement du programme-cadre de recherche et d’innovation Horizon 2020 de l’Union européenne dans le cadre de la convention de subvention n° 654148 (Laserlab-Europe), du programme-cadre Horizon 2020 de l’Union européenne pour la recherche et l’innovation dans le cadre de l’accord de subvention spécifique n° 785907 (Human Brain Project SGA2) et n° 945539 (Human Brain Project SGA3), du General Hospital Corporation Center des National Institutes of Health sous le numéro d’attribution U01 MH117023, et du ministère italien de l’Éducation dans le cadre de l’Euro-Bioimaging Italian Node (infrastructure de recherche ESFRI). Enfin, cette recherche a été réalisée avec la contribution de la « Fondazione CR Firenze ». Le contenu de ce travail relève de la seule responsabilité des auteurs et ne représente pas nécessairement les opinions officielles des National Institutes of Health. La figure 1 a été créée avec BioRender.com.

Des échantillons de tissus humains fixés au formol ont été fournis par le département de neuropathologie du service d’autopsie du Massachusetts General Hospital (MGH) (Boston, États-Unis). Le consentement écrit des participants en bonne santé a été obtenu avant leur décès, conformément aux protocoles de prélèvement de tissus approuvés par la CISR et établis par le Comité de biosécurité de l’établissement des partenaires (PIBC, protocole 2003P001937). Les documents d’autorisation sont conservés auprès des services d’autopsie de l’HGM à Boston, MA, États-Unis, et sont disponibles sur demande.
1. Enrobage d’agarose et découpe d’échantillons
<ol><li>Préparez une solution d’agarose à 4 % p/v dans une solution saline tamponnée au phosphate (PBS, pH 7,4) dans un bécher et insérez le bloc de tissu à l’intérieur. Attendez qu’il atteigne la température ambiante (RT), puis conservez-le à 4 °C pendant 24 h.</li>
	<li>Pour obtenir des coupes de haute précision, collez l’échantillon sur le disque d’échantillon du vibratome et remplissez le plateau avec 1x PBS froid (pH 7,4). Ajustez les paramètres du vibratome tels que la fréquence, l’amplitude et la vitesse en fonction du type de tissu à trancher (valeurs utilisées : fréquence = 5 (50 Hz) ; amplitude = 0,4 ; vitesse = 3 (0,15 mm/s). REMARQUE : Différents vibratomes doivent être utilisés en fonction du volume de l’échantillon. Pour les échantillons d’un volume maximal de 70 x 40 x 15 mm, un vibratome (par exemple, Leica VT1000 S) peut être utilisé ; pour les échantillons plus volumineux, il est possible d’utiliser un compresstome (par exemple, le microtome VF-900-0Z18) ou un appareil sur mesure21. Nous présentons ici des tranches découpées d’une épaisseur de 400 μm ou 500 μm.</li>
	<li>Après la coupe, mettez toutes les tranches dans une solution de conservation composée de 1x PBS (pH 7,4) avec 0,01% p/v d’azoture de sodium (NaN3) et conservez à 4 °C. REMARQUE : Avant d’enrober, attendez que la solution d’agarose atteigne 37 °C. Une température plus élevée pourrait endommager l’échantillon. Il est recommandé de ne pas laisser les échantillons dans la PFA pendant plus de 48 h car une fixation prolongée pourrait interférer avec la procédure de marquage en endommageant les antigènes et en augmentant l’autofluorescence des tissus. Pour le stockage à long terme des tissus humains, le PBS avec NaN3 est utilisé pour prévenir la contamination microbienne. En raison de la toxicité du NaN3, préparez la solution de conservateur sous une hotte chimique.</li>
</ol>2. Fixation tissulaire
REMARQUE : Toutes les solutions utilisées dans le protocole suivant sont préparées en grands volumes, suffisants pour traiter toutes les tranches d’un même bloc de tissu et minimiser la variabilité technique et réduire le temps pour les étapes individuelles.
<ol><li>Préparez la solution d’arrêt avec 50 % v/v 1x PBS pH 3, 25 % v/v 0,1 M d’acide chlorhydrique (HCl), 25 % v/v 0,1 M d’hydrogénophtalate de potassium (KHP) et du glutaraldéhyde frais 4 % v/v. Placez tous les échantillons dans des boîtes avec des couvercles à vis (70 x 23 mm) et incubez-les avec la solution Switch-off en agitant doucement à 4 °C pendant 1 jour, en les protégeant de la lumière avec du papier d’aluminium.</li>
	<li>Préparez la solution Switch-on avec 1x PBS (pH 7,4) et du glutaraldéhyde frais à 1% v/v. Placez tous les échantillons dans de nouvelles boîtes et incubez-les avec la solution Switch-on en agitant doucement à 4 °C pendant 1 jour, en les protégeant de la lumière avec du papier d’aluminium. REMARQUE : En raison de la toxicité élevée et de la sensibilité à la lumière du glutaraldéhyde, les solutions d’arrêt et d’allumage doivent toujours être préparées fraîches et conservées sous la hotte chimique sur de la glace. Remplissez toujours le plat avec 20 mL de chaque solution et scellez-le avec du parafilm.</li>
</ol>3. Inactivation et effacement
REMARQUE : Le glutaraldéhyde réactif dans les échantillons doit être inactivé par incubation avec une solution d’inactivation composée de 1x PBS pH 7,4, 4% p/v d’acétamide, 4% p/v de glycine, pH 9,0. La solution peut être conservée à 4 °C jusqu’à 3 mois. Pour éliminer les lipides et rendre le tissu transparent, nous utilisons la solution de clarification composée de 200 mM de dodécylsulfate de sodium (SDS), de 20 mM de sulfite de sodium (Na2SO3) et de 20 mM d’acide borique (H3BO3), pH 9,0. La solution doit être stockée à RT car le SDS précipite à 4 °C. Toutes les étapes suivantes seront effectuées dans des tubes remplis de la solution.
<ol><li>Déplacez les échantillons de la vaisselle vers les tubes et lavez-les pendant 3 x 2 h avec 1x PBS pH 7,4 à RT en agitant doucement. REMARQUE : Pour l’étape 3.1, il est nécessaire de travailler sous la hotte chimique en raison de la toxicité du glutaraldéhyde. L’acétamide, le SDS et l’acide borique sont également des réactifs toxiques et doivent être manipulés sous une hotte chimique. Remplissez toujours le tube avec 50 mL de chaque solution.</li>
	<li>Incuber les échantillons dans une solution d’inactivation à 37 °C au bain-marie pendant une nuit (o/n).</li>
	<li>Laver pendant 3 x 2 h dans 1x PBS pH 7,4 à RT en agitant doucement.</li>
	<li>Incuber les échantillons dans une solution claire à 55 °C au bain-marie pendant 3 à 7 jours. Changez la solution tous les 2 jours (tableau 1).</li>
</ol>4. Immunomarquage
REMARQUE : Avant l’étape de marquage, il est nécessaire d’enlever la FDS résiduelle, de réduire l’autofluorescence et de démasquer les épitopes avec une solution de récupération d’antigène composée de 10 mM de base Tris, 1 mM d’EDTA et 0,05 % v/v Tween 20, pH 9. Le pH de la solution de 9 est optimisé pour un processus de récupération efficace ; La base Tris agit comme un agent tampon pour maintenir un environnement de pH stable ; L’EDTA, qui est un agent chélateur, améliore l’accessibilité de l’antigène. Le détergent non ionique Tween 20 aide à améliorer la perméabilité des tissus. Cette solution peut être conservée à 4 °C. Il est important de noter que le peroxyde d’hydrogène combiné à l’étape de récupération de l’antigène ont un effet synergique dans la réduction du signal d’autofluorescence, en décomposant et/ou en modifiant les fluorophores endogènes responsables du signal de fond non spécifique (comme la lipofuscine).
<ol><li>Préparez 1x PBS avec 0,1% v/v Triton X-100 (PBST), préchauffez-le à 37 °C et lavez les échantillons 3 x 3 h pendant la journée en agitant doucement à 37 °C dans l’incubateur. Laissez le dernier lavage o/n. REMARQUE : Conserver la solution mère PBST à 4 °C. Il est crucial d’éliminer le SDS du tissu car il peut former des précipités insolubles à basse température qui peuvent interférer avec les processus d’acquisition ultérieurs.</li>
	<li>Le lendemain, ajoutez 10 mL de peroxyde d’hydrogène (H2O2) à 30 % v/v à chaque échantillon et laissez-le agiter doucement à RT pendant 45 min.</li>
	<li>Laver 3 x 10 min avec 1x PBS (pH 7,4) en agitant doucement à RT.</li>
	<li>Préchauffer la solution de récupération d’antigène à 95 °C au bain-marie ; transférer les échantillons dans la solution chauffée et les laisser à 95 °C pendant 10 min.</li>
	<li>Laisser refroidir les échantillons jusqu’à ce qu’ils soient RT pendant 40 minutes en agitant doucement.</li>
	<li>Laver 3 x 5 min avec de l’eau déminéralisée en agitant doucement.</li>
	<li>Équilibrer les échantillons dans du PBS à 4 °C pendant 15 min.</li>
	<li>Préparer une nouvelle solution d’anticorps à base de PBST avec 0,01 % p/v de NaN3 (voir la NOTE pour l’étape 1.3) et ajouter les anticorps primaires. Incuber les échantillons avec la solution dans des boîtes à couvercle à vis à 37 °C pendant n jours (1-7) dans un incubateur en agitant doucement et à l’abri de la lumière (tableau 2). REMARQUE : Le temps d’incubation dépend de la taille et de l’épaisseur (tableau 1 et tableau 2).</li>
	<li>Après n jours, déplacer les échantillons dans des tubes et laver 3 x 2 h avec du PBST préchauffé à 37 °C en agitant doucement dans l’incubateur.</li>
	<li>Ajouter des anticorps secondaires dans du PBST contenant 0,01 % p/v de NaN3 et incuber les échantillons dans de nouvelles boîtes avec des couvercles à vis à 37 °C pendant n jours (1-6) dans un incubateur en agitant doucement et à l’abri de la lumière (Tableaux 1 et 2).</li>
	<li>Après n jours, transférer les échantillons dans des tubes et les laver 3 x 3 h pendant la journée avec du PBST préchauffé à 37 °C dans un incubateur à agitation douce. Laissez le dernier lavage o/n. REMARQUE : Comme Triton X-100 et Tween 20 sont visqueux, pipetez lentement pour permettre à l’embout de se remplir. Remplissez toujours le tube avec 50 mL de chaque solution. Utilisez 10 mL de solutions d’anticorps pour chaque échantillon et scellez la boîte avec un parafilm pour empêcher l’évaporation de la solution. Étant donné que les solutions d’anticorps contiennent du NaN3, elles peuvent être stockées à 4 °C et réutilisées pour marquer de nouveaux échantillons dans un délai de 2 semaines.</li>
</ol>5. Correspondance de l’indice de réfraction
REMARQUE : Pour obtenir un haut niveau de transparence, il est nécessaire d’homogénéiser l’indice de réfraction tissulaire. Ici, nous utilisons du 2,2'-thiodiéthanol (TDE) dilué dans 1x PBS. Les solutions TDE doivent être stockées à RT.
<ol><li>Transférez les échantillons dans de nouveaux plats, ajoutez 30 % v/v de TDE et laissez-les pendant 4 h en agitant doucement à RT.</li>
	<li>Retirez la solution de TDE à 30 % v/v, ajoutez 68 % de TDE v/v aux échantillons et laissez-les en agitant doucement à RT. REMARQUE : Comme le TDE est visqueux, pipetez lentement pour permettre à l’embout de se remplir. L’inhalation de vapeur ou de brouillard de TDE peut irriter le système respiratoire. Par conséquent, il est conseillé de travailler dans un endroit bien ventilé ou d’utiliser des hottes pour minimiser l’exposition. Les solutions de TDE doivent être entreposées à RT. Utiliser 10 mL de solutions de TDE pour chaque échantillon.</li>
</ol>6. Montage de l’échantillon
REMARQUE : Pour faciliter le montage de l’échantillon et l’acquisition d’images LSFM, nous utilisons un porte-échantillon scellé sur mesure (appelé « sandwich »), qui se compose de trois parties : une lame de microscope, une entretoise et une lamelle.
<ol><li>Placez l’entretoise en acier (56 x 56 x 0,5 mm3) sur la lame de microscope (60 x 60 x 1 mm3) et posez l’échantillon sur la lame de microscopie.</li>
	<li>Mettez soigneusement la lamelle de quartz (60 x 60 x 0,5 mm3), clipsez le tout ensemble et préparez une colle au silicone à deux composants dans un rapport de 1 :1. Utilisez une lamelle de quartz pour faire correspondre l’indice de réfraction et réduire l’aberration optique pendant le processus d’acquisition.</li>
	<li>À l’aide d’une seringue de 1 ml, remplissez l’espace entre l’entretoise et la lamelle avec une colle silicone à deux composants et laissez sécher pendant 10 min.</li>
	<li>Retirez les pinces et utilisez une petite aiguille pour remplir lentement tout le sandwich avec 68 % v/v TDE.</li>
	<li>Préparez de la colle fraîche et scellez le sandwich. REMARQUE : Si le TDE atteint accidentellement l’entretoise à l’étape 6.1, la colle ne durcira pas. Assurez-vous qu’aucune bulle d’air ne se forme à l’étape 6.2.</li>
</ol>7. Décapage
REMARQUE : La préservation structurelle et l’accessibilité améliorée des épitopes de SHORT permettent un marquage multi-tours des tranches en retirant les anticorps et en recolorant les échantillons avec d’autres marqueurs.
<ol><li>Ouvrez le sandwich à l’aide d’une lame, mettez les spécimens dans des plats neufs avec des couvercles à vis remplis de TDE à 30% v/v, et laissez-les pendant 3 h.</li>
	<li>Transférez les échantillons dans des tubes, lavez-les pendant 3 x 2 h dans 1x PBS (pH 7,4) à RT en agitant doucement et laissez le dernier lavage o/n.</li>
	<li>Placer les échantillons dans une solution claire au bain-marie à 80 °C pendant 4 h.</li>
	<li>Laver pendant 3 x 2 h dans 1x PBST (pH 7,4) à 37 °C en agitant doucement et laisser le dernier lavage o/n. L’échantillon est maintenant prêt à être étiqueté à nouveau à partir de l’étape 4.8. REMARQUE : Remplissez toujours le tube avec 50 mL de chaque solution. Utiliser 10 mL de solution de TDE pour chaque échantillon.</li>
</ol>

Reconstruction 3D haute résolution du cerveau humain avec SHORT et LSFM

<ol>
	<li>Costantini, I., Cicchi, R., Silvestri, L., Vanzi, F., Pavone, F. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In-vivo+and+ex-vivo+optical+clearing+methods+for+biological+tissues:+review.">In-vivo and ex-vivo optical clearing methods for biological tissues: review.</a> Biomedical Optics Express. 10 (10), 5251 (2019).</li><li>Richardson, D. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tissue+clearing.">Tissue clearing.</a> Nature Reviews Methods Primers. 1 (1), 84 (2021).</li><li>Ueda, H. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tissue+clearing+and+its+applications+in+neuroscience.">Tissue clearing and its applications in neuroscience.</a> Nature Reviews Neuroscience. 21 (2), 61-79 (2020).</li><li>Weiss, K. R., Voigt, F. F., Shepherd, D. P., Huisken, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tutorial:+practical+considerations+for+tissue+clearing+and+imaging.">Tutorial: practical considerations for tissue clearing and imaging.</a> Nature Protocols. 16 (6), 2732-2748 (2021).</li><li>Tainaka, K., Kuno, A., Kubota, S. I., Murakami, T., Ueda, H. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chemical+principles+in+tissue+clearing+and+staining+protocols+for+whole-body+cell+profiling.">Chemical principles in tissue clearing and staining protocols for whole-body cell profiling.</a> Annual Review of Cell and Developmental Biology. 32 (1), 713-741 (2016).</li><li>Renier, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=iDISCO:+A+simple,+rapid+method+to+immunolabel+large+tissue+samples+for+volume+imaging.">iDISCO: A simple, rapid method to immunolabel large tissue samples for volume imaging.</a> Cell. 159 (4), 896-910 (2014).</li><li>Pan, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Shrinkage-mediated+imaging+of+entire+organs+and+organisms+using+uDISCO.">Shrinkage-mediated imaging of entire organs and organisms using uDISCO.</a> Nature Methods. 13 (10), 859-867 (2016).</li><li>Lee, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ACT-PRESTO:+Rapid+and+consistent+tissue+clearing+and+labeling+method+for+3-dimensional+(3D)+imaging.">ACT-PRESTO: Rapid and consistent tissue clearing and labeling method for 3-dimensional (3D) imaging.</a> Scientific Reports. 6 (1), 18631 (2016).</li><li>Susaki, E. A., Ueda, H. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Whole-body+and+whole-organ+clearing+and+imaging+techniques+with+single-cell+resolution:+toward+organism-level+systems+biology+in+mammals.">Whole-body and whole-organ clearing and imaging techniques with single-cell resolution: toward organism-level systems biology in mammals.</a> Cell Chemical Biology. 23 (1), 137-157 (2016).</li><li>Lee, H., Park, J. -. H., Seo, I., Park, S. -. H., Kim, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Improved+application+of+the+electrophoretic+tissue+clearing+technology,+CLARITY,+to+intact+solid+organs+including+brain,+pancreas,+liver,+kidney,+lung,+and+intestine.">Improved application of the electrophoretic tissue clearing technology, CLARITY, to intact solid organs including brain, pancreas, liver, kidney, lung, and intestine.</a> BMC Developmental Biology. 14 (1), 48 (2014).</li><li>Murray, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Simple,+Scalable+proteomic+imaging+for+high-dimensional+profiling+of+intact+systems.">Simple, Scalable proteomic imaging for high-dimensional profiling of intact systems.</a> Cell. 163 (6), 1500-1514 (2015).</li><li>Cai, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Panoptic+imaging+of+transparent+mice+reveals+whole-body+neuronal+projections+and+skull-meninges+connections.">Panoptic imaging of transparent mice reveals whole-body neuronal projections and skull-meninges connections.</a> Nature Neuroscience. 22 (2), 317-327 (2019).</li><li>Ueda, H. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Whole-brain+profiling+of+cells+and+circuits+in+mammals+by+tissue+clearing+and+light-sheet+microscopy.">Whole-brain profiling of cells and circuits in mammals by tissue clearing and light-sheet microscopy.</a> Neuron. 106 (3), 369-387 (2020).</li><li>Costantini, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Large-scale,+cell-resolution+volumetric+mapping+allows+layer-specific+investigation+of+human+brain+cytoarchitecture.">Large-scale, cell-resolution volumetric mapping allows layer-specific investigation of human brain cytoarchitecture.</a> Biomedical Optics Express. 12 (6), 3684 (2021).</li><li>Lai, H. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Next+generation+histology+methods+for+three-dimensional+imaging+of+fresh+and+archival+human+brain+tissues.">Next generation histology methods for three-dimensional imaging of fresh and archival human brain tissues.</a> Nature Communications. 9 (1), 1066 (2018).</li><li>Zhao, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cellular+and+molecular+probing+of+intact+human+organs.">Cellular and molecular probing of intact human organs.</a> Cell. 180 (4), 796-812.e19 (2020).</li><li>Costantini, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Autofluorescence+enhancement+for+label-free+imaging+of+myelinated+fibers+in+mammalian+brains.">Autofluorescence enhancement for label-free imaging of myelinated fibers in mammalian brains.</a> Scientific Reports. 11 (1), 8038 (2021).</li><li>Pesce, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=3D+molecular+phenotyping+of+cleared+human+brain+tissues+with+light-sheet+fluorescence+microscopy.">3D molecular phenotyping of cleared human brain tissues with light-sheet fluorescence microscopy.</a> Communications Biology. 5 (1), 447 (2022).</li><li>Schueth, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Efficient+3D+light-sheet+imaging+of+very+large-scale+optically+cleared+human+brain+and+prostate+tissue+samples.">Efficient 3D light-sheet imaging of very large-scale optically cleared human brain and prostate tissue samples.</a> Communications Biology. 6 (1), 170 (2023).</li><li>Morawski, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Developing+3D+microscopy+with+CLARITY+on+human+brain+tissue:+Towards+a+tool+for+informing+and+validating+MRI-based+histology.">Developing 3D microscopy with CLARITY on human brain tissue: Towards a tool for informing and validating MRI-based histology.</a> NeuroImage. 182, 417-428 (2018).</li><li>Park, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Integrated+platform+for+multi-scale+molecular+imaging+and+phenotyping+of+the+human+brain.">Integrated platform for multi-scale molecular imaging and phenotyping of the human brain.</a> bioRxiv. , (2022).</li><li>Chung, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structural+and+molecular+interrogation+of+intact+biological+systems.">Structural and molecular interrogation of intact biological systems.</a> Nature. 497 (7449), 332-337 (2013).</li><li>Costantini, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+cellular+resolution+atlas+of+Broca's+area.">A cellular resolution atlas of Broca's area.</a> Science Advances. (9), eadg3844 (2023).</li><li>Scardigli, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparison+of+different+tissue+clearing+methods+for+three-dimensional+reconstruction+of+human+brain+cellular+anatomy+using+advanced+imaging+techniques.">Comparison of different tissue clearing methods for three-dimensional reconstruction of human brain cellular anatomy using advanced imaging techniques.</a> Frontiers in Neuroanatomy. 15, 752234 (2021).</li><li>Pesce, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Exploring+the+human+cerebral+cortex+using+confocal+microscopy.">Exploring the human cerebral cortex using confocal microscopy.</a> Progress in Biophysics and Molecular Biology. 168, 3-9 (2022).</li><li>Keller, P. J., Dodt, H. -. U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Light+sheet+microscopy+of+living+or+cleared+specimens.">Light sheet microscopy of living or cleared specimens.</a> Current Opinion in Neurobiology. 22 (1), 138-143 (2012).</li><li>Power, R. M., Huisken, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+guide+to+light-sheet+fluorescence+microscopy+for+multiscale+imaging.">A guide to light-sheet fluorescence microscopy for multiscale imaging.</a> Nature Methods. 14 (4), 360-373 (2017).</li><li>Belle, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tridimensional+visualization+and+analysis+of+early+human+development.">Tridimensional visualization and analysis of early human development.</a> Cell. 169 (1), 161-173.e12 (2017).</li><li>Sorelli, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fiber+enhancement+and+3D+orientation+analysis+in+label-free+two-photon+fluorescence+microscopy.">Fiber enhancement and 3D orientation analysis in label-free two-photon fluorescence microscopy.</a> Scientific Reports. 13 (1), 4160 (2023).</li><li>Helmchen, F., Denk, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Deep+tissue+two-photon+microscopy.">Deep tissue two-photon microscopy.</a> Nature Methods. 2 (12), 932-940 (2005).</li><li>Vieites-Prado, A., Renier, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tissue+clearing+and+3D+imaging+in+developmental+biology.">Tissue clearing and 3D imaging in developmental biology.</a> Development. 148 (18), dev199369 (2021).</li><li>Costantini, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Editorial:+The+human+brain+multiscale+imaging+challenge.">Editorial: The human brain multiscale imaging challenge.</a> Frontiers in Neuroanatomy. (16), 1060405 (2022).</li><li>Costantini, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+versatile+clearing+agent+for+multi-modal+brain+imaging.">A versatile clearing agent for multi-modal brain imaging.</a> Scientific Reports. 5 (1), 9808 (2015).</li></ol>

Les auteurs déclarent que la recherche a été menée en l’absence de toute relation commerciale ou financière qui pourrait être interprétée comme un conflit d’intérêts potentiel.

L’imagerie à haute résolution et la reconstruction 3D de grandes zones du cerveau humain nécessitent une coupe mécanique des tissus, suivie d’un nettoyage optique et d’un immunomarquage de tranches individuelles. Le protocole présenté ici décrit comment la méthode de transformation tissulaire SHORT peut être utilisée pour le traitement rapide et simultané de plusieurs coupes épaisses de cerveau humain pour la reconstruction cérébrale 3D avec une résolution subcellulaire avec LSFM.
<p class="jove_...

L’analyse de l’organisation moléculaire 3D et de la cytoarchitecture de grands volumes du cerveau humain nécessite une transparence optique des échantillons, obtenue grâce à des protocoles avec un temps de traitement important. Des techniques de clarification optique ont été développées pour minimiser l’hétérogénéité de l’indice de réfraction (IR) dans les tissus, réduisant ainsi la diffusion de la lumière et augmentant la profondeur de pénétration de la lumière pour l’imagerie haute résolution 1,2,3,4,5. Les progrès actuels dans les méthodes de nettoyage et de marquage des tissus profonds permettent l’imagerie volumétrique d’organes et d’embryons de rongeurs intacts en exploitant des techniques de microscopiede pointe 6,7,8,9,10,11,12.
Cependant, la reconstruction volumétrique 3D de grandes zones du cerveau humain post-mortem représente encore une tâche difficile par rapport aux organismes modèles. La composition biologique complexe et les conditions variables de fixation et de stockage post-mortem peuvent compromettre l’efficacité de l’élimination des tissus, la profondeur de pénétration des anticorps et la reconnaissance des épitopes 13,14,15,16,17,18,19. De plus, la section mécanique des tissus, ainsi que le nettoyage et l’étiquetage ultérieurs de chaque tranche, sont toujours nécessaires pour obtenir un nettoyage efficace et un marquage uniforme de grandes zones du cerveau humain, ce qui entraîne de longs temps de traitement et la nécessité d’un équipement personnalisé sophistiqué, par rapport aux organismes modèles 15,20,21,22.
La technique de transformation tissulaire S WITCH - H2O2 - antigène Retrieval -TDE (SHORT) a été développée spécifiquement pour analyser de grands volumes du cerveau humain18,23. Cette méthode utilise la préservation structurelle tissulaire du protocole SWITCH11 et des concentrations élevées de peroxyde d’hydrogène pour diminuer l’autofluorescence tissulaire, en combinaison avec la restauration d’épitopes. SHORT permet une coloration uniforme des tranches de cerveau humain avec des marqueurs pour différents sous-types neuronaux, cellules gliales, vascularisation et fibres myélinisées18,24. Ses résultats sont compatibles avec l’analyse des protéines de basse et de haute densité. Les niveaux élevés de transparence et l’uniformité du marquage qui en résultent permettent la reconstruction volumétrique de tranches épaisses par microscopie à fluorescence, en particulier pour l’acquisition rapide d’appareils à nappe de lumière pouvant être utilisés 18,24,25,26,27.
Dans ce travail, nous décrivons comment la technique de transformation tissulaire SHORT peut être utilisée pour le nettoyage simultané et le marquage multi-tours de dizaines de sections de cerveau humain fixées au formol. Quatre marqueurs fluorescents différents peuvent être utilisés ensemble, ce qui permet d’identifier différentes sous-populations cellulaires. Après le nettoyage, l’imagerie volumétrique à haute résolution peut être réalisée par microscopie à fluorescence. Ici, nous avons utilisé un LSFM inversé 18,24,25,26,27 sur mesure, qui permet une coupe optique rapide de l’échantillon et une acquisition rapide de plusieurs canaux en parallèle. Avec ce protocole à haut débit de routine, il est possible d’obtenir une caractérisation cellulaire et structurale complète avec une résolution subcellulaire de grandes zones du cerveau humain, comme cela a déjà été démontré dans la cartographie de l’ensemble de l’aire de Broca23.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>2,2&#39;-thiodiethanol</td>
			<td>Merck Life Science S.R.L.</td>
			<td>166782</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acetamide &#62;= 99.0% (GC)</td>
			<td>Merck Life Science S.R.L.</td>
			<td>160</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agarose High EEO</td>
			<td>Merck Life Science S.R.L.</td>
			<td>A9793</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Boric Acid</td>
			<td>Merck Life Science S.R.L.</td>
			<td>B7901</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Compressome VF-900-0Z Microtome</td>
			<td>Precisionary</td>
			<td>/</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Coverslips</td>
			<td>LaserOptex</td>
			<td>/</td>
			<td>customized</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethylenediaminetetraacetic acid disodium salt dihydrate</td>
			<td>Merck Life Science S.R.L.</td>
			<td>E5134</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glutaraldehyde</td>
			<td>Merck Life Science S.R.L.</td>
			<td>G7651</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycine</td>
			<td>Santa Cruz Biotechnology</td>
			<td>SC_29096</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hydrogen Peroxide 30%</td>
			<td>Merck Life Science S.R.L.</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Incubator ISS-4075</td>
			<td>Lab companion&#160;</td>
			<td>/</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Light-sheet fluorescence microscopy (LSFM)</td>
			<td>/</td>
			<td>/</td>
			<td>custom-made</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Loctite Attak</td>
			<td>Henkel Italia srl</td>
			<td>/</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope slides</td>
			<td>Laborchimica</td>
			<td>/</td>
			<td>customized</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phospate buffer saline tablet</td>
			<td>Merck Life Science S.R.L.</td>
			<td>P4417</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Picodent Twinsil</td>
			<td>Picodent</td>
			<td>13005002</td>
			<td>out of production</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium Hydrogen Phtalate</td>
			<td>Merck Life Science S.R.L.</td>
			<td>P1088</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Azide</td>
			<td>Merck Life Science S.R.L.</td>
			<td>S2002</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Dodecyl Sulfate</td>
			<td>Merck Life Science S.R.L.</td>
			<td>L3771</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Sulfite</td>
			<td>Merck Life Science S.R.L.</td>
			<td>S0505</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Spacers</td>
			<td>Microlaser srl</td>
			<td></td>
			<td>customized</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sputum Containers (dishes with screw lids)</td>
			<td>Paul Boettger GmbH &#38; Co. KG</td>
			<td>07.061.2000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris Base</td>
			<td>PanReac AppliChem (ITW reagents)</td>
			<td>A4577,0500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton X-100</td>
			<td>Merck Life Science S.R.L.</td>
			<td>T8787</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tubes</td>
			<td>Sarstedt</td>
			<td>62 547254</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tween 20</td>
			<td>Merck Life Science S.R.L.</td>
			<td>P9416</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vibratome VT1000S</td>
			<td>Leica Biosystem</td>
			<td>/</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Water bath&#160;</td>
			<td>Memmert</td>
			<td>WNB 7-45</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Antibodies and Dyes</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa Fluor 488 AffiniPure Alpaca Anti-Rabbit IgG (H+L)</td>
			<td>Jackson Immuno Reasearch</td>
			<td>611-545-215</td>
			<td>Dilution used, 1:200</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa Fluor 488 AffiniPure Bovine Anti-Goat IgG (H+L)</td>
			<td>Jackson Immuno Reasearch</td>
			<td>805-545-180</td>
			<td>Dilution used, 1:200</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa Fluor 647 AffiniPure Alpaca Anti-Rabbit IgG (H+L)</td>
			<td>Jackson Immuno Reasearch</td>
			<td>611-605-215</td>
			<td>Dilution used, 1:200</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-NeuN Antibody</td>
			<td>Merck Life Science S.R.L.</td>
			<td>ABN91</td>
			<td>Dilution used, 1:100</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-Parvalbumin antibody (PV)</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab32895</td>
			<td>Dilution used, 1:200</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-Vimentin antibody [V9] - Cytoskeleton Marker (VIM)</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab8069</td>
			<td>Dilution used, 1:200</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Calretinin Polyclonal antibody</td>
			<td>ProteinTech</td>
			<td>12278_1_AP</td>
			<td>Dilution used, 1:200</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DAPI</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>D3571</td>
			<td>Dilution used, 1:100</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Donkey Anti-Mouse IgG H&#38;L (Alexa Fluor 568)</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab175700</td>
			<td>Dilution used, 1:200</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Donkey Anti-Mouse IgG H&#38;L (Alexa Fluor 647)</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab150107</td>
			<td>Dilution used, 1:200</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Donkey Anti-Rabbit IgG H&#38;L (Alexa Fluor 568)</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab175470</td>
			<td>Dilution used, 1:200</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Donkey Anti-Rat IgG H&#38;L (Alexa Fluor 568) preadsorbed</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab175475</td>
			<td>Dilution used, 1:200</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat Anti-Chicken IgY H&#38;L (Alexa Fluor 488)</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab150169</td>
			<td>Dilution used, 1:500</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat Anti-Chicken IgY H&#38;L (Alexa Fluor 568)</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab175711</td>
			<td>Dilution used, 1:500</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat Anti-Chicken IgY H&#38;L (Alexa Fluor 647)</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab150171</td>
			<td>Dilution used, 1:500</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat Anti-Rabbit IgG H&#38;L (Alexa Fluor 488)</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab150077</td>
			<td>Dilution used, 1:200</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Recombinant Alexa Fluor 488 Anti-GFAP antibody</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab194324</td>
			<td>Dilution used, 1:200</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Somatostatin Antibody YC7</td>
			<td>Santa Cruz Biotechnology</td>
			<td>sc-47706</td>
			<td>Dilution used, 1:200</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vasoactive intestinal peptide (VIP)</td>
			<td>ProteinTech</td>
			<td>16233-1-AP</td>
			<td>Dilution used, 1:200</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

optical clearing and labeling for light-sheet fluorescence microscopy in large-scale human brain imaging

Malgré les nombreuses techniques de nettoyage qui ont émergé au cours de la dernière décennie, le traitement des cerveaux humains post-mortem reste une tâche difficile en raison de ses dimensions et de sa complexité, qui rendent l’imagerie à résolution micrométrique particulièrement difficile. Cet article présente un protocole permettant d’effectuer la reconstruction de portions volumétriques du cerveau humain en traitant simultanément des dizaines de coupes avec le protocole de transformation tissulaire SHORT (SWITCH - H2O2 - Antigen Retrieval - 2,2'-thiodiéthanol [TDE]), qui permet l’élimination, le marquage et l’imagerie séquentielle des échantillons par microscopie à fluorescence à feuille de lumière (LSFM). SHORT permet un nettoyage rapide des tissus et un multi-marquage homogène de tranches épaisses avec plusieurs marqueurs neuronaux, permettant l’identification de différentes sous-populations neuronales dans la matière blanche et grise. Après le déblaiement, les tranches sont imagées via LSFM avec une résolution micrométrique et dans plusieurs canaux simultanément pour une reconstruction 3D rapide. En combinant l’analyse SHORT et LSFM dans le cadre d’un protocole de routine à haut débit, il est possible d’obtenir la reconstruction 3D de la cytoarchitecture de grandes surfaces volumétriques à haute résolution en peu de temps, permettant ainsi une caractérisation structurelle complète du cerveau humain.

Analyzing the 3D molecular organization and cytoarchitecture of large volumes of the human brain requires optical transparency of specimens, achieved through protocols with extensive processing time. Optical clearing techniques were developed to minimize heterogeneity in refractive index (RI) within the tissues, thereby reducing light scattering and increasing the light penetration depth for high-resolution imaging1,2,3,4,5. Current advances in clearing and deep tissue-labeling methods allow volumetric imaging of intact rodent organs and embryos by exploiting cutting-edge microscopy techniques6,7,8,9,10,11,12.
However, volumetric 3D reconstruction of large areas of the postmortem human brain still represents a challenging task compared with model organisms. The complex biological composition and the variable postmortem fixation and storage conditions can compromise the tissue clearing efficiency, the antibody penetration depth, and the epitope recognition13,14,15,16,17,18,19. Moreover, mechanical tissue sectioning and subsequent clearing and labeling of each slice is still required to achieve an efficient clearing and uniform labeling of large human brain areas, resulting in long processing times and the need for sophisticated custom equipment,&#160;compared with model organisms15,20,21,22.
The SWITCH - H2O2 - antigen Retrieval -TDE (SHORT) tissue transformation technique has been developed specifically to analyze large volumes of the human brain18,23. This method employs the tissue structural preservation of the SWITCH protocol11 and high concentrations of peroxide hydrogen to decrease tissue autofluorescence, in combination with epitope restoration. SHORT allows uniform staining of human brain slices with markers for different neuronal subtypes, glial cells, vasculature, and myelinated fibers18,24. Its results are compatible with the analysis of both low- and high-density proteins. The resulting high transparency levels and uniform labeling enable volumetric reconstruction of thick slices with fluorescence microscopy, in particular, for fast acquisition light-sheet apparatus can be used18,24,25,26,27.
In this work, we describe how the SHORT tissue transformation technique can be used for simultaneous clearing and multi-round labeling of tens of formalin-fixed human brain sections. Four different fluorescent markers can be used together, leading to the identification of different cellular sub-populations. After clearing, high-resolution volumetric imaging can be performed with fluorescence microscopy. Here, we used a custom-made inverted LSFM18,24,25,26,27, which enables fast optical sectioning of the sample and rapid acquisition of multiple channels in parallel. With this routinely high-throughput protocol, it is possible to obtain a comprehensive cellular and structural characterization with a sub-cellular resolution of large areas of the human brain as already demonstrated in the mapping of an entire Broca&#39;s area23.

Pleins feux sur l’auteur : Faire progresser l’analyse de la cytoarchitecture 3D - Reconstruction volumétrique rapide du cerveau humain 

Clarification optique et marquage pour la microscopie à fluorescence à nappe de lumière dans l’imagerie cérébrale humaine à grande échelle

Le protocole décrit ici permet le traitement simultané de plusieurs tranches, d’une épaisseur allant de 100 μm à 500 μm, en utilisant la méthode SHORT. Cette approche réduit considérablement le temps de traitement global de l’ensemble de la procédure. Dans ce travail, nous fournissons une description complète de l’ensemble du pipeline (Figure 1) pour le traitement simultané de plusieurs coupes épaisses de cerveau humain post-mortem et nous démontrons le protocole sur 24 c...

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Le présent protocole fournit une procédure étape par étape pour l’effacement optique rapide et simultané, le marquage multi-rond et la reconstruction volumétrique 3D de dizaines de coupes de cerveau humain post-mortem en combinant la technique de transformation tissulaire courte (S WITCH - H 2O2 - Antigène Retrieval - 2,2'-thiodiéthanol [TDE]) avec l’imagerie par microscopie à fluorescence à feuille de lumière dans un protocole de routine à haut débit.

Despite the numerous clearing techniques that emerged in the last decade, processing postmortem human brains remains a challenging task due to its ...

Le cerveau humain est un organe complexe qui englobe différentes compétences. Pour comprendre sa fonctionnalité, il est essentiel de construire des capteurs cellulaires détaillés dans l’ensemble du cerveau. Notre protocole de routine à haut débit permet l’analyse de la cytoarchitecture 3D de zones volumétriques du cerveau humain avec une résolution micrométrique, permettant ainsi sa caractérisation structurale.La reconstruction volumétrique de grandes zones du cerveau humain présente plusieurs défis expérimentaux liés aux dimensions massives des échantillons de cerveau, à la composition biologique complexe, aux conditions variables de fixation et de stockage post-mortem, et aux signaux autofluorescents des pigments de type lipofuscine. Tous ces éléments peuvent compromettre l’efficacité de la compensation optique et démontrer la qualité. Par rapport à d’autres techniques de nettoyage, la méthode de transformation tissulaire courte combinée à l’imagerie par microscopie à feuille de lumière peut être utilisée pour le traitement rapide et simultané de plusieurs sections du cerveau humain.Il en résulte une reconstruction cérébrale 3D avec une résolution subcellulaire.

optical-clearing-labeling-for-light-sheet-fluorescence-microscopy

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Optical Clearing and Labeling for Light-sheet Fluorescence Microscopy in Large-scale Human Brain Imaging

1.4K vues.  University of Florence. Le cerveau humain est un organe complexe qui englobe différentes compétences. Pour comprendre sa fonctionnalité, il est essentiel de construire des capteurs cellulaires détaillés dans l’ensemble du cerveau. Notre protocole de routine à haut débit permet l’analyse de la cytoarchitecture 3D de zones volumétriques du cerveau humain avec une résolution micrométrique, permettant ainsi sa caractérisation structurale.La reconstruction volumétrique de grandes zones du cerveau h...

Vidéo: Pleins feux sur l’auteur : Faire progresser l’analyse de la cytoarchitecture 3D - Reconstruction volumétrique rapide du cerveau humain 

Despite the numerous clearing techniques that emerged in the last decade, processing postmortem human brains remains a challenging task due to its dimensions and complexity, which make imaging with micrometer resolution particularly difficult. This paper presents a protocol to perform the reconstruction of volumetric portions of the human brain by simultaneously processing tens of sections with the SHORT (SWITCH - H2O2 - Antigen Retrieval - 2,2'-thiodiethanol [TDE]) tissue transformation protocol, which enables clearing, labeling, and sequential imaging of the samples with light-sheet fluorescence microscopy (LSFM). SHORT provides rapid tissue clearing and homogeneous multi-labeling of thick slices with several neuronal markers, enabling the identification of different neuronal subpopulations in both white and grey matter. After clearing, the slices are imaged via LSFM with micrometer resolution and in multiple channels simultaneously for a rapid 3D reconstruction. By combining SHORT with LSFM analysis within a routinely high-throughput protocol, it is possible to obtain the 3D cytoarchitecture reconstruction of large volumetric areas at high resolution in a short time, thus enabling comprehensive structural characterization of the human brain.

The present protocol provides a step-by-step procedure for rapid and simultaneous optical clearing, muti-round labeling, and 3D volumetric reconstruction of tens of postmortem human brain sections by combining the (SWITCH - H2O2 - Antigen Retrieval - 2,2'-thiodiethanol [TDE]) SHORT tissue transformation technique with light-sheet fluorescence microscopy imaging in a routinely high-throughput protocol.